β-谷甾醇在缓解4-硝基苯酚所致生殖毒性中的应用
阅读说明：本技术 β-谷甾醇在缓解4-硝基苯酚所致生殖毒性中的应用 (Application of beta-sitosterol in relieving reproductive toxicity caused by 4-nitrophenol ) 是由 张永辉 刘冬梅 卢婷婷 李峰 于 2020-07-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了β-谷甾醇在缓解4-硝基苯酚所致生殖毒性中的应用,属于生物医药技术领域。本发明的研究表明,对于4-硝基苯酚所引起的TM3细胞形态损伤及凋亡现象,β-谷甾醇能够起到明显的保护作用,同时,β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的TM3细胞睾酮分泌量具有显著的保护干预效果。本发明对于β-谷甾醇对4-硝基苯酚毒性的干扰作用及其作用机制的探索和研究,能够对人类预防及治疗4-硝基苯酚引起的雄性生殖疾病提供重要依据,研究具有实际意义。(The invention discloses application of beta-sitosterol in relieving reproductive toxicity caused by 4-nitrophenol, belonging to the technical field of biological medicines. The research of the invention shows that the beta-sitosterol can play an obvious role in protecting the morphological damage and apoptosis of TM3 cells caused by 4-nitrophenol, and meanwhile, the beta-sitosterol has an obvious protective intervention effect on the testosterone secretion of TM3 cells exposed by the 4-nitrophenol. The invention can provide important basis for human beings to prevent and treat male reproductive diseases caused by 4-nitrophenol by exploring and researching the interference effect of beta-sitosterol on the toxicity of 4-nitrophenol and the action mechanism thereof, and has practical significance for research.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及β-谷甾醇在缓解4-硝基苯酚所致生殖毒性中的应用。
背景技术
4-硝基苯酚是一种典型环境内分泌干扰物，广泛应用于农药、杀菌剂、染料、皮革防腐剂和医药制造。环境中4-硝基苯酚污染主要来源于工农业生产、汽车尾气颗粒物质以及农药杀虫剂代谢产物。4-硝基苯酚可以通过皮肤、呼吸系统、消化系统等轻易进入机体。4-硝基苯酚不易被生物降解，具有生物富集效应，低剂量的4-硝基苯酚能够通过食物链富集对处于食物链顶端的人类产生较强毒性作用。
4-硝基苯酚的内分泌干扰效应主要表现为类***活性和抗雄激素活性，能够扰乱机体类固醇激素信号通路，具有生殖毒性。现有关于4-硝基苯酚生殖毒性的研究主要集中在毒性指标的观察监测，对其作用机理的研究较少，导致4-硝基苯酚的解毒脱毒方法的研究进展缓慢。工业上4-硝基苯酚的脱毒方法主要为物理吸附或化学降解，由于吸附剂残留和化学降解物毒性等问题，近年来4-硝基苯酚的生物降解方法得到越来越多的关注。植物提取物作为一种较为安全的食品添加物质，受到越来越多的重视。
β-谷甾醇是一种存在于植物中类似于环状醇结构的天然活性物质，是植物细胞膜的重要组成成分，同时也是多种激素、维生素D及甾体化合物合成的前体，多数植物性食物中都含有一定量的β-谷甾醇，其中植物油、种子、坚果、谷物以及豆类中β-谷甾醇含量尤为丰富，它是植物代谢的终产物之一，并以游离型脂肪酸酯和糖苷等形式广泛存在于植物的根、茎、叶、果实和种子中。人类及动物日常摄取的β-谷甾醇具有降血脂降低患心脑血管疾病风险、抗炎、抗氧化、提高免疫力、抗癌、调节生长和类激素功能等多种作用，其中在抑制胆固醇吸收降低血浆总胆固醇水平和患心脑血管疾病风险方面的研究比较深入，但作为4-硝基苯酚雄性生殖毒性干预剂的应用未见报道。
发明内容
