阅读说明：本技术 洛铂中有关物质的检测方法 (Method for detecting related substances in lobaplatin ) 是由 窦啟玲 汪立冬 常新亮 于 2019-03-19 设计创作，主要内容包括：本发明还提供一种洛铂中有关物质的检测方法,所述有关物质包括6个化合物,其中所述检测方法为HPLC法或HPLC-MS法。HPLC法的色谱柱为：硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂。所述的HPLC法的流动相为正已烷-乙醇(60～70:30～40),HPLC法的流速为每分钟0.8-1.5ml,检测波长为208-212nm,柱温为30-40℃,等度洗脱30-50min；优选地,流速为每分钟1.0ml,检测波长为210nm,柱温为35℃,等度洗脱时间为40min。所述相关物质的应用是在肺癌、肝癌、小细胞肺癌、乳腺癌、血液肿瘤、白血病、胃癌、卵巢癌、前列腺癌和/或肾癌细胞中的应用。(The invention also provides a method for detecting related substances in lobaplatin, wherein the related substances comprise 6 compounds, and the detection method is an HPLC method or an HPLC-MS method. The chromatographic column of the HPLC method is as follows: the surface of the silica gel is coated with cellulose-tri (3-chloro-4-methyl phenyl carbamate) as a filler. The mobile phase of the HPLC method is n-hexane-ethanol (60-70: 30-40), the flow rate of the HPLC method is 0.8-1.5ml per minute, the detection wavelength is 208-212nm, the column temperature is 30-40 ℃, and isocratic elution is carried out for 30-50 min; preferably, the flow rate is 1.0ml per minute, the detection wavelength is 210nm, the column temperature is 35 ℃ and the isocratic elution time is 40 min. The related substances are applied to cells of lung cancer, liver cancer, small cell lung cancer, breast cancer, blood tumor, leukemia, gastric cancer, ovarian cancer, prostatic cancer and/or renal cancer.)

洛铂中有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及洛铂中相关物质的检测方法，属于药物分析质量控制技术领域。

背景技术

洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸 -O1,O2]-铂(II)，分子式为C₉H₁₈N₂O₃Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(1) 所示：

洛铂具烷化作用,属烷化剂(广义)。具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135- 瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，在体小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。

发明内容

为了保证该药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。

本发明要解决的技术问题是提供一种新的检测方法可以同时检测到洛铂中的多个有关物质。

本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质(或相关物质)。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。

具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。

一种洛铂中有关物质的检测方法，所述相关物质选自如下化合物H1、化合物H2、化合物G1、化合物G2、化合物L1或化合物L2：

化合物H1：化合物H2：

化合物G1：

化合物G2：化合物L1：和化合物L2：

优选地，对于所述的检测方法，其中，所述有关物质为化合物H1、化合物H2、化合物G1和G2的混合物、化合物L1或化合物L2中的任一种。

优选地，对于所述的检测方法，其中，所述有关物质同时包括化合物H1、化合物H2、化合物G1和G2的混合物、化合物L1以及化合物L2。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述洛铂包括洛铂非对映体I和洛铂非对映体II中的任一种或二种。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述化合物H1和H2的制备方法，经过中间体

和/或制备得到；所述化合物 G1和G2、L1和L2的制备方法是经过中间体

制备得到。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述化合物H1和H2通过下述反应方程式(1)得到：

或者，所述化合物G1和G2通过下述反应过程式(2)得到：

或者，所述化合物L1和L2通过下述反应方程式(3)得到：

其中，还更优选地，在上述反应方程式(1)中，所述反式二碘化物即化合物1 通过下面的方程式(1-a)制备得到：

在上述反应方程式(2)中，所述化合物1(顺式草酸盐)可以像反应方程式(3)中那样，通过顺式二氰基环丁烷制备得到二氨基甲基环丁烷后再与草酸反应得到；也就是说，化合物G1和G2可以通过下述反应式方程式(1-b)制备得到：

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述检测方法为HPLC法或HPLC-MS法。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述的HPLC法的色谱柱为：硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述的HPLC法的流动相为体积比例60～70:30～40的正己烷-乙醇，优选体积比例为63-67:37-33；更优选地，流动相为体积比例65:35的正己烷-乙醇。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述的HPLC法的洗脱方式为等度洗脱。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述HPLC法的流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃，等度洗脱30-50min；优选地，流速为每分钟1.0ml，检测波长为210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为 40min。

优选地，对于前面任一项所述的检测方法，其中，所述检测方法按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质H1、有关物质L1、有关物质L2各不得超过对照溶液中主成分峰面积的0.5倍，有关物质G1、有关物质G2 和有关物质H2的总和不得超过对照溶液中主成分峰面积。

优选地，对于前面任一项所述检测方法，其中，供试品溶液中如有相关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质G1、G2和/ 或H2的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为 2.00-2.30、优选为2.16；化合物L1的相对保留时间为1.2-1.5、优选为1.35，化合物L2的相对保留时间为3.4-3.7、优先为3.58。

本发明的有益效果如下：

本发明将化合物H1、化合物H2、化合物G1、化合物G2、化合物L1或化合物L2进行了结构确认，确认洛铂的有关物质，为建立完整的洛铂质量检测体系，该方法可以同时检测洛铂中多个有关物质(杂质)。该方法灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高。

附图说明

图1A：本发明有关物质H的HPLC-MS中的HPLC图谱；

图1B：本发明有关物质H的HPLC-MS中的MS图谱；

图2：本发明有关物质H的¹H-NMR图谱；

图3：本发明有关物质H的¹³C-NMR图谱；

图4：本发明有关物质H的Q-NMR图谱；

图5：本发明有关物质H的UV图谱；

图6：本发明有关物质H的IR图谱；

图7：本发明有关物质H的DSC图谱；

图8A-1：本发明物质H1的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长 220nm)；

图8A-2：本发明物质H1的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长 254nm)；

图8B：本发明有关物质H1的MS图谱；

图9A：本发明有关物质H1的SFC图谱；

图9B：本发明物质H1的分子三维结构图；

图10A-1：本发明物质H2的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长 220nm)；

图10A-2：本发明物质H2的HPLC-MS结构确认检测的HPLC色谱图(波长 254nm)；

图10B：本发明有关物质H2的HPLC-MS结构确认检测的MS图谱；

图11：本发明有关物质H2的SFC图谱；

图12A-1：本发明化合物G1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为215nm)；

图12A-2：本发明化合物G1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为210nm)；

图12B：本发明有关物质G1的HPLC-MS联用结构确认检测中的MS图谱；

图13：本发明有关物质G1的¹H-NMR图谱；

图14：本发明有关物质G1的¹³C-NMR图谱；

图15：本发明有关物质G1的Q-NMR图谱；

图16：本发明有关物质G1的UV图谱；

图17：本发明有关物质G1的IR图谱；

图18A：本发明有关物质G1的DSC图谱；

图18B：本发明有关物质G1结构确认的HPLC谱图；

图19A-1：本发明化合物G2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为215nm)；

图19A-2：本发明化合物G2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为210nm)；

图19B：本发明有关物质G2的HPLC-MS联用结构确认检测中的MS图谱；

图20：本发明有关物质G2的¹H-NMR图谱；

图21：本发明有关物质G2的¹³C-NMR图谱；

图22：本发明有关物质G2的Q-NMR图谱；

图23：本发明有关物质G2的UV图谱；

图24：本发明有关物质G2的IR图谱；

图25A：本发明有关物质G2的DSC图谱；

图25B：本发明有关物质G2结构确认的HPLC谱图；

图26：本发明制备化合物L1和L2的中间体化合物3的¹H-NMR图谱；

图27A-1：本发明化合物L1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为215nm)；

图27A-2：本发明化合物L1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为210nm)；

图27B：本发明有关物质L1的HPLC-MS联用结构确认检测中的MS图谱；

图28：本发明有关物质L1的¹H-NMR图谱；

图29：本发明有关物质L1的¹³C-NMR图谱；

图30：本发明有关物质L1的Q-NMR图谱；

图31：本发明有关物质L1的UV图谱；

图32：本发明有关物质L1的IR图谱；

图33A：本发明有关物质L1的DSC图谱；

图33B：本发明有关物质L1结构确认的HPLC谱图；

图34A-1：本发明化合物L2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为215nm)；

图34A-2：本发明化合物L2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱 (波长为210nm)；

