阅读说明：本技术 与洛铂有关物质的检测 (Detection of lobaplatin-related substances ) 是由 窦啟玲 汪立冬 常新亮 于 2019-03-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及与洛铂有关物质的检测。本发明提供了与洛铂有关物质的检测方法,所述与洛铂有关物质为化合物J,其结构式为<Image he="194" wi="678" file="DDA0001999851310000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>所述检测方法为HPLC-MS法或者HPLC法,所述HPLC-MS法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,以18-22mmol/L的甲酸铵为流动相A,甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B,进行梯度洗脱。该检测方法的灵敏度高,专属性强,重复性好,准确度高。(The invention relates to detection of substances related to lobaplatin. The invention provides a method for detecting a lobaplatin related substance, wherein the lobaplatin related substance is a compound J, and the structural formula of the lobaplatin related substance is shown in the specification The detection method is an HPLC-MS method or an HPLC method, and the detection conditions of the HPLC-MS method are as follows: octadecylsilane chemically bonded silica is used as a filling agent, 18-22mmol/L ammonium formate is used as a mobile phase A, and methanol: acetonitrile with volume ratio of 1 (0.8-1.2) as mobile phase B, and gradient elution is carried out. The detection method has the advantages of high sensitivity, strong specificity, good repeatability and high accuracy.)

与洛铂有关物质的检测

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及一种与洛铂有关物质的检测方法，属于药物分析质量控制技术领域。

背景技术

洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸-O1,O2]-铂(II)，分子式为C₉H₁₈N₂O₃Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(a)所示：

洛铂具有烷化作用，属烷化剂(广义)，具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135-瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，在体小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。

发明内容

为了保证该药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。

本发明要解决的技术问题是提供一种新的检测方法以建立针对洛铂中有关物质的检测，从而对洛铂化合物进行质量控制。

本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关的物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。

具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。

本发明提供了一种与洛铂有关物质的检测方法，其中，所述与洛铂有关物质为化合物J，所述化合物J的结构为

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物J经过如下结构式的化合物(2)或化合物(3)或化合物(4)制备得到

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物J的原料为化合物(1)

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物J通过下述的方法制备得到：

其中，在化合物1制备化合物2的反应中，将化合物1、氯亚铂酸盐或氯亚铂酸盐和碱金属碘化物、和氢氧化物反应制得化合物2；优选的是，所述氯亚铂酸盐选自氯亚铂酸钾或氯亚铂酸钠，优选氯亚铂酸钾；优选的是，所述碱金属碘化物选自碘化钾或碘化钠，优选碘化钾；优选的是，所述氢氧化物选自氢氧化钾或氢氧化钠，优选氢氧化钾；

和/或，通过化合物2制备化合物3的反应中，将化合物2加入水和酮类溶剂中，得到A料，然后将硝酸银溶液加入A料中进行反应，过滤得到化合物3的溶液；

和/或，通过化合物3制备化合物4的反应中，将所述化合物3的溶液和树脂混合搅拌，然后过滤得化合物4溶液；

和/或，通过化合物4制备产品的反应中，用酸性调节剂将得到的化合物4的溶液调节至偏碱性，然后冻干得最终产品。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，在化合物1制备化合物2的反应步骤中，将化合物1和氢氧化钾的水溶液混合得到F液，将氯亚铂酸钾和碘化钾的水溶液混合得到E液，将F液和E液混合反应得到化合物2；优选的是，反应温度为25-35℃，优选30℃；优选的是，反应时间为1-3小时，优选反应2小时；优选的是，化合物1和氯亚铂酸盐的摩尔比为1:0.5-2，优选为1：0.85；

优选的，在化合物2制备化合物3的反应步骤中，化合物2与硝酸银的摩尔比为1:(1-2)，优选为1：1.7；优选的，反应温度为25-35℃；较优选的，反应温度为30℃；优选的，避光反应时间为15-20小时；较优选的，避光反应时间为18小时；优选的，所述酮类溶剂选自于丙酮、甲基丁酮、甲基乙基酮或甲基异丁酮中的一种，较优选为丙酮；

优选的，通过化合物3制备化合物4的反应中，所述化合物3溶液和树脂的混合搅拌的温度为25-35℃；优选的，搅拌的时间为0.5-2小时，优选搅拌的时间为1小时，较优选搅拌的温度为30℃；优选的，所述树脂为已经处理的树脂；优选的，所述已经处理的树脂是经氢氧化钠水溶液处理的树脂，优选氢氧化钠水溶液的浓度为1-2mol/L，较优选为1.5mol/L；