为了解决现有4-硝基苯酚的危害机制研究和防控措施的不足，本发明提供了β-谷甾醇的一种新应用，即β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的小鼠***细胞TM3生殖毒性的干预作用。本发明通过体外试验的结果，发现了β-谷甾醇应用于4-硝基苯酚生殖毒性细胞实验中，对4-硝基苯酚引起的生殖细胞损伤具有较好的缓解作用。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
β-谷甾醇在制备缓解4-硝基苯酚所致动物生殖毒性的药物中的应用。
进一步地，所述生殖毒性是指雄性动物的生殖毒性。
更进一步地，所述生殖毒性是指4-硝基苯酚对雄性动物生殖细胞的生殖毒性。
进一步优选地，所述雄性动物生殖细胞为TM3细胞。
β-谷甾醇在制备缓解4-硝基苯酚所致生殖细胞损伤和/或生殖细胞凋亡的药物中的应用。
β-谷甾醇在制备缓解4-硝基苯酚所致生殖细胞ROS升高的药物中的应用。
β-谷甾醇在制备上述药物中的应用均在本发明的保护范围之内。
本发明的研究表明，对于4-硝基苯酚所引起的TM3细胞形态损伤及凋亡现象，β-谷甾醇能够起到明显的保护作用，同时，β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的TM3细胞睾酮分泌量具有显著的保护干预效果。
附图说明
图1为本发明的实验技术路线图。
图2为实施例1中各浓度β-谷甾醇及4-硝基苯酚作用后的细胞活性率。
图3和图4实施例2中为β-谷甾醇及4-硝基苯酚对细胞凋亡的影响。
图5为实施例3中β-谷甾醇及4-硝基苯酚刺激24 h后ROS的水平。
图6和7为实施例4中β-谷甾醇及4-硝基苯酚作用24h后睾酮合成途径关键基因表达水平。
以上附图中：Control为对照组，PNP为4-硝基苯酚组，PNP+β-sitosterol为4-硝基苯酚+β-谷甾醇组。
具体实施方式
本发明首先采用MTT法检测β-谷甾醇对4-硝基苯酚的生殖毒性是否有抑制作用及起抑制作用的浓度梯度，最终确定合适的浓度梯度。后续还进行了深入研究，包括：化学发光法（chemiluminescence，CL）检测细胞内活性氧（reactie oxygen species，ROS）的水平；流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡情况；RT-PCR法检测StAR、3β-HSD等在睾酮合成中起调控作用的基因mRNA表达量。
MTT结果表明，在初步确定的几个浓度中，当β-谷甾醇浓度为10-20 μM/L时，表现出对4-硝基苯酚生殖毒性的干预作用，能够显著降低4-硝基苯酚对细胞活性的损伤。细胞凋亡率结果表明，对于4-硝基苯酚所引起的细胞凋亡现象，β-谷甾醇能够起到明显的保护作用。ROS检测结果表明，β-谷甾醇对于4-硝基苯酚引起的TM3细胞ROS变化能起到一定的保护干预作用。RT-PCR结果，对TM3细胞睾酮合成途径中起关键作用的StAR、3β-HSD的mRNA表达水平进行检测，4-硝基苯酚组的StAR、3β-HSD水平均显著降低，而与4-硝基苯酚组相比，10、20 μmol/L β-谷甾醇干预后的StAR和3β-HSD mRNA表达量均显著升高。
由上述实验结果发明人得出以下结论：β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的TM3细胞凋亡有抑制作用；β-谷甾醇可能通过降低4-硝基苯酚暴露的TM3细胞中ROS水平抑制细胞；β-谷甾醇能提高4-硝基苯酚暴露的TM3细胞睾酮合成通路中的关键调节蛋白StAR、3β-HSDmRNA的表达。总之，β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的TM3细胞活性下降、细胞凋亡和ROS增加等功能损伤具有较好的营养干预保护作用。
本发明的研究成果对于了解β-谷甾醇的功能及发挥生殖毒性干预功能的机制等方面有一定的意义。β-谷甾醇不仅有保健功能，而且还对一些毒性物质对生物体的危害具有重要的预防治疗作用，对于β-谷甾醇对4-硝基苯酚毒性的干扰作用及其作用机制的探索和研究，能够对人类预防及治疗4-硝基苯酚引起的雄性生殖疾病提供重要依据，研究具有实际意义。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明的研究技术路线如附图1所示。本发明预选用抗氧化能力较强的β-谷甾醇为目标物，研究β-谷甾醇对4-硝基苯酚暴露的TM3细胞损伤的可能解毒途径和机制。
本发明采用小鼠***细胞系TM3作为实验模型，以实验探索的4-硝基苯酚对TM3细胞活性抑制作用较明显的浓度（10 μM/L）对细胞进行致毒造模，然后通过MTT法来筛选β-谷甾醇的适宜浓度，采用显微镜观察细胞形态及大小变化。进而通过研究TM3细胞ROS的水平变化等来探讨β-谷甾醇对4-硝基苯酚毒性作用的干预作用及具体机制。最后通过RT-PCR法来检测睾酮酮合成过程中StAR、3β-HSD等mRNA的表达量。
另外，以下实施例中，所有检测所得结果都是用均数±标准误（X±SE）进行表示，并用Graphpad Prism5软件对数据进行统计分析，*p＜0.05表示结果有统计学意义。
实施例1
MTT法筛选β-谷甾醇干预浓度