图34B：本发明有关物质L2的MS图谱；

图35：本发明有关物质L2的¹H-NMR图谱；

图36：本发明有关物质L2的¹³C-NMR图谱；

图37：本发明有关物质L2的Q-NMR图谱；

图38：本发明有关物质L2的UV图谱；

图39：本发明有关物质L2的IR图谱；

图40A：本发明有关物质L2的DSC图；

图40B：本发明有关物质L2结构确认的HPLC谱图；

图41：本发明有关物质作为洛铂有关物质检测实施例中的典型HPLC图谱；

图42A-1：物质H对HCCC-9810的剂量响应曲线图；

图42A-2：STSP对HCCC-9810的剂量响应曲线图；

图42B-1：物质H对NCI-H460的剂量响应曲线图；

图42B-2：物质L2对NCI-H460的剂量响应曲线图；

图42B-3：STSP对NCI-H460的剂量响应曲线图；

图42C-1：物质H对MDA-MB-453的剂量响应曲线图；

图42C-2：STSP对MDA-MB-453的剂量响应曲线图；

图42D-1：物质H对DU 145的剂量响应曲线图；

图42D-2：STSP对DU 145的剂量响应曲线图；

图42D-3：物质L1对SK-OV-3的剂量响应曲线图；

图42D-4：STSP对SK-OV-3的剂量响应曲线图；

图42D-5：物质G1对K562的剂量响应曲线图；

图42D-6：物质G2对K562的剂量响应曲线图；

图42D-7：物质L1对K562的剂量响应曲线图；

图42D-8：STSP对K562的剂量响应曲线图；

图42D-9：物质L2对K562的剂量响应曲线图；

图42D-10：STSP对K562的剂量响应曲线图；

图42E-1：物质G1对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42E-2：物质L1对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42E-3：物质L2对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42E-4：物质G2对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42E-5：物质H对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42E-6：STSP对Jurkat Clone E6-1的剂量响应曲线图；

图42F-1：物质G2对AGS的剂量响应曲线图；

图42F-2：物质L1对AGS的剂量响应曲线图；

图42F-3：物质L2对AGS的剂量响应曲线图；

图42F-4：物质G1对AGS的剂量响应曲线图；

图42F-5：物质物质H对AGS的剂量响应曲线图；

图42F-6：STSP对AGS的剂量响应曲线图；

图42G-1：物质H对HL-60的剂量响应曲线图；

图42G-2：STSP对HL-60的剂量响应曲线图；

图42G-3：物质G2对HL-60的剂量响应曲线图；

图42G-4：L1对HL-60的剂量响应曲线图；

图42G-5：物质L2对HL-60的剂量响应曲线图；

图42G-6：物质G1对HL-60的剂量响应曲线图；

图42H-1：物质H对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42H-2：STSP对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42H-3：物质G2对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42H-4：物质L1对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42H-5：物质L2对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42H-6：物质G1对SK-NEP-1的剂量响应曲线图；

图42I-1：物质H对95-D的剂量响应曲线图；

图42I-2：STSP对95-D的剂量响应曲线图；

图42I-3：物质G1对95-D的剂量响应曲线图；

图42I-4：物质G2对95-D的剂量响应曲线图；

图42I-5：物质L2对95-D的剂量响应曲线图；

图42J-1：物质H对THP-1的剂量响应曲线图；

图42J-2：STSP对THP-1的剂量响应曲线图；

图42J-3：物质G2对THP-1的剂量响应曲线图；

图42J-4：物质L1对THP-1的剂量响应曲线图；

图42J-5：物质L2对THP-1的剂量响应曲线图；

图42J-6：物质G1对THP-1的剂量响应曲线图；

图42K-1：物质H对OVCAR-3的剂量响应曲线图；

图42K-2：STSP对OVCAR-3的剂量响应曲线图；

图42K-3：物质G1对OVCAR-3的剂量响应曲线图；

图42K-4：物质G2对OVCAR-3的剂量响应曲线图；

图42K-5：物质L2对OVCAR-3的剂量响应曲线图；

图43：本发明检测方法学验证中空白溶液的色谱图；

图44：本发明检测方法学验证中RS溶液的色谱图；

图45：本发明检测方法学验证中非对映异构体II的线性图；

图46：本发明检测方法学验证中非对映异构体I的线性图；

图47：本发明检测方法学验证中非对映异构体H2的线性图；

图48：本发明检测方法学验证中相关物质H1的线性图；

图49：本发明检测方法学验证中相关物质G1的线性图；

图50：本发明检测方法学验证中相关物质G2的线性图；

图51：本发明检测方法学验证中相关物质L1的线性图；

图52：本发明检测方法学验证中相关物质L2的线性图。

具体实施方式

本发明发现并制备了洛铂质量有关新物质的制备及用来控制洛铂质量的检测检测方法，尤其是本发明提供与洛铂质量有关的洛铂多个有关物质的检测方法。

在本发明中，任何影响洛铂药物纯度的物质统称为“影响洛铂质量的有关物质”或者“影响质量的有关物质”，简称“有关物质”(本文中有些情况下也称为“相关物质”)，例如在检测洛铂质量的XRD衍射峰中出现的影响洛铂质量的有关物质峰，简称为“有关物质峰”；本发明中的所述“有关物质”有些情况下即是本领域技术人员公知的影响药物纯度的“杂质”，然而，在本发明中所述”有关物质”不限于“杂质”的范畴，还包括具有一定抗癌活性甚至其活性高于洛铂的物质，他们相对于活性分子“洛铂”而言属于与洛铂有关的物质范畴，其抗癌活性或者其他的研发新药物方面积极的作用和功能的原理尚未完全研究清楚。本发明中“有关物质”的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定杂质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定杂质的合理限度，这一研究贯穿于药品研发的整个过程。

在本发明的一种优选实施方式中，本发明提供一种洛铂原料药或制剂的质量检测方法，其包括测定其中影响洛铂质量的有关物质的步骤，所述有关物质为如下化合物H1、化合物H2、化合物G1、化合物G2、化合物L1或化合物L2中的任一种或者它们的任意二种以上混合物：

化合物H1：

化合物H2：化合物G1：化合物G2：化合物L1：

化合物L2：

其中所述检测方法为HPLC法或HPLC-MS法；所述的HPLC法的色谱柱为：硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂；所述的HPLC 法的流动相为正己烷-乙醇，体积比例为60～70:30～40，优选体积比例为 63-67:37-33；优选地，更优选地，流动相为体积比例65:35的正己烷-乙醇，洗脱方式为等度洗脱。