优选的，通过化合物4制备产品的反应中，所述酸性调节剂选自于对甲苯磺酸或甲磺酸中的一种，优选为对甲苯磺酸；优选的，所述对甲苯磺酸的水溶液的浓度为5-15wt％，优选为10wt％；所述偏碱性为pH＝7-8；优选的，在调节至偏碱性之后，在温度为20-30℃下反应15-25小时；优选地，25℃反应20小时。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述检测方法为HPLC-MS法或HPLC法。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述HPLC-MS法的HPLC检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以18-22mmol/L的甲酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；优选的，流动相A为20mmol/L的甲酸铵溶液，流动相B为甲醇：乙腈的体积比例＝1:1。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述HPLC-MS法中的梯度洗脱方式如下：

0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

3～10分钟：流动相A从97体积％减少到92体积％，流动相B从3体积％增加到8体积％；

10～18分钟：流动相A从92体积％减少到87体积％，流动相B从8体积％增加到13体积％；

18～25分钟：流动相A从87体积％减少到10体积％，流动相B从13体积％增加到90体积％；

25～26分钟：流动相A从10体积％增加到97体积％，流动相B从90体积％减少到3体积％；

26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

其中，上述梯度洗脱的每段时间范围可以均增加1～2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1～2分钟。

例如，梯度洗脱对应的时间范围可以为0～4分钟(或0～5分钟)、4～11分钟(或5～12分钟)、11～19分钟(或12～20分钟)、19～26分钟(或20～27分钟)、26～27分钟(或27～28分钟)、27～35分钟(或28～36分钟)；也可以设为0～3分钟、3～9分钟(或3～8分钟)、9～17分钟(或8～16分钟)、17～24分钟(或16～23分钟)、24～25分钟(或23～24分钟)、25～33分钟(或24～32分钟)。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述HPLC-MS中的MS条件为采用电喷雾离子源，正离子检测法检测化合物的m/z为326。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述流速为每分钟0.8-1.2ml，优选为1.0ml；柱温为39-41℃，优选为40℃。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，在系统适用性试验溶液的色谱图中，所述洛铂中化合物J与其相邻的有关物质的峰的分离度不小于1.5。

对于上述所述的检测方法，其中，在供试品溶液色谱图中如有化合物J，所述洛铂中化合物J的峰面积不得大于对照品溶液的化合物J的峰面积。

对于上述所述的检测方法，其中，所述洛铂包括洛铂非对映体Ⅰ和洛铂非对映体Ⅱ的任一种或两种。

本发明提供了一种含有有关物质的药物组合物，所述药物组合物为药物制剂；优选的，所述药物组合物为注射用药物制剂。

优选的，对于上述所述的药物组合物，其中，所述药物制剂包括辅料，优选的，所述辅料选自填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂和基质中的一种或两种以上；较优选的，所述辅料为填充剂和/或抗氧化剂。

本发明提供了一种上述所述的有关物质或上述所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

优选的，对于上述所述的应用，其中，所述肿瘤为肺癌、卵巢癌、白血病和/或肾癌细胞；进一步优选的，所述肿瘤为白血病细胞。

优选的，对于上述所述的应用，其中，所述的有关物质或上述所述的药物组合物在制备抗THP-1肿瘤药物中的应用。

为使本发明所述组合物中的制剂能够实现，可在制备这些制剂时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括：淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；抗氧化剂包括：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酚、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、叔丁基对羟基茴香醚、硫脲、维生素c、没食子酸丙酯、α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯；基质包括：PEG6000，PEG4000，虫蜡等。因此在本发明化合物的基础上加入任何其他的有助于形成稳定地发挥药效的其他物质的都是本发明的保护范围。

本发明的有益效果如下：

本发明建立了将具有结构式(J)的铂类化合物作为洛铂质量标准中的有关物质进行检测的方法，以建立洛铂质量检测体系，该方法灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高。