实验方法如下：
（1）细胞培养及接种细胞培养至对数期，消化、离心后，将沉淀稀释为4×104个/mL，铺于96孔板，每个孔内约加200 μL悬液；
（2）96孔板接种细胞24 h，于第一个板的相应组内加经DMEM/F12培养液稀释的β-谷甾醇溶液，除对照组外，使每组每孔β-谷甾醇终浓度分别为5、10、20、40、80 μM/L；在第二个96孔板中加入用DMEM/F12培养液稀释的β-谷甾醇溶液及4-硝基苯酚溶液，除对照组外，使每组每孔β-谷甾醇终浓度分别为5、10、20、40、80 μM/L，且每组每孔的4-硝基苯酚浓度为10 μM/L；重复孔及空白组的设置同上；
（3）各浓度β-谷甾醇及4-硝基苯酚作用24 h以后，去除液体，换成10 μL的MTT试剂，放在37℃；
（4）MTT作用4 h后去除孔内的液体，换成200 μL的DMSO试剂，将孔板放在脱色摇床上摇匀10min左右，然后检测各组吸光值；
（5）通过Graphpad软件分析β-谷甾醇对TM3细胞活性的作用及对4-硝基苯酚的抑制情况（用于分析的各孔吸光值均应减去相应空白组的吸光值），通过分析比较选择合适的β-谷甾醇浓度梯度（10 μmol/L）用于后续实验。
如图2所示，MTT结果表明，4-硝基苯酚作用后使细胞活性显著下降，对细胞活性的抑制率接近20%；10-80 μM/L浓度的β-谷甾醇对4-硝基苯酚所引起的细胞活性下降均起到了干预保护作用，使细胞活性上升。其中，10、20 μmol/L浓度的β-谷甾醇对4-硝基苯的制备的干预作用显著，结果有统计学意义（*P ＜ 0.05）。
实施例2
Hoechst 33258法检测β-谷甾醇对4-硝基苯酚诱导的细胞凋亡的抑制作用
实验方法如下：
（1）取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入TM3细胞培养过夜，使约为50%-80%满。
（2）β-谷甾醇和4-硝基苯刺激细胞后，吸尽培养液，加入0.5mL固定液，固定10分钟。
（3）去固定液，用PBS在摇床上洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。
（4）加入0.5mL Hoechst 33258染色液，摇床上染色5分钟。
（5）去染色液，用PBS摇床上洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。
（4）滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。
如图3和图4 所示，4-硝基苯酚刺激细胞24 h后，细胞凋亡率显著升高，而加入β-谷甾醇干预后细胞凋亡比率明显降低，且当β-谷甾醇浓度为10 μM/L时，对4-硝基苯酚的干预作用显著，统计结果具有统计学意义（*P＜0.05）。上述结果说明β-谷甾醇能够降低4-硝基苯酚引起的凋亡现象，且干预效果与其剂量相关。
实施例3
荧光酶标仪测定β-谷甾醇对4-硝基苯酚引起的ROS变化的影响作用
实验方法如下：
（1）DCFH-DA 溶液的配制：按照 1:1000的比例将DCFH-DA用DMEM/F12培养液进行稀释，使终浓度为10 μM/L；
（2）加药处理：24 h后，加DMEM/F12稀释的β-谷甾醇溶液及4-硝基苯酚溶液，除第一组外，使每组每孔所加的β-谷甾醇分别为10 μM/L，每组每孔的4-硝基苯酚浓度为10 μM/L；
（3）加药后立即或24 h后，吸出上清液，加入1mL DCFH-DA稀释液；
（4）37℃放置20 min，然后用DMEM/F12培养液洗3次，以充分除掉未被吸收利用的剩余DCFH-DA；
（5）消化、离心、重悬细胞后，将细胞接种到96孔板，各个孔均加200μL，设置4个复孔。荧光酶标仪检测最终ROS水平（激发波长：488 nm，发射波长：525 nm）。
如图5所示，4-硝基苯酚使细胞内ROS水平逐渐升高，而在β-谷甾醇的干预作用下，ROS水平与4-硝基苯酚单独作用时相比显著降低（*P ＜ 0.05）。
实施例4
RT-PCR检测β-谷甾醇对4-硝基苯酚引起的3β-HSD、StAR等mRNA的表达量变化的影响作用
实验方法如下：
（1）将培养至对数期的TM3细胞接种于6孔板内，每孔接种1mL（约2万细胞）；
（2）细胞培养24h后，分别换上含终浓度为10 mM/L浓度的4-硝基苯酚及10 μM/L β-谷甾醇的培养液。
（3）加药刺激24h收集细胞；
（4）根据试剂盒（RNA提取试剂盒Takara_ Code No. 9767，反转录试剂盒Takara_CodeNo. RR036A，RT-PCR试剂盒Takara_Code No. RR820A）说明书上的具体说明，提取RNA反转录为cDNA，然后PCR检测基因表达。
（5）得出数据后，对各组睾酮含量结果进行统计分析。
如图6和图7所示，4-硝基苯酚刺激细胞24 h后，3β-HSD、StAR等mRNA的表达量显著降低，而β-谷甾醇对4-硝基苯酚作用的干预作用显著。10 μM/L浓度的β-谷甾醇使StAR、3β-HSD等mRNA的表达量显著升高（*P ＜ 0.05）。