优选地，所述HPLC法的流速为每分钟0.8-1.5ml，检测波长为208-212nm，柱温为30-40℃，等度洗脱30-50min；优选地，流速为每分钟1.0ml，检测波长为 210nm，柱温为35℃，等度洗脱时间为40min。

优选地，其中按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质 H1、有关物质L1、有关物质L2各不超过对照溶液中主成分峰面积的0.5倍，有关物质G1、有关物质G2和有关物质H2的总和不得超过对照溶液中主成分峰面积。

优选地，对于所述检测方法，其特征在于，供试品-洛铂溶液中如有相关物质峰，则以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：有关物质G1、G2、H2 的相对保留时间为2.40-2.70、优选为2.58，有关物质H1的相对保留时间为 2.00-2.30、优选为2.16；化合物L1的相对保留时间为1.2-1.5、优选为1.35，化合物L2的相对保留时间为3.4-3.7、优选为3.58。

所述物质的相对保留时间是指相对于洛铂的保留时间，具体是相对于洛铂非对映体II的保留时间。具体来说，作为洛铂化合物已知有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：

洛铂非对映体I(简称RRS)：

洛铂非对映体II(简称SSS)：

下面将通过实施例说明本发明发现的与洛铂质量有关物质H1、H2、G1或G2、 L1或L2等化合物的制备，这些新物质的结构确认以及这些新物质化合物的抗肿瘤活性；并且进一步通过实施例来详细说明本发明关于洛铂中有关物质的检测方法。

实施例1化合物H的制备

物质H以及H1和H2的制备过程如下面的反应式(A)、(B)和分离过程式(C)所示；先按照专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并经结构鉴定确认得到下面化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)，然后以该草酸盐为原料按照下面的反应式(A)制备得到式1所示的二碘化物，即化合物1；再由化合物1通过下面的反应式(B)得到式(H)所示的化合物(也称化合物 H)；再对该H化合物通过SFC(超临界流体色谱)分离得到化合物H1和化合物H2，如分离过程式(C)所示。其中温度、时间、溶剂等反应条件仅仅示例性标注了部分实施方案的温度，本发明中，物质的H的制备方法不限于下面的反应式(A)、(B)和(C)所示。

下面制备过程中所用到的各试剂来源如下：

其中，先按照专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备，并经结构鉴定确认得到化合物1A(反式-二氨甲基环丁烷草酸盐)，然后以该草酸盐为原料按照反应式(A)制备得到式1所示的二碘化物即化合物1，作为通过反应式(B) 制备化合物H的原料。具体来说，化合物1的制备过程(后面的实施例5和6中所述的二碘化合物1也是通过下述过程制备)如下：

ⅰ.将化合物1A(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL, 180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。

ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。

ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。

ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。

ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌2小时。

ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mLX6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物1(35g)为黄色粉末。

下面，以化合物1为起始原料通过反应式(B)制备化合物H的具体过程以及通过化合物H制备H1和H2的过程说明如下：

1)制备化合物2

将化合物1(20g,35.5mmol)分散至纯化水(84mL)和丙酮(12mL)中，得A料。将硝酸银(10.91g,64.2mmol)溶于纯化水(32mL),加至A料,30℃避光搅拌18小时。过滤,滤饼用水洗涤6次(20mL*6),合并滤液得化合物2的溶液 250mL直接用于下一步。

2)制备化合物3

用1.5mol/L的氢氧化钠水溶液(120mL)处理树脂(80g),处理三遍。取250 mL化合物2的溶液和处理过的树脂(80g)置于三口烧瓶,30℃避光搅拌1小时。过滤,树脂用纯化水100mL洗涤6次(100mL*6),合并洗液及滤液得化合物3(850 mL)的溶液直接用于下一步。

3)制备化合物H

向化合物3的溶液中加入20质量％的羟基丙酸水溶液，调节pH＝6.4,35℃避光搅拌36小时。过滤，将滤液减压浓缩至干。将剩余物溶于丙酮(9mL)和纯化水(18 mL)，然后于10℃重结晶120h，过滤，旋干得相关物质H(3.5g)为类白色固体。

4)制备化合物H1和H2

上面得到的相关物质H通过SFC(超临界流体色谱，所用仪器型号：Waters 80QPreparative SFC system)分离得到相关物质H1(化合物H1)和H2(化合物 H2)。其中分离的条件如下：柱:DAICEL CHIRALCEL OD(250mm*30mm,10μm)，流动相A:[超临界CO₂]，流动相B:[甲醇，+体积比为0.1％NH₃·H₂O]；等度洗脱:0-14min，75体积％流动相A+25体积％流动相B)。其中物质H1和H2具体是通过SFC超临界流体色谱分离(H1为色谱先出来、即保留时间较短的化合物标记为H1，H2为色谱晚出来、即保留时间长得到的物质标记为H2，之后进行了下面所述的结构确认，特别是进行了单晶培养之后确认，物质H1成功得到了单晶衍射峰等相关检测数据；然而物质H2未得到理想的单晶衍射数据，根据结构确认得到物质H1的结构之后，可以推定出物质H2的结构。在下面结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物H1和H2均对应于本实施例1中制备得到的化合物H1 和化合物H2，也就是说，本发明所称化合物H1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物H2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。

具体来说，下面结构确认和活性检测实施例中所述物质H1和H2结构式如下所述：

分子式均为：C₉H₁₈N₂O₃Pt

实施例2：化合物H、H1和H2结构确认

1.对实施例1得到的化合物H进行结构确认：

1)HPLC-MS:

所用的HPLC-MS条件为：

所用的HPLC-MS仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD；

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq, 2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表1程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm 和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃，检测图谱见附图1A。

表1

其中MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1500。

检测结果如下表2，图谱见附图1B，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、 398.1、399.1、400.0处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰、在440.1左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰及再795.3处出现[2M’+H]⁺是样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于相关物质H(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为 397.33，质谱信息与相关物质H(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明相关物质分子结构相符。

表2

m/e	碎片离子峰	备注
			398.1	[M’+H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
440.1	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰
			795.3	[2M’+H]<sup>+</sup>	样品二聚合作用后的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；氢谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下表3所示：

表3

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.21-1.23	d	3	6
1.57-1.65	m	2	1,1’
				1.90-1.98	m	2	1,1’
2.36-2.89	m	6	3,3’,2,2’
				3.99-4.05	m	1	5

谱图见附图2，可以看出，样品氢谱数据与产品的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下表4所示：

表4

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				21.72-21.76	仲碳	2	1,1’
22.01-22.17	伯碳	1	6
				39.51-40.07	仲碳	2	3,3’
50.59-50.89	叔碳	2	2,2’
				74.42	仲碳	1	5
194.21-194.25	季碳	1	7

谱图见附图3，可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与物质H的分子结构相符。

4)Q NMR

其是采用BrukerAVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(99.74％)，测定结果如下表5所示：

表5

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

谱图见附图4，从上表中可以看出，其标定含量为97.4％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图5，190nm处为最大紫外吸收波长。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围： 4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下表6所示，图谱见附图6：

表6

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3450.62,3206.31,3127.28	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2968.38,2946.15,2866.99	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1638.50,1578.55	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1373.23,1346.20,320.56	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1110.83	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1042.14	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

7)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图7。

8)旋光度(OR)