附图说明

图1-1A是实施1-1所制备得到的化合物在HPLC-MS结构确认检测中的HPLC色谱图(215nm)；

图1-1B是实施1-1所制备得到的化合物在HPLC-MS结构确认检测中的HPLC色谱图(210nm)；

图1-2A是实施例1-1所制备得到的化合物在HPLC-MS结构确认检测中时间为0.13min时的MS图谱；

图1-2B是实施例1-1所制备得到的化合物在HPLC-MS结构确认检测中时间为0.249min时的MS图谱；

图2是实施例1-1所制备得到的化合物的¹H-NMR图谱；

图3是实施例1-1所制备得到的化合物的¹³C-NMR图谱；

图4是实施例1-1所制备得到的化合物的QNMR图谱；

图5是实施例1-1所制备得到的化合物的UV图谱；其中，图中峰1的波长为256.5nm，吸收率为0.7763，峰2的波长为226.5nm，吸收率为0.3026，峰3的波长为218.5nm，吸收率为0.2872，峰4的波长为382.0nm，吸收率为0.0038，峰5的波长为229.0nm，吸收率为0.2932，以及峰6的波长为220.5nm，吸收率为0.2746；

图6是实施例1-1所制备得到的化合物的IR图谱；

图7是实施例1-1所制备得到的化合物的DSC图谱；

图8是实施例2中实施例1-1所制备得到的化合物的典型谱图；

图9-1A是方法学验证专属性实验中空白溶剂的总离子色谱图；

图9-1B是方法学验证专属性实验中空白溶剂的MS谱图；

图9-2A是方法学验证专属性实验中洛铂中有关物质J-定位溶液(STD)的总离子色谱图；

图9-2B是方法学验证专属性实验中洛铂中有关物质J-定位溶液(STD)在t＝16.174min的MS谱图；

图9-3A是方法学验证专属性实验中供试品溶液洛铂非对映体Ⅰ和洛铂非对映体Ⅱ的HPLC色谱图(235nm)；

图9-3B是方法学验证专属性实验中供试品溶液的总离子色谱图；

图9-3C是方法学验证专属性实验中供试品溶液在t＝16.329min的MS谱图；

图9-4A是方法学验证专属性实验中供试品加标溶液的总离子色谱图；

图9-4B是方法学验证专属性实验中供试品加标溶液在t＝16.174min的MS谱谱图；

图10是方法学验证中的洛铂中有关物质J的线性关系示意图；

图11-1是实施例3中实施例1-1所制备得到的化合物对肺癌细胞NCI-H460的抑制活性示意图；

图11-2是实施例3中阳性对照药对肺癌细胞NCI-H460的抑制活性示意图；

图12-1是实施例3中实施例1-1所制备得到的化合物对卵巢癌细胞SK-OV-3的抑制活性示意图；

图12-2是实施例3中阳性对照药对卵巢癌细胞SK-OV-3的抑制活性示意图；

图13-1是实施例3中实施例1-1所制备得到的化合物对白血病细胞Jurkat CloneE6-1的抑制活性示意图；

图13-2是实施例3中阳性对照药对白血病细胞Jurkat Clone E6-1的抑制活性示意图；

图14-1是实施例3中实施例1-1所制备得到的化合物对白血病细胞THP-1的抑制活性示意图；

图14-2是实施例3中阳性对照药对白血病细胞THP-1的抑制活性示意图；

图15-1是实施例3中实施例1-1所制备得到的化合物对肾癌细胞SK-NEP-1的抑制活性示意图；

图15-2是实施例3中阳性对照药对肾癌细胞SK-NEP-1的抑制活性示意图。

具体实施方式

本发明提供一种与洛铂有关物质的检测方法。下面将通过化合物制备，化合物结构确认和化合物的抗肿瘤活性测定以及作为洛铂质量的检测方法等作为具体实施例进行说明。

其中，在本发明中，任何影响药物纯度的物质统称为“影响洛铂质量的有关物质”或者“影响质量的有关物质”，简称“有关物质”，例如在检测洛铂质量的HPLC色谱峰中出现的影响洛铂质量的有关物质峰，简称为“有关物质峰”；本发明中的所述“有关物质”有些情况下即是本领域技术人员公知的影响药物纯度的“杂质”，然而，在本发明中所述”有关物质”不限于“杂质”的范畴，还包括具有一定抗癌活性甚至其活性高于洛铂的物质，他们相对于活性分子“洛铂”而言属于与洛铂相关的物质范畴，其抗癌活性或者其他的研发新药物方面积极的作用和功能的原理尚未完全研究清楚。

本发明提供了一种与洛铂有关物质的检测方法，所述与洛铂有关物质为化合物J，所述化合物J的结构为

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物J经过如下结构式的化合物(2)或化合物(3)或化合物(4)制备得到

