阅读说明：本技术 一种Baloxavir marboxil光学异构体的分离检测方法 (Separation detection method of Baloxavir marboxil optical isomer ) 是由 范晓梅 丘梅燕 张琛霞 赵蕾 朱丽娜 叶艳影 栾保磊 饶万兵 刘国柱 于 2019-03-05 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种光学异构体的分离检测方法,属于分析化学领域。所述方法具体涉及用液相色谱法分离测定Baloxavir marboxil及其光学异构体,其特征在于,以多糖衍生物为填料的手性色谱柱,以低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相。本发明的方法简单、快速、准确。(The invention relates to a separation and detection method of optical isomers, belonging to the field of analytical chemistry. The method particularly relates to the separation and determination of Baloxavir marboxil and optical isomers thereof by using a liquid chromatography, and is characterized in that a chiral chromatographic column with polysaccharide derivatives as fillers and a mixed solution of lower alkane and lower alcohol as a mobile phase. The method is simple, rapid and accurate.)

一种Baloxavir marboxil光学异构体的分离检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及用液相色谱法分离测定Baloxavir marboxil的异构体的方法。

背景技术

XOFLUZA(baloxavir marboxil)是一种抗病毒的PA内切酶抑制剂，可以抑制mRNA合成的起始，可用于治疗成人和儿童的甲型和乙型流感。Baloxavir marboxil的化学名称为({(12aR)-12-[(11S)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b,e]硫杂卓11-基]-6,8-二氧代-3,4,6,8,12,12a-六氢化-1H-[1,4]氧代联氮基[3,4-c]吡啶并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基}氧基)甲基碳酸甲酯，本发明中简写成RS，分子量为571.55，Baloxavir marboxil的分子式为C₂₇H₂₃F₂N₃O₇S，化学结构如下式所示：

Baloxavir marboxil分子中存在2个手性中心，在化学合成中会同时生成4种立体构型不同的光学异构体，这些异构体被列为Baloxavir marboxil的杂质，这些异构体的化学名分别为：({(12aS)-12-[(11R)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b,e]硫杂卓11-基]-6,8-二氧代-3,4,6,8,12,12a-六氢化-1H-[1,4]氧代联氮基[3,4-c]吡啶并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基}氧基)甲基碳酸甲酯，简写成SR；({(12aS)-12-[(11S)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b,e]硫杂卓11-基]-6,8-二氧代-3,4,6,8,12,12a-六氢化-1H-[1,4]氧代联氮基[3,4-c]吡啶并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基}氧基)甲基碳酸甲酯，简写成SS；({(12aR)-12-[(11R)-7,8-二氟-6,11-二氢二苯并[b,e]硫杂卓11-基]-6,8-二氧代-3,4,6,8,12,12a-六氢化-1H-[1,4]氧代联氮基[3,4-c]吡啶并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基}氧基)甲基碳酸甲酯，简写成RR。

在生产Baloxavir marboxil过程中需要进行质量控制，但目前，《美国药典》USP、《欧洲药典》EP及《中国药典》Ch.P.均没有收载Baloxavir marboxil，也未查到有关文献报道Baloxavir marboxil及其光学异构体的分离检测方法。为了更好更准确的控制产品中光学异构体的含量，保证原料药以及制剂产品的质量，本发明提供了适合于Baloxavirmarboxil及其光学异构体的含量测定的分析方法。本发明的方法能简单、快速、准确地分离、检测出Baloxavir marboxil及其光学异构体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用手性色谱柱分离测定Baloxavir marboxil及其光学异构体的方法，从而实现Baloxavir marboxil及其光学异构体的分离和测定。

一种用液相色谱法分离测定Baloxavir marboxil及其光学异构体的方法，其特征在于，采用以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相。

在一些实施例中，所述手性色谱柱的多糖衍生物填料为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、直链淀粉-三[(S)-α-甲苯基氨基甲酸酯]、纤维素-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)、纤维素-三[4-甲基苯甲酸酯]或纤维素-三(3,5-二氯苯基氨基甲酸酯)或其组合。在某些实施例中，多糖衍生物填料为直链淀粉-三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)。