旋光仪:Anton PaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水),25℃；结果如下表7 所示：

表7

通过上述图谱确认了本发明的物质H

结构为，

该物质H包括2种异构体H1和H2，

2.化合物H1的结构确认

对实施例1得到的H1进行如下结构确认：

1)HPLC-MS:

所用的HPLC-MS条件为：

HPLC条件：所有HPLC-MS仪器为SHIMADZU LCMS-2020；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kinetex EVO C182.1*30mm，5μm)，以体积比0.025％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表8程序进行梯度洗脱；检测波长为 220nm和254nm(PAD检测器)，柱温为40℃。

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

表8

检测结果图谱见附图8A-1、图8A-2和图8B所示，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.0处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质H 1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物 H1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明相关物质分子H1结构相符。

2)物质H1的SFC

其中，SFC条件：Agilent 1260series analytical SFC，柱:DAICEL CHIRALCELOD-3(50mm*4.6mm,3μm)，流动相A:[超临界CO₂]，流动相B:[甲醇，+体积比为 0.05％二乙胺]，按下表8A程序进行梯度洗脱，流速:3.0mL/min，柱温:35℃，波长:220nm。

表8A

其中化合物H1的谱图如图9A所示，可以看出保留时间为2.678min时，出现了化合物H1的峰。

3.化合物H1的单晶衍射

1)单晶培养制备的条件如下：

将样品溶于丙酮-水(1：1)的溶液中放在半密封容器中，溶剂子啊室温下慢慢挥发，合适大小的晶体在地17天形成，通过显微镜检查其透明度，然后晶体进行X-光检测。

2)单晶衍射的设备及数据收集方式；

设备：配有石墨单色Mo-Kα辐射靶的Rigaku SaturnX-射线衍射仪(Rigaku SaturnDiffractometerusing graphic-monochromated Mo Kαradiation )。

单管直径：φ＝0.50mm

从晶体到CCD检测器的距离：d＝45mm

管电压(Tube Pressure):50kV

管电流(Tube Flow):16mA

在theta的2.444to 27.864°范围内共收集到16961反射数据.极限指标:-12≤ h≤12,-13≤k≤13,-18≤l≤18；在3365unique reflections(R_int＝0.0682)。

3)单晶衍射的结果综述如下：

该晶体是一种无色的棱柱，具有以下维度:0.10×0.10×0.10mm³；晶体结构的对称性被分配正交空间群(P2(1)2(1)2(1))，具有以下参数:

α＝β＝γ＝90°,Z＝4,Dc＝2.120Mg/m³,F(000)＝872,μ(Mo Kα)＝9.944mm^–1,andT＝113(2)。三维结构如图9B 所示。

4)单晶衍射的具体数据如下：其中X-ray晶体学数据总结如下表表9所示：

表9

其中，子座标(x 10^4)和各向同性位移参数(A^2x 10^3)(Atomic coordinates(x10^4) andequivalent isotropic displacementparameters(A^2x 10^3).)如下表表10所示：

表10

其中，键长[A]和键角[deg](Bond lengths[A]and angles[deg])如下表11所示：

表11

其中，扭转角[deg](Torsion angles[deg].)如下表12所示

表12

其中，氢键的键长及键角[Aand deg.](Hydrogen bonds[Aand deg.]..)如下表13所示。

表13

用来产生等效原子的对称变换:

#1-x+1/2,-y+1,z+1/2 #2x,y+1,z+1 #3x,y+1,z #4-x+1,y+1/2,-z+1/2 #5x-1/2,-y+1/2,-z #6x,y,z-1 #7-x+1/2,-y+1,z-1/2 #8-x,y-1/2,-z+1/2 #9x-1,y-1,z #10x,y-1,z

综上所述，确定出H1的绝对构型为：

3.化合物H2的结构确认

对实施例1得到的H2进行如下结构确认：

1)HPLC-MS:

HPLC条件：所用HPLC-MS仪器型号为SHIMADZU LCMS-2020；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Kinetex EVO C182.1*30mm，5μm)，以体积比 0.025％氨水为流动相A，乙腈为流动相B，按下表14程序进行梯度洗脱；检测波长为220nm和254nm(PAD检测器)，柱温为40℃。

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000；

表14

检测图谱见附图10A-1、图10A-2和图10B，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.0处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质H 1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物 H2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明相关物质分子H2结构相符 (在如上所述确定了物质H1的绝对构型情况下，可反推出物质H2的构型)。

2)物质H2的SFC检测

SFC检测条件：所用仪器型号名称为：Agilent 1260series analytical SFC，柱:DAICEL CHIRALCEL OD-3(50mm*4.6mm,3um)，流动相A:[超临界CO₂]，流动相 B:[甲醇，+体积比为0.05％二乙胺]，按下表14A程序进行梯度洗脱，流速:3.0mL/min，柱温:35℃，波长:220nm。

表14A

其中化合物H2的谱图如图11所示，由图11可以看出t＝2.805min时出峰物质为H2。

根据H1的单晶衍射结果和化合物H的结构，可以反推得到化合物H2的结构如下：

实施例3：化合物G1和G2的制备

制备反应过程式如下所示：

所用的试剂来源详见下面的表A。

表A

具体来说，通过上述反应过程式制备化合物G的制备方法如下：

1)制备化合物2A

将化合物1A(24.0g,226.1mmol)溶于无水四氢呋喃(THF，480mL)中, 降温至0℃。0℃下,滴加10mol/L硼烷二甲硫醚(BH₃.Me₂S，其CAS号为13292-87-0，加入157mL,1.57mol)，保温搅拌1小时。体系升至40℃搅拌1小时。升温至65℃搅拌1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2/1)显示原料反应完全。将体系降温至0℃,用甲醇480mL淬灭反应,浓缩体系至干。加入正丁醇(350 mL)升温至100℃搅拌16小时。得到化合物2A粗品(42.0g),直接用于下一步。

2)制备化合物1

将化合物2A(42.0g,粗品)溶于异丙醇(i-PrOH，400mL),得A液。将草酸 (11.5g,127.7mmol)溶于异丙醇(115mL),得B液。将B液滴至A液,有大量白色固体(化合物1粗品)析出。将体系升温至70℃,搅拌1小时。过滤，滤饼加至常温THF(110mL)中，升温至65℃搅拌1h。过滤,滤饼干燥得化合物1 (23.0g)为白色固体。

3)制备化合物2

将化合物1(17.0g,57.7mmol),氯亚铂酸钾(21.5g,51.9mmol),碘化钾 (51.4g,309.7mmol)和氢氧化钾(14.6g,220.8mmol)分别溶于65mL,70mL, 50mL和143mL纯化水,得A,B,C,D液。将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌4小时。过滤,滤饼用纯化水洗涤6次，每次100mL(100mL* 6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物2(19g)为黄色粉末。

4)制备化合物3

将化合物2(19g)分散至水(82mL)和丙酮(9.5mL)中，搅拌十分钟。将硝酸银(10.4g,61.3mmol)溶于水(31mL),加至体系,避光在20℃下搅拌16 小时。过滤,滤饼用纯化水冲洗(30mL×5),合并水相得化合物3(200mL)的水溶液直接用于下一步。

5)制备化合物4

用1.5mol/mL氢氧化钠水溶液(150mL)处理树脂(80g),处理三遍。将化合物3的水溶液加热至30℃。将处理过的树脂一次性加至体系,搅拌1小时。过滤,树脂用纯化水洗涤(50mL×6)。合并水相得化合物4(500mL)的水溶液直接用于下一步。