优选的，所述式(J)化合物经过如下结构式的化合物4制备得到

优选的，通过化合物4制备产品的反应中，用酸性调节剂将得到的化合物4的溶液调节至偏碱性，然后冻干得最终产品；优选的，所述酸性调节剂选自于对甲苯磺酸或甲磺酸中的一种，优选为对甲苯磺酸；优选的所述对甲苯磺酸的水溶液的浓度为5-15wt％，优选为10wt％；所述偏碱性为pH＝7-8；优选的，在调节至偏碱性之后，在温度为20-30℃下反应15-25小时；优选地，25℃反应20小时；

优选的，所述化合物4经过如下结构式的化合物3制备得到

优选的，将所述化合物3的溶液和树脂混合搅拌，然后过滤得化合物4溶液；优选的，所述化合物3溶液和树脂的混合搅拌的温度为25-35℃；优选的，搅拌的时间为0.5-2小时；优选搅拌的时间为1小时，较优选搅拌的温度为30℃；较优选的，所述树脂为已经处理的树脂；优选的，所已经处理的树脂是经氢氧化钠水溶液处理的树脂，优选氢氧化钠水溶液的浓度为1-2mol/L，优选为1.5mol/L。

优选的，所述化合物3经过如下结构式的化合物2制备得到

优选的，将化合物2加入水和酮类溶剂中，得到A料，然后将硝酸银溶液加入A料中进行反应，过滤得到化合物3的溶液；优选的，化合物2与硝酸银的摩尔比为1:(1-2)，优选为1：1.7；优选的，反应温度为25-35℃；较优选的，反应温度为30℃；优选的，避光反应时间为15-20小时；较优选的，避光反应时间为18小时；优选的，所述酮类溶剂选自于丙酮、甲基丁酮、甲基乙基酮或甲基异丁酮中的一种，较优选为丙酮。

在本发明优选的一种具体实施方式中，所述化合物J的原料为化合物(1)

在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述检测方法为HPLC-MS法或者HPLC法；优选的，所述HPLC-MS法的HPLC检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以浓度为18-22mmol/L的甲酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，优选为甲醇：乙腈的体积比例＝1:1为流动相B，进行梯度洗脱；优选的，所述流速为每分钟0.8-1.2ml，优选为1.0ml；柱温为39-41℃，优选为40℃。

优选的，系统适用性试验的色谱图中，化合物J的峰与相邻有关物质的峰的分离度不小于1.5；优选的，系统适用性试验溶液连续进样6次，化合物J峰面积的相对标准偏差应不大于10％。

优选的，供试品溶液色谱图中如有化合物J，其峰面积不得大于对照品溶液的化合物J的峰面积(0.5％)，所述的0.5％指的是对照品溶液中化合物J的浓度为供试品溶液的0.5％。

已知洛铂有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：

洛铂非对映体I(简称RRS)：

洛铂非对映体II(简称SSS)：

实施例中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别，其中，化合物1是根据专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并且经过结构鉴定确认得到。

氯亚铂酸钾购自上海久岳化工有限公司；

碘化钾购自广州化学试剂厂，为分析纯。

实施例1-1化合物的制备

具体制备方法如下：

1)制备化合物2

ⅰ.将化合物1(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。

ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。

ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。

ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。

ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌2小时。

ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mL*6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物2(35g)为黄色粉末。

2)制备化合物3

将化合物2(8.0g,14.2mmol)分散至纯化水(33.6mL)和丙酮(4.8mL)中，得A料，将硝酸银(4.13g,24.3mmol)溶于纯化水(12.8mL)，加至A料,30℃避光搅拌18小时，过滤，滤饼用水洗涤6次(20mL*3)，合并滤液得化合物3的溶液110mL直接用于下一步；

3)制备化合物4

用1.5mol/L氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g,购自三菱化学株式会社，型号为DIAION SA10AX)，处理三遍；取110mL化合物3的溶液和处理过的树脂(32g)置于三口烧瓶中，30℃搅拌1小时；过滤，树脂用纯化水洗涤(25mL*3)，合并洗液及滤液得化合物4(185mL)的溶液直接用于下一步；

4)制备产品

将化合物4的溶液用10wt％的对甲苯磺酸水溶液调pH＝7-8后25℃搅拌20小时，然后冻干得到产品，取样检测LCMS、¹³CNMR,¹HNMR和Q NMR。

对制备获得产物进行结构确认

1)HPLC-MS:

仪器型号为Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(AgilentZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃。

表1洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(ml/min)
				0.00	10	90	1.2
1.50	10	90	1.2

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

其结果为：

表2测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			651.2	[M’+H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰

M’为化合物的分子量

检测结果见附图1-1A、1-1B、1-2A和1-2B所示，可以看出，该化合物为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt、¹⁹⁵Pt、¹⁹⁶Pt，因此在样品的LCMS中，在651.2左右出现[M’+H]+峰是样品准分子离子峰，对应于化合物J(C₁₂H₂₈N₄O₂Pt₂)的分子量为650.54，质谱信息与的化合物J(C₁₂H₂₈N₄O₂Pt₂)分子结构相符。

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹HNMR DMSO 400MHz)的化学位移及归属如下：

表3氢谱化学位移

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.60	s	4	8,8’
1.91	s	4	1,1’
				2.15-2.50	m	8	2,2’,7,7’,13
2.63-2.78	m	8	3,3’,6,6’
				4.95-5.34	m	8	4,4’,5,5’(活泼氢)
7.15-7.17	m	3	11,11’
				7.53-7.55	m	3	10,10’

谱图见附图2，可以看出，该化合物含有4个活泼氢和24个非活泼氢，样品氢谱数据与化合物J的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³NMR DMSO 400MHz)的化学位移及归属如下：

表4碳谱化学位移

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.08-20.78	伯碳	1	13
22.27	仲碳	4	1,1’,8,8’
				49.35-50.26	仲碳	4	3,3’,6,6’
125.46	叔碳	2	10,10’
				130.71	叔碳	2	11,11’
138.02	季碳	1	12
				145.09	季碳	1	9

谱图见附图3，可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有1个饱和伯碳峰、8个饱和仲碳峰、4个不饱和叔碳峰和2个不饱和季碳峰，这与所示化合物J的分子结构基本相符(其中有4个饱和叔碳峰与溶剂峰重叠)。

4)QNMR：

其是采用BrukerAVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为DMSO，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8％)，测定结果如下：

表5测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

谱图见附图4，从上表中可以看出，其标定含量为68.2％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图5。

从图5可以看出，化合物J在波长为265.5nm处有最大紫外吸收。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下：

表6测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3437.91,3232.25	νNH	氨基N-H伸缩振动
2938.63	νCH	烷基C-H伸缩振动
			1617.82	νC＝O	羰基C＝O伸缩振动
1457.07	νC＝C	芳环C＝C伸缩振动
			1207.09	νsO<sub>2</sub>	璜酰基德不对称伸缩振动
1126.20	νsO<sub>2</sub>	璜酰基德对称伸缩振动
			1036.29	νC-O	C-O键的伸缩振动
1011.70	νC-N	C-N键的伸缩振动
			569.03	δSO<sub>2</sub>	SO2的面内剪式弯曲振动

图谱见附图6。

7)旋光度(OR)

旋光仪：Anton PaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水),25℃，结果如下：

表7测定结果

8)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃图谱见附图7。

从图7可以看出，化合物J的对甲苯磺酸盐从153.28℃起开始分解了。

通过上述图谱确认了本发明的化合物J的对甲苯酸盐结构为

实施例1-2化合物的制备

1)制备化合物2

ⅰ.将化合物1(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。

ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。

ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。

ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。

ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在25℃下搅拌3小时。

ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mL*6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物2(34.1g)为黄色粉末。

2)制备化合物3

将化合物2(8.0g,14.2mmol)分散至纯化水(33.6mL)和丙酮(4.8mL)中，得A料，将硝酸银(4.13g,24.3mmol)溶于纯化水(12.8mL),加至A料,25℃避光搅拌20小时，过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*3)，合并滤液得化合物3的溶液110mL直接用于下一步；

3)制备化合物4

用1mol/L氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g，其生产厂家和型号与实施例1-1相同)，处理三遍；取110mL化合物3的溶液和处理过的树脂(32g)置于三口烧瓶中，25℃搅拌2小时；过滤，树脂用纯化水洗涤(25mL*3)，合并洗液及滤液得化合物4(185mL)的溶液直接用于下一步；

4)制备产品

将化合物4的溶液用5wt％的对甲苯磺酸水溶液调pH＝7-8后20℃搅拌25小时，然后冻干得到产品，取样检测LCMS、¹³CNMR,¹HNMR和Q NMR。

对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。

实施例1-3化合物的制备

1)制备化合物2

ⅰ.将化合物1(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。

ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。

ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。

ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。

ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在35℃下搅拌1小时。

ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mL*6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物2(33.8g)为黄色粉末。