所述手性色谱柱可选自CHIRALPAK AD-3、CHIRALPAK AD、CHIRALPAK AS-H、CHIRALCELOD-H、CHIRALCEL OJ-H或CHIRALPAK IC。在一些实施例中，所述的手性色谱柱为CHIRALPAK AD柱，具体为CHIRALPAK AD-H或CHIRALPAK AD-3，销售厂家是大赛璐药物手性技术(上海)有限公司，英文名DAICEL CHIRAL TECHNOLOGIES(CHINA)CO.,LTD。在一些实施例中，所述的手性色谱柱为CHIRALPAK AD-3。

在一些实施例中，所述低级烷烃是常见的烷烃，包括正己烷、正戊烷、正庚烷或环己烷或其组合，在某些实施例中为正己烷。

在一些实施例中，所述流动相中可以进一步含有有机酸。在一些实施例中，所述流动相中含有有机酸，如三氟乙酸(TFA)等。在一些实施例中，所述流动相的低级醇溶液中可以含有有机酸(如三氟乙酸等)，所述有机酸与低级醇的体积百分比为大约0.05％至大约0.5％。

在一些实施例中，所述低级醇为甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、异丙醇或其组合。在某些实施例中所述低级醇为乙醇。

在一些实施例中，所述流动相低级烷烃与低级醇溶液的体积比为60:40至80:20。在一些实施例中，所述流动相低级烷烃与低级醇溶液的体积比为70:30。在一些实施例中，所述流动相低级烷烃与低级醇溶液的体积比为60:40。在一些实施例中，所述流动相低级烷烃与低级醇溶液的体积比为80:20。

在一些实施例中，本发明所述的分离测定方法，可按以下步骤实现：

1)取Baloxavir marboxil或含Baloxavir marboxil的样品适量，用一定量的低级烷烃与低级醇的混合溶液作为稀释剂溶解样品；

2)设置仪器参数：流动相的流速、检测波长、色谱柱的柱箱温度；

3)取一定量步骤1)的溶液，注入高效液相色谱仪，完成Baloxavir marboxil及其光学异构体的分离测定。

步骤1)所述的Baloxavir marboxil可以是任意纯度的。

步骤1)所述的Baloxavir marboxil可以是任意光学纯度的。

步骤1)所述稀释剂的低级烷烃为正己烷、正戊烷、正庚烷或环己烷或其组合，所述的低级醇溶剂为甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、异丙醇或其组合。在一些实施例中，稀释剂中，所述低级烷烃为正己烷；在一些实施例中，所述的低级醇溶剂为乙醇。在某些实施例中，所述低级烷烃与低级醇的混合溶剂为正己烷与乙醇的混合溶剂；所述低级烷烃与低级醇的体积比(V/V)为50:50至10:90。在一些实施例中，稀释剂中，所述低级烷烃与低级醇的体积比(V/V)为1:4。

所述的稀释剂中每1ml稀释剂含Baloxavir marboxil样品0.5mg～4mg。在一些实施例中，步骤1)所述的稀释剂中每1ml稀释剂含Baloxavir marboxil样品2mg。

所述流动相的流速为0.5ml/min～1.5ml/min。在一些实施例中，流动相的流速为0.5ml/min；在一些实施例中，流动相的流速为0.8ml/min；在一些实施例中，流动相的流速为1.0ml/min。

所述检测波长为200nm至230nm。在一些实施例中，检测波长为210nm。

所述色谱柱柱箱温度为25℃～40℃。在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为25℃；在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为35℃；在一些实施例中，色谱柱柱箱温度为38℃。

所述样品溶液进样量为2μl～20μl。在一些实施例中，所述样品溶液进样量为5μl。在一些实施例中，所述样品溶液进样量为10μl。

在一些实施例中，本发明所述的分离测定方法，可按以下方法实现：

1)取Baloxavir marboxil或含Baloxavir marboxil的样品适量，用一定量的低级烷烃与低级醇的混合溶剂作为稀释剂溶解样品，并配制成每1ml含Baloxavir marboxil0.2mg～4mg的样品溶液；