6)制备化合物G1和G2

将化合物4(500mL)的水溶液置于烧瓶。用化合物5乳酸调体系pH＝6.4(实际上在6.4-6.8内都可以),升温至30℃,有少量黑渣生成，搅拌87小时。过滤,将水相冻干得到黄色固体。剩余物经制备型高效液相色谱prep.HPLC(仪器型号： SHIMADZU LC-20AP，色谱柱:Phenomenex Synergi Max-RP(250*50mm*10 μm)；流动相A：水(10mM NH₄HCO₃)，B：乙腈]；0-17.8min梯度洗脱，流动相 B由0增大到17.5％)两次纯化得化合物G1(1.45g)和化合物G2(1.54g)为白色固体。其中将先出峰的化合物标记为G1，后出峰的化合物标记为G2。

在随后的结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物G1和G2均对应于本实施例中制备得到的化合物G1和化合物G2，也就是说，本发明所称化合物G1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物G2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。

其中，G1和G2结构式均为下面2种结构中的任一种，当G1为其中一种结构时，G2是这2种结构中的另一种；具体将通过下面结构确认实施例来说明该结构的确认过程。

实施例4：化合物G1和G2结构确认

将实施例3中步骤6)得到的纯化化合物G1和G2依次取样进行检测，包括高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)；核磁共振氢谱(¹H NMR)；核磁共振碳谱(¹³C NMR)；紫外吸收光谱(UV)；红外光谱(IR)；差示扫描量热(DSC)； HPLC、旋光度(OR)；定量核磁共振(Q NMR)。

对化合物G1和G2进行单晶培养，由于单晶培养失败不能确认最终两个化合物的具体具体结构，但是可以确认的是两个手性对映体，这些检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物。因此关于化合物G1和G2的结构确认都是指定。具体结构如下：

为:或者

分子式:C₉H₁₈N₂O₃Pt

1.化合物G1的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD

所用的HPLC-MS条件为：

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq, 2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表15-1程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm 和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃，检测结果见图12A-1，图12A-2，梯度洗脱程序见下表15-1。

表15-1

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

检测结果如下表15-2所示，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、 399.1、400.1处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰、在438.1、439.1、440.2 左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质G1 (C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与相关物质G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。质谱信息与本发明相关物质分子结构相符，详见附图12B。

表15-2

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.1	[M’+H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.1,440.2	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；

¹H NMR:氢谱(甲醇(CD3OD)400MHz)的化学位移及归属如下：相关物质G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与 G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合，相关化学位移如表16所示，具体详见附图13.

表16

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.31-1.37	m	3	6
1.55-1.65	m	2	1,1’
				2.07-2.19	m	2	1,1’
2.70-3.01	m	6	3,3’,2,2’
				4.12-4.18	m	1	5

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；

碳谱(CD3OD,400MHz)的化学位移及归属如下表17所示：

表17

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34-20.37	仲碳	2	1,1’
21.75	伯碳	1	6
				35.09-35.65	仲碳	2	3,3’
44.47-44.86	叔碳	2	2,2’
				74.83	仲碳	1	5
194.23	季碳	1	7

¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，详见附图14，这与所示相关物质G1的分子结构相符。

4)定量核磁共振(Q NMR)

仪器型号：BrukerAVANCE NEO 400；使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8质量％)，测定结果如下表18：

表18

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比；

图谱见附图15，从上表中可以看出，其标定含量为94.86质量％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图16。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围： 4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下表19：谱图见附图17。

表19

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3422.64,3253.80,3128.37	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2978.35,2937.71,2873.05	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1637.54,1615.10	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1363.46,1336.51	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1048.04	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

7)旋光度(OR)

旋光仪:AntonPaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(water),25℃；

结果如下表20：

表20

8)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图18A，图中，第一个峰左极限为122.04℃，峰值为154.49℃，右极限为161.69℃；第二个峰左极限为161.69℃，峰值为177.73℃，右极限为240.05℃。

9)高效液相色谱(HPLC)

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB,色谱柱型号：Waters XSelect CSH-C18 4.6*150mm*3.5μm；

HPLC的操作条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表20A程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表20A梯度洗脱程序

图谱见附图18B，从图中可以看出保留时间为7.815min时，出现了化合物 G1的峰。

2.化合物G2的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD

所用的HPLC条件为：

其中HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875 体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm 和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃，检测结果见图19A-1，图19A-2，梯度洗脱程序如下表21-1。

表21-1

其中MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt, 因此在样品的MS中，在397.0、398.1、399.1、400.1、401.1处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰、在440.2左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与相关物质G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符，相关数据见表21-2，具体谱图详见图 19B。

表21-2

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；

氢谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下：相关物质G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt) 中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合，相关数据见表22，具体谱图详见图20。

表22

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.28-1.35	d	3	6
1.44-1.65	m	2	1,1’
				2.10-2.22	m	2	1,1’
2.54-3.00	m	6	3,3’,2,2’
				4.10-4.18	m	1	5

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；

碳谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下表23：

表23

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34	仲碳	2	1,1’
21.82	伯碳	1	6
				35.19	仲碳	2	3,3’
44.40-44.94	叔碳	2	2,2’
				74.85	仲碳	1	5
194.22	季碳	1	7

¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示相关物质G2的分子结构相符，详见附图21。

4)定量核磁共振(Q NMR)

仪器型号：BrukerAVANCE NEO 400；使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8％)，测定结果如下表24：

W％的计算公式如下表24：

表24

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比；

图谱见附图22，从上表中可以看出，其标定含量为95.49％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图23，190nm处为最大紫外吸收波长。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围： 4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下表25：谱图见附图24。

表25

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3424.38,3217.09,3133.38	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2975.09,2868.01	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1636.72	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1350.46	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1110.91	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1048.04	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

7)旋光度(OR)

旋光仪:AntonPaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水),25℃；

结果如下表26：

表26

8)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃图谱见附图25A，图中，第一个峰的左极限为100.35℃，峰值为130.32℃，右极限为150.86℃；第二个峰的左极限为154.96℃，峰值为182.38℃，右极限为 241.85℃。

9)高效液相色谱(HPLC)

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB,色谱柱型号：Waters XSelect CSH-C18 4.6*150mm*3.5μm。

HPLC的操作条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表26A程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表26A梯度洗脱程序

图谱见附图25B，从图中可以看出保留时间为8.800min时，出现了化合物 G2的峰。

实施例5：化合物L1和L2的制备

制备时反应过程如下所示：

其中下面实施例中制备化合物L1和L2所用的原料来源如下：

具体制备步骤描述如下：

1)制备化合物2

将化合物1(24.0g,226.1mmol)溶于无水四氢呋喃(480mL)中,降温至 0℃。0℃下,滴加10mol/L硼烷二甲硫醚(BH₃.Me₂S，其CAS号为13292-87-0，加入157mL,1.57mol)，保温搅拌1小时。体系升至40℃搅拌1小时。升温至 65℃搅拌1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯＝2/1体积比)显示原料反应完全。将体系降温至0℃,用甲醇480mL淬灭反应,浓缩体系至干。加入正丁醇(350mL) 升温至100℃搅拌16小时。得到化合物2粗品(42.0g),直接用于下一步。