2)制备化合物3

将化合物2(8.0g,14.2mmol)分散至纯化水(33.6mL)和丙酮(4.8mL)中，得A料。将硝酸银(4.13g,24.3mmol)溶于纯化水(12.8mL),加至A料,35℃避光搅拌15小时，过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*3),合并滤液得化合物3的溶液110mL直接用于下一步；

3)制备化合物4

用2mol/L氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g，其生产厂家和型号与实施例1-1相同)，处理三遍；取110mL化合物3的溶液和处理过的树脂(32g)置于三口烧瓶中，35℃搅拌0.5小时；过滤，树脂用纯化水洗涤(25mL*3)，合并洗液及滤液得化合物4(185mL)的溶液直接用于下一步；

4)制备产品

将化合物4的溶液用15wt％的对甲苯磺酸水溶液调pH＝7-8后30℃搅拌15小时，然后冻干得到产品；取样检测LCMS、¹³CNMR,¹HNMR和Q NMR。

对制备获得产物进行结构确认为本发明的化合物。

实施例2-1检测方法(式(J)的化合物作为洛铂中有关物质J在洛铂质量控制中的检测方法)

按照质谱法(中国药典2015年版四部通则0431)测定

色谱条件与系统适用性试验

仪器型号：Agilent 1260+6130MS，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersXselect CSH 4.6*150mm，3.5μm)，以20mmol/L甲酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:1为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为40℃。以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为选择离子监测，监测离子为326，采集时间为13～20min，毛细管出口电压为70V。系统适用性试验溶液的色谱图中，洛铂中有关物质J的峰与相邻有关物质的峰的分离度应不小于1.5；系统适用性试验溶液连续进样6次，有关物质J峰面积的相对标准偏差应不大于10.0％。

表8梯度洗脱条件

系统适用性试验溶液/对照品溶液的制备

取有关物质J对照品(实施例1-1制备得到的化合物)约10mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加适量水超声溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(1)；精密量取对照品贮备液(1)1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(2)；精密量取对照品贮备液(2)1ml，置10ml容量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为对照品溶液。

供试品溶液的制备

取待测洛铂样品(根据专利CN 102020679B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，在各个实施例中涉及洛铂含量时均以洛铂无水物计)约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法

取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图至25分钟。

其有关物质J的典型谱图如图8所示。

供试品溶液色谱图中如有化合物J，其峰面积不得大于对照品溶液的化合物J的峰面积(0.5％)。

实施例2-2检测方法

按照质谱法(中国药典2015年版四部通则0431)测定

色谱条件与系统适用性试验所使用的仪器型号与实施例2-1相同

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSH 4.6*150mm，3.5μm)，以18mmol/L甲酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:0.8为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml，柱温为39℃。以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为选择离子监测，监测离子为326，采集时间为13～20min，毛细管出口电压为70V。

表9梯度洗脱条件

系统适用性试验溶液/对照品溶液的制备

取有关物质J对照品(实施例1-1制备得到的化合物)约10mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加适量水超声溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(1)；精密量取对照品贮备液(1)1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(2)；精密量取对照品贮备液(2)1ml，置10ml容量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为对照品溶液。

供试品溶液的制备

取待测洛铂样品(其来源与实施例2-1相同)约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法

取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图至25分钟。

其有关物质J的典型图谱与实施例2-1一致。

实施例2-3检测方法

按照质谱法(中国药典2015年版四部通则0431)测定

色谱条件与系统适用性试验所使用的仪器型号与实施例2-1相同

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect CSH 4.6*150mm，3.5μm)，以22mmol/L甲酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:1.2为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml，柱温为41℃。以单级四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为选择离子监测，监测离子为326，采集时间为13～20min，毛细管出口电压为70V。

表10梯度洗脱条件

系统适用性试验溶液/对照品溶液的制备

取有关物质J对照品(实施例1-1制备得到的化合物)约10mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加适量水超声溶解，再加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(1)；精密量取对照品贮备液(1)1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(2)；精密量取对照品贮备液(2)1ml，置10ml容量瓶中加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为对照品溶液。

供试品溶液的制备

取待测洛铂样品(其来源与实施例2-1相同)约10mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法

取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图至25分钟。

其有关物质J的典型图谱与实施例2-1一致。

实施例3：检测方法的方法学验证

为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对检测方法的专属性、线性方程以及线性范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)、精密性、溶液稳定性、耐用性等方面进行说明：

1.专属性

精密量取空白溶液(水)、浓度为0.005mg/ml的有关物质J-定位溶液(STD)、浓度为1mg/ml的供试品溶液(SPL)和1.005mg/ml的供试品加标溶液(SPL+STD)各20uL，注入液质联用质谱仪，要求空白基线干净稳定，在有关物质J出峰位置没有干扰，如存在干扰，干扰峰的峰面积不大于LOQ峰面积，结果如图9-1A、图9-1B、图9-2A、图9-2B、图9-3A、图9-3B、图9-3C、图9-4A和图9-4B以及表11所示。

表11专属性结果

备注：由于采用的是SIM模式，监测的是质荷比m/z＝326的离子，SPL中洛铂的质谱信息(质荷比m/z＝398)是不采集的，因此在SPL中看不到洛铂的出峰信息，而显示的是质荷比m/z＝326的物质的峰。在SPL的液相谱图中，由于洛铂是一对非对映体混合物，所以看到的是两个主峰，其中，洛铂非对映体Ⅰ的保留时间为12.528min，洛铂非对映体Ⅱ的保留时间为12.825min，而有关物质J在235nm下无紫外吸收因而看不到峰，从SPL相应的图谱中可以看到洛铂和有关物质J的峰的分离度是大于1.5的。

从上表以及图9-1A、图9-1B、图9-2A、图9-2B、图9-3A、图9-3B、图9-3C、图9-4A和图9-4B可以看出，在有关物质J的出峰位置没有干扰，专属性较好。

2.灵敏度

取对照品溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)3为检测限，信噪比(S/N)10为定量限。检测限浓度为0.505μg/mL(相当于供试品溶液的0.05％)，定量限浓度为1.01μg/mL(相当于供试品溶液的0.1％)。检测限结果如表12所示，定量限结果如表13所示。

表12检测限结果

样品	检测限浓度(μg/mL)	检出限浓度(ppm)	S/N
				有关物质J	0.505	500	13.12

表13定量限结果

从表12可以看出，有关物质J的检出限浓度为500ppm，从表13可以看出，所述有关物质J的定量限为1.01μg/ml，说明本发明的检测方法灵敏度高。

3.线性

以有关物质J的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如图10所示。

从图10可以看出，在0.991μg/mL～9.910μg/mL(991ppm～9910ppm)范围内有关物质J的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝9881.5X-2088.8，相关系数R²为0.9986，表明线性关系良好。

4.精密度

由实验员A和B分别配制系统适用性溶液A和B，然后分别精密量取系统适用性溶液20μL，注入液质联用质谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如表4所示。

表14精密度结果

由表14可以看出，有关物质J峰面积的RSD＜10％，精密度良好。

5.准确度

向供试品溶液中加入有关物质J溶液，平行配制3份50％限度浓度、3份100％限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察有关物质J的准确度。

结果表明，50％限度浓度下，回收率在95％～125％之间；100％限度浓度下，回收率在115％～135％之间；150％限度浓度下，回收率在120％～125％之间，由此证明该方法的准确度良好。

6.溶液稳定性

分别量取供试品溶液，于0h、1.5h、3.5h、5h、7h、8.5h进样，考察有关物质J的峰面积变化，结果如表15所示。

表15溶液稳定性结果

间隔时间	有关物质J峰面积	S％
			0h	8708	---
1.5h	9051	103.93
			3.5h	9767	112.16
5h	10512	120.72
			7h	9590	110.13
8.5h	10034	115.23

备注：S＝(每个时间间隔溶液中有关物质J的峰面积/0h时溶液中有关物质J的峰面积)×100％

从表15可以看出，待测溶液在8.5h内，S％在100％～125％之间，供试品溶液在8.5h内稳定。

7、耐用性

取系统适用性溶液，适当调整液质联用质谱系统中的参数，考察系统条件变化后的分离情况，结果如表16所示。

表16耐用性结果

备注：U＝(改变条件后溶液中有关物质J的峰面积/改变条件前溶液中有关物质J的峰面积)×100％

从表16可以看出，系统条件微小变动后，U％在95％～115％之间表明该法的耐用性良好。

实施例4：体外抗肿瘤活性测定

一、试剂及耗材

1. 细胞株，来自于中科院细胞库

表17细胞株

种属	细胞名称
		肺癌细胞	<u>NCI-H460</u>
卵巢癌细胞	<u>SK-OV-3</u>
		白血病细胞	<u>Jurkat Clone E6-1</u>
白血病细胞	<u>THP-1</u>
		肾癌细胞	<u>SK-NEP-1</u>