2)制备化合物3

将化合物2(42.0g,粗品)溶于异丙醇(400mL),得A液。将草酸(11.5g, 127.7mmol)溶于异丙醇(i-PrOH，115mL),得B液。将B液滴至A液,有大量白色固体(化合物3粗品)析出。将体系升温至70℃,搅拌1小时。过滤，滤饼加至常温THF(110mL)中，升温至65℃搅拌1h。过滤,滤饼干燥得化合物 3(23.0g，其¹HNMR检测谱图如图26所示)为白色固体。

3)制备化合物4

将化合物3(23.0g,78.2mmol),氯亚铂酸钾(29.1g,70.2mmol),碘化钾 (69.6g,419.0mmol)和氢氧化钾(19.7g,298.6mmol)分别溶于88mL,96mL, 70mL和194mL纯化水,分别得A,B,C,D液。将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌4小时。过滤,滤饼用纯化水50mL洗涤5次(50mL*5) 至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物4(24.0g)为黄色粉末。

4)制备化合物5

将化合物4(24.0g)分散至水(90mL)和丙酮(10.5mL)中，搅拌10分钟。将硝酸银(10.32g,60.75mmol)溶于水(90mL),加至体系,避光在20℃下搅拌16小时。过滤,滤饼用纯化水30mL冲洗3次(30mL*5),合并水相得化合物 5(300mL)的水溶液直接用于下一步。

5)制备化合物6

用1.5mol/L氢氧化钠水溶液(200mL)处理树脂(100g),处理三遍。将化合物5(300mL)的水溶液加热至30℃。将处理过的树脂一次性加至体系,搅拌 1小时。过滤,树脂用纯化水洗涤4次(40mLX 4)。合并水相得化合物6(460 mL)的水溶液直接用于下一步。

6)制备化合物L1和L2

将化合物6(460mL)的水溶液置于烧瓶。用化合物7乳酸调体系pH＝6.6,升温至30℃,有少量黑渣生成，反应87h。过滤,将滤液冻干。冻干品经制备型高效液相色谱prep.HPLC(色谱仪器型号：waters 80Q preparative SFC system；色谱柱:Phenomenex SynergiMax-RP(250*50mm*10μm)；流动相A:水(10m mol/L NH₄HCO₃)，B：乙腈]；0-20min梯度洗脱，流动相B的体积由0增大到20％)两次纯化得化合物L1(0.775g)和化合物L2(0.882g)为白色固体。其中将先出峰的化合物标记为L1，后出峰的化合物标记为L2。

在随后的结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物L1和L2均对应于本实施例中制备得到的化合物L1和化合物L2，也就是说，本发明所称化合物 L1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物L2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。

其中，L1和L2结构式均为下面2种结构中的任一种，当L1为其中一种结构时，L2是这2种结构中的另一种；具体将通过下面结构确认实施例来说明该结构的确认过程。具体结构如下：

或者

分子式:C₉H₁₈N₂O₃Pt

实施例6：化合物L1和L2结构确认

下面对实施例5制备的化合物L1和L2进行结构检测、确认。化学结构：由于单晶培养失败，无单晶衍射检测数据，因此无法确认杂质L1和L2的绝对构型)，但是可以确认的是两个手性对映体，这些检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物，因此下述关于化合物L1 和L2的结构确认都是如上所述的指定或者标记。

1.化合物L1的结构确认

仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD

所用的HPLC-MS条件如下：

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq, 2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表27-1程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm 和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃。检测结果见图27A-1，图27A-2。

表27-1梯度洗脱程序

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

检测结果如下表27-2和图27B所示，可以看出，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、 398.1、399.1、400.2处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰、在438.1、439.1、 440.2左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质L1 (C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与相关物质L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符，详见附图27B。

表27

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.2	[M’+H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.2,440.2	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:氘代甲醇(CD3OD)_400MHz)的化学位移及归属如下：相关物质L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合，详见附图28。

表28

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪；

碳谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下表29：

表29

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34-20.37	仲碳	2	1,1’
21.74	伯碳	1	6
				35.08-35.20	仲碳	2	3,3’
44.47-44.86	叔碳	2	2,2’
				74.83	仲碳	1	5
194.23	季碳	1	7

¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、 1个不饱和季碳峰，这与所示相关物质L1的分子结构相符，详见附图29。

4)Q NMR

其是采用BrukerAVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(Coumarin，99.74％)，如图30所示，测定结果如下表30所示：

表30 QNMR测试结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

从上表中可以看出，其标定含量为89.8质量％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；详见附图31，190nm处为最大紫外吸收波长。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围： 4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下表31所示：谱图见附图32。

表31

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3420.26,3253.53,3128.09	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2978.35,2937.71,2873.24	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1633.45	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1363.15,1336.41	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1047.80	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

7)旋光度(OR)

旋光仪:AntonPaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水),25℃；

结果如下表32-1所示：

表32-1

重量(mg)	体积(mL)	C(g/100mL)	旋光度	SpecificRotation(比旋度)
					24.95	5	0.499	+0.0381°	+7.635°

8)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图33A，图中，第一个峰左极限为134.46℃，峰值为150.29℃，第二个峰左极限为154.94℃，峰值为175.96℃，右极限为245.06℃。

9)液相色谱(HPLC)

HPLC的操作条件为：仪器型号：SHIMADZU LC-20AB,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSH C18，4.6*150mm，3.5μm)，以水 (+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸) 为流动相B，按下表表32-2程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表32-2梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(mL/min)
				0.01	95	5	1.0
5.00	82	18	1.0
				10.00	80	20	1.0
20.00	10	90	1.0
				20.01	95	5	1.0
28.00	95	5	1.0

谱图如附图33B所示。

从图33B中可以看出保留时间为7.816min时，出现了化合物L1的峰。

2.化合物L2的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200LC&Agilent 6110MSD

所用的HPLC-MS条件如下：

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq, 2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm和 215nm(DAD检测器)，柱温为50℃。检测结果见图34A-1，图34A-2。

表33-1梯度洗脱程序

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(mL/min)
				0.00	10	90	1.2
1.50	10	90	1.2

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

MS检测结果如表33-2所示，该相关物质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt,因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、 400.0处出现[M’+H]⁺峰是样品准分子离子峰、在438.1、439.1、440.1左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于相关物质L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt) 的分子量为397.33，质谱信息与相关物质L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符，详见附图34B。

表33-2

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.0	[M’+H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.1,440.1	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪，

氢谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下：相关物质L2 (C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据如下表34所示，与相关物质L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合，详见附图35。

表34

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.28-1.30	m	3	6
1.52-1.65	m	2	1,1’
				2.07-2.18	m	2	1,1’
2.61-2.98	m	6	3,3’,2,2’
				4.07-4.16	m	1	5

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(CD3OD_400MHz)的化学位移及归属如下表35所示：

表35

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.21-20.48	仲碳	2	1,1’
21.83	伯碳	1	6
				35.20	仲碳	2	3,3’
44.40-45.05	叔碳	2	2,2’
				74.85	仲碳	1	5
194.21	季碳	1	7

¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、 1个不饱和季碳峰，详见附图36，这与所示相关物质L2的分子结构相符。

4)QNMR：

其是采用BrukerAVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD3OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(Coumarin，99.74％)，如图37所示，测定结果如下表36所示：

表36

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

从上表中可以看出，其标定含量为93.2％。

5)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图38，190nm处为最大紫外吸收波长。

6)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围： 4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下表37所示：谱图见附图39。