2. RPMI培养基，中国Procell，货号：PM150110

3. McCoy’s 5A培养基，中国Procell，货号：PM150710

4.Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572

5. 96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610

6. Envision，美国PerkinElmer

7. FBS，Lonsera，货号：S711-001S

8. 丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422

9. β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985

10. DMSO，美国Sigma，货号：D8418

11. Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120

12. 0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228

二、溶液与缓冲液

1.细胞生长培养基

配置完毕后，储存在4℃备用。

表18细胞及其培养基

细胞名称	培养基
		<u>NCI-H460</u>	RPMI-1640+10体积％FBS+1体积％P/S
<u>SK-OV-3</u>	McCoy’s5A+10体积％FBS+1体积％P/S
		<u>Jurkat Clone E6-1</u>	RPMI-1640+10体积％FBS+1体积％P/S
<u>THP-1</u>	RPMI-1640+10体积％FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1体积％P/S
		<u>SK-NEP-1</u>	McCoy’s5A+15体积％FBS+1体积％P/S

2. Heat-inactivated FBS热灭活血清

将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。

3.化合物处理：

将实施例1-1制备得到的化合物J(3.37g)溶解于DMSO中配制浓度为30mM的溶液在-20℃下保存待用。阳性对照为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP(购自MedChemExpress(MCE)，货号HY-15141)，是一种天然产物，最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus分离得到。

三、实验方法：

(1)复苏细胞

将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃，5体积％CO₂培养。

(2)细胞传代

细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶(由0.25g胰酶加入100mlpbs溶液配制而成)消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1次。

(3)化合物工作液浓度的配制

A化合物单一浓度测试

根据检测要求，实验当天，将实施例一所制备得到的化合物使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，最终化合物浓度化合物如下所示，化合物的测试浓度为10微摩尔，化合物的孵育时间为72小时。

B化合物IC₅₀测试

根据检测要求，实验当天，将实施例一所制备得到的化合物使用DMSO稀释至1mM母液作为最高浓度，并进行2倍，3倍或5倍梯度稀释，再用培养基将每一个浓度点进一步稀释到5X最终浓度的工作液。

(4)细胞接种及药物处理

1.检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5体积％CO₂培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表：

表19细胞铺板密度

细胞名称	密度(细胞/孔)
		NCI-H460	4000
SK-OV-3	2000
		Jurkat Clone E6-1	10000
THP-1	15000
		SK-NEP-1	3000

2.根据实验要求，每孔加入20μL化合物工作液，37℃，5体积％CO₂培养箱，孵育72小时。

3.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega，货号是G7572，名称是celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。

4.计算

细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％

(5)实验结果：

单一浓度10μM的化合物的抑制活性如下

表20化合物J的抑制活性

细胞名称	化合物的细胞存活率(％)	对照的细胞存活率(％)
			NCI-H460	48.88	1.54
SK-OV-3	33.55	1.63
			Jurkat Clone E6-1	10.60	0.93
THP-1	2.20	1.30
			SK-NEP-1	10.53	3.07

从上表可以看出，化合物J对THP-1有较好的抑制活性，抑制率达到90％以上。

测定的剂量-效应曲线见附图11-1至15-2，其中横坐标为浓度，单位为微摩尔，纵坐标为细胞存活率。

化合物的IC₅₀值如下：

表21化合物J的IC50

细胞名称	化合物IC<sub>50</sub>	对照(STSP)
			NCI-H460	＞10μM	40.35nM/40.41nM
SK-OV-3	4.44μM	8.46nM
			Jurkat Clone E6-1	3.23μM	14.67/11.63/12.12/12.84nM
THP-1	4.54μM	73.02/74.45/42.58nM
			SK-NEP-1	2.95μM	12.09/12.38/11.81/10.72nM

通过上述活性数据可以看出，本发明所述的化合物J对人肺癌细胞株NCI-H460的活性最大，对其他的肿瘤细胞也就有一定的抑制活性。对肺癌细胞的NCI-H460抑制活性较小。

综上所述，本发明所述的化合物在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对THP-1的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。

以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。