表37

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3419.33,3216.73,3133.27	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2974.96,2936.82,2868.12	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1637.12	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1350.04,1302.20	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1110.91	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1046.93	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

7)旋光度(OR)

旋光仪:AntonPaarMCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(water),25℃；

结果如下表38-1所示:

表38-1

8)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图40A，图中，第一个峰的左极限为96.08℃，峰值为124.04℃，第二个峰的左极限为154.33℃，峰值为179.13℃，第三个峰的左极限为22.80℃，峰值为232.55℃，右极限为280.40℃。

9)液相色谱(HPLC)

HPLC的操作条件为，仪器型号：SHIMADZU LC-20AB,用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSH C18，4.6*150mm，3.5μm)，以水 (+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸) 为流动相B，按下表38-2程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表38-2梯度洗脱程序

谱图如附图40B所示。

从图40B中可以看出保留时间为8.795min时，出现了化合物L2的峰。

实施例7：洛铂中有关物质的检测方法

照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验

色谱仪器型号；SHIMADZU LC-20AD；用硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4- 甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(Daicel Chiralcel OZ-3，4.6*150mm，3.0μm)，以正己烷-乙醇(体积比65:35)为流动相，流速为每分钟1.0ml，检测波长为 210nm，柱温为35℃，等度洗脱40min。系统适用性试验溶液连续进样6次，洛铂非对映异构体I峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％，洛铂非对映异构体II 峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％。

供试品溶液的制备

取洛铂待测样品(本实施例中采用根据专利CN 102020679B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，在各实施例中涉及洛铂含量的地方均按照洛铂无水物计量)约100mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

系统适用性试验溶液/1％对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为1％对照溶液。

测定法

取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至 40分钟。供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位；具体测试结果如图41所示。由图可以看出，t＝8.550min时，出现洛铂非对映体II的峰；t＝10.062时出现洛铂非对映体I的峰；t＝11.570min 时，出现有关物质L1的峰；t＝18.436min时，出现有关物质H1的峰；t＝22.043min 时，出现有关物质H2和G1、G2的峰；t＝30.611min时，出现有关物质L2的峰；有关物质G1、有关物质G2、有关物质H2的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为2.58，有关物质H1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为 2.16，有关物质L1的相对保留时间(相对于洛铂)约为1.35，有关物质L2的相对保留时间(相对于洛铂非非对映体II)约为3.58；按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，有关物质H1、有关物质L1、有关物质L2各不得过 0.5％(即不得超过对照溶液中主成分的峰面积一半)，有关物质G1、有关物质 G2和有关物质H2的总和不得超1.0％(即不得超过对照溶液中主成分的峰面积)。

有关物质G1、G2、H1、H2、L1、L2标识的典型图谱，有关物质的图谱见附图41。

实施例8：检测方法

照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验

色谱仪器型号；SHIMADZU LC-20AD

用硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DaicelChiralcel OZ-3，4.6*150mm，3.0um)，以正己烷-乙醇(体积比60:40)为流动相，流速为每分钟0.8ml，检测波长为210nm，柱温为30℃，等度洗脱50min。系统适用性试验溶液连续进样6次，洛铂非对映异构体I峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％，洛铂非对映异构体II峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％。

供试品溶液的制备

取洛铂待测样品(本实施例中采用根据专利CN 102020679B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，洛铂含量以洛铂无水物计)约100mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

系统适用性试验溶液/1％对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为1％对照溶液。

测定法

取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至 40分钟。供试品溶液色谱图中如有相关物质峰，以相关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：相关物质G1、相关物质G2、相关物质H2的相对保留时间 (相对于洛铂非对映体II)约为2.48，相关物质H1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为2.13，相关物质L1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体 II)约为1.38，相关物质L2的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为3.56；按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，相关物质H1、相关物质L1、相关物质L2各不得过0.5％，相关物质G1、相关物质G2和相关物质H2的总和不得超1.0％。

相关物质G1、G2、H1、H2、L1、L2标识的典型图谱同实施例7一样。

实施例9：洛铂中有关物质的检测方法

照高效液相法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验

色谱仪器型号；SHIMADZU LC-20AD

用硅胶表面涂敷有纤维素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)为填充剂(DaicelChiralcel OZ-3，4.6*150mm，3.0um)，以正已烷-乙醇(70:30)为流动相，流速为每分钟1.5ml，检测波长为210nm，柱温为40℃，等度洗脱40min。系统适用性试验溶液连续进样6次，洛铂非对映异构体I峰面积的相对标准偏差应不大于 4.0％，洛铂非对映异构体II峰面积的相对标准偏差应不大于4.0％。

供试品溶液的制备

取洛铂待测样品(本实施例中采用根据专利CN 102020679B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，涉及到洛铂含量是以无水物计)约100mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

系统适用性试验溶液/1％对照溶液的制备

精密量取供试品溶液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为1％对照溶液。

测定法

取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至 40分钟。供试品溶液色谱图中如有相关物质峰，以相关物质标识典型色谱图中的色谱峰进行定位：相关物质G1、相关物质G2、相关物质H2的相对保留时间 (相对于洛铂非对映体II)约为2.62，相关物质H1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为2.19，相关物质L1的相对保留时间(相对于洛铂非对映体 II)约为1.36，相关物质L2的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为3.52；按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，相关物质H1、相关物质L1、相关物质L2各不得过0.5％，相关物质G1、相关物质G2和相关物质H2的总和不得超1.0％。

相关物质G1、G2、H1、H2、L1、L2标识的典型图谱同实施例7一样。

实施例10：体外抗肿瘤活性测定(本发明相关物质的活性测定实验)

下面对前述实施例中制备的物质H混合物、G1、G2、L1和L2进行活性检测实验描述如下。

一、试剂及耗材

1.细胞株

细胞株名称如下表39所示。

表39

2.DMEM培养基，中国Procell，货号：PM150210

3.MEM培养基，中国Procell，货号：PM150411

4.McCoy’s 5A培养基，中国Procell，货号：PM150710

5.Ham's F-12培养基，中国Procell，货号：PM150810

6.Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572

7.96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610

8.Envision，美国PerkinElmer

9.FBS，Lonsera，货号：S711-001S

10.丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422

11.Insulin，中国上海源培，货号：S454

12.β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985

13.DMSO，美国Sigma，货号：D8418

14.Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120

15.0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228

16.RPMI-1640培养基，中国Procell，货号：PM150110

17..IMDM培养基，中国Procell，货号：PM150510

二、溶液与缓冲液

1.细胞生长培养基

配置完毕后，储存在4℃备用；其中，培养基如下表40所示。

表40

细胞名称	培养基
		HCCC-9810	RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
NCI-H460	RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
		MDA-MB-453	DMEM+10％FBS+1％P/S
DU 145	MEM+10％FBS+1％P/S
		SK-OV-3	McCoy's5A+10％FBS+1％P/S
K562	RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
		Jurkat Clone E6-1	RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
AGS	F-12+10％FBS+1％P/S
		HL-60	IMDM+20％FBS+1％P/S
SK-NEP-1	McCoy’s5A+15％FBS+1％P/S
		95-D	RPMI-1640+10％FBS+1％P/S
THP-1	RPMI-1640+10％FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1％P/S
		OVCAR-3	RPMI-1640+20％FBS+0.01mg/mlInsulin+1％P/S

注：上表中％均为体积百分比。

2.Heat-inactivated FBS热灭活血清

将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。

3.化合物处理：

将化合物3.13g溶解于DMSO中配制浓度为1mM的溶液在-20℃下保存待用。阳性对照药为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP，是一种天然产物分离最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus，本实验为商购品，购自 MedChemExpress(MCE)、产品名称staurosporine、货号HY-15141。

二、实验方法：

复苏细胞

将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃， 5体积％CO₂培养。

细胞传代

细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶消化细胞(由025g胰酶加入100mlpbs溶液配制而成)，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1 次。

细胞接种及药物处理

化合物工作液浓度的配制

化合物单一浓度测试

根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，最终化合物浓度化合物如下所示，化合物的测试浓度为10微摩尔，化合物的孵育时间为72小时。

化合物IC₅₀测试

根据检测要求，实验当天，将本发明待测活性的相关物质化合物使用DMSO 稀释至1mM母液作为最高浓度，并进行2倍，3倍或5倍梯度稀释，再用培养基将每一个浓度点进一步稀释到5X最终浓度的工作液。

细胞接种及药物处理

1.检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表表41所示：

表41

2.根据实验要求，每孔加入20μL化合物工作液，37℃，5体积％CO₂培养箱，孵育72小时。

3.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega、货号是G7572、名称是 celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。

4.计算

细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％

实验结果：

吸光度原始数据及％Cell Viability

测定的剂量-效应曲线见附图42A-1到图42K-2。

化合物的IC₅₀值如下表42所示：

表42

通过上述活性数据可以看出，本发明相关物质对人卵巢癌细胞株Jurkat CloneE6-1和SK-NEP-1的抑制活性达到了nm级别，对其他的肿瘤细胞也就有一定的抑制活性，一般活性在5μM以下。

单一浓度10μM的化合物的抑制活性如下表43所示。

表43

通过上述数据可以看出，本发明相关物质在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对Jurkat Clone E6-1、HL-60、THP-1和SK-NEP-1 的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。

实施例11：检测方法的方法学验证

为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对前面实施例中本发明洛铂中有关物质的检测方法的专属性、线性及范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)、精密性、溶液稳定性、耐用性等方面进行说明：

1、专属性

精密量取空白溶液(即甲醇溶液)、分离度溶液RS(各化合物浓度为 0.1mg/mL)各20uL，注入液相色谱仪，结果如表1所示，洛铂主峰与相关物质峰分离度大于1.5。对于相关物质峰中H2和G1及G2分离度较差，做合并控制，专属性结果如下表44所示，具体图谱详见附图38和39。

表44

2、灵敏度

取洛铂对照品溶液和相关物质H溶液、相关物质G1溶液、相关物质G2溶液、相关物质L1溶液、相关物质L2溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)10为定量限。洛铂定量限浓度为0.0203mg/mL，相关物质H1定量限浓度为 0.0197mg/mL，相关物质H2定量限浓度为0.0197mg/mL，相关物质G1定量限浓度为0.0200mg/mL，相关物质G2定量限浓度为0.0200mg/mL，相关物质L1 定量限浓度为0.008mg/mL，相关物质L2定量限浓度为0.008mg/mL，定量限结果如下表45所示。

表45

3、线性

以洛铂非对映体Ⅱ的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在3.994mg/mL～6.04mg/mL范围内洛铂非对映体Ⅱ的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8595033.2484X-2155759.5499，相关系数R²为 0.9934，表明线性关系良好，详见附图40-47。

以洛铂非对映体Ⅰ的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在3.994mg/mL～5.965mg/mL范围内洛铂非对映体Ⅰ的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8027255.9361X-2805049.4891，相关系数R²为 0.9977，表明线性关系良好。

以相关物质H2的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0236mg/mL～0.1180mg/mL范围内相关物质H2的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8003691.9295X+104.8500，相关系数R²为0.9997，表明线性关系良好。

以相关物质H1的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0256mg/mL～0.1278mg/mL范围内相关物质H1的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝8282678.6134X+1774.0500，相关系数R²为0.9999，表明线性关系良好。

以相关物质G1的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0501mg/mL～0.2505mg/mL范围内相关物质G1的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝7400098.8024X-13089.7750，相关系数R²为1.0000，表明线性关系良好。

以相关物质G2的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0500mg/mL～0.2500mg/mL范围内相关物质G2的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝6093148.0000X+8425.1000，相关系数R²为0.9998，表明线性关系良好。

以相关物质L1的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0202mg/mL～0.1008mg/mL范围内相关物质L1的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝7627070.9325X+1812.0250，相关系数R²为1.0000，表明线性关系良好。

以相关物质L2的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如下：在0.0200mg/mL～0.1002mg/mL范围内相关物质L2的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝7893984.5309X+5247.3750，相关系数R²为0.9989，表明线性关系良好。

4、精密度

由实验员A和B分别配制系统适用性溶液，然后分别精密量取系统适用性溶液20uL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如下表46所示，洛铂非对映体比例(Ⅰ：Ⅱ)的RSD＜0.5％，精密度良好。

表46

由实验员A和B分别配制样品溶液，然后分别精密量取各样品溶液20uL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如下表47所示，各相关物质含量的RSD(n＝6)＜5％、RSD(n＝12)＜5％，精密度良好。

表47

5、准确度

洛铂非对映体和各相关物质分别平行配制3份50％限度浓度、3份限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察各自的准确度。结果如表48所示。

洛铂非对映体Ⅰ的回收率在99％～102％之间，洛铂非对映体Ⅱ的回收率为 98％～100％之间；

50％限度浓度下，相关物质H1的回收率在100％～105％之间，相关物质H2 的回收率在100％～105％之间，相关物质G1的回收率在105％～110％之间，相关物质G2的回收率在95％～105％之间，相关物质L1的回收率在90％～100％之间，相关物质L2的回收率在100％～108％之间；

100％限度浓度下，相关物质H1的回收率在100％～105％之间，相关物质 H2的回收率在95％～110％之间，相关物质G1的回收率在98％～102％之间，相关物质G2的回收率在98％～102％之间，相关物质L1的回收率在95％～100％之间，相关物质L2的回收率在105％～108％之间；

150％限度浓度下，相关物质H1的回收率在100％～105％之间，相关物质H2的回收率在100％～105％之间，相关物质G1的回收率在100％～102％之间，相关物质G2的回收率在100％～105％之间，相关物质L1的回收率在95％～100％之间，相关物质L2的回收率在105％～108％之间；

由此证明该方法的准确度良好。

表48

备注：S_EE＝(每个时间间隔溶液中非对映体比例/第一针色谱图中非对映体比例)×100％；

S_STD＝(每个时间间隔溶液中洛铂峰面积/第一针色谱图中洛铂峰面积)×100％；

S_im-X＝(每个时间间隔溶液中各相关物质含量/第一针色谱图中各相关物质含量)×100％；

6、耐用性

取系统适用性溶液，适当调整液相色谱系统中的参数，考察系统条件变化后的各相关物质含量检测情况，结果如下表49所示，系统条件微小变动后，各相关物质U％在92％～102％之间，表明该法的耐用性良好。

表49

备注：U_iso＝(改变条件后溶液中洛铂非对映体Ⅱ与洛铂主峰的峰面积比/改变条件前溶液中洛铂非对映体Ⅱ与洛铂主峰的峰面积比)×100％；

U_im-X＝(改变条件后溶液中各相关物质的含量/改变条件前溶液中各相关物质含量)×100％。