2)设置流动相的流速为0.5ml/min～1.5ml/min，检测波长为200nm至230nm，色谱柱柱箱温度为25℃至40℃；

3)取步骤1)的样品溶液2μl～20μl，注入高效液相色谱仪，完成Baloxavirmarboxil及其光学异构体的分离测定。

本发明提供的方法中，高效液相色谱仪可为美国Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD-3，流动相为正己烷与乙醇(0.3％TFA，V/V)，体积比(V/V)为大约70:30。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD-3，流动相为正己烷与乙醇(0.3％TFA，V/V)，体积比(V/V)为大约80:20。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD-3，流动相为正己烷与乙醇(0.3％TFA，V/V)，体积比(V/V)为大约60:40。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD-H，流动相为正己烷与乙醇(0.3％TFA，V/V)，体积比(V/V)为大约70:30。

在一些实施例中，手性色谱柱为CHIRALPAK AD，流动相为正己烷与乙醇(0.3％TFA，V/V)，体积比(V/V)为大约70:30。

采用本发明所述的分离方法，分离检测Baloxavir marboxil及其光学异构体的时间在50分钟以内，在一些实施例中为40分钟以内，在一些实施例中为30分钟以内。

在上文或下文的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％或10％等差异。

本发明采用以多糖衍生物为填料的手性色谱柱，以低级烷烃与低级醇的混合溶液为流动相，可以将Baloxavir marboxil与其对映异构体进行有效分离，分离度达到1.5以上或2.5以上或5以上，完全基线分离，从而可以准确有效控制Baloxavir marboxil的质量。本发明的方法能简单、快速、准确的分离检测出Baloxavir marboxil及其光学异构体。

附图说明

图1Baloxavir marboxil对映异构体(SR构型)的高效液相色谱图；

图2Baloxavir marboxil对映异构体(SR构型)与非对映异构体(SS构型)的高效液相色谱图；

图3Baloxavir marboxil主化合物(RS构型)与非对映异构体(RR构型)的高效液相色谱图；

图4Baloxavir marboxil主化合物(RS构型)的高效液相色谱图；

图5示实施例2分离检测的高效液相色谱图；

图6示实施例3分离检测的高效液相色谱图；

图7示实施例3分离检测的高效液相色谱图；

图8示实施例4分离检测的高效液相色谱图；

图9示实施例4分离检测的高效液相色谱图；

图10示实施例5分离检测的高效液相色谱图；

图11示实施例5分离检测的高效液相色谱图；

图12示实施例6分离检测的高效液相色谱图；

图13示实施例6分离检测的高效液相色谱图；

图14示实施例7分离检测的高效液相色谱图；

图15示实施例7分离检测的高效液相色谱图；

图16示实施例8分离检测的高效液相色谱图；

图17示实施例8分离检测的高效液相色谱图；

图18示实施例9分离检测的高效液相色谱图；

图19示实施例9分离检测的高效液相色谱图；

所述附图中，横坐标表示保留时间，分钟(min)；纵坐标表示电信号，mAU。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种分离检测Baloxavir marboxil及其对映体的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

仪器与色谱柱的规格：美国Agilent 1260型高效液相色谱系统及工作站；自动进样；

实施例1-9：以CHIRALPAK AD手性色谱柱分离检测Baloxavir marboxil及其对映体

实施例1

仪器与条件

色谱柱：以CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm；

检测器：DAD(紫外检测器)，检测波长210nm；

流速：0.8mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)；

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取Baloxavir marboxil对映异构体(构型SR)样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对映异构体定位溶液。

取Baloxavir marboxil构型RS(主化合物)样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

分别取构型对映异构体定位溶液、构型SR+SS溶液、RS+RR溶液和供试品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图1、图2、图3、图4。图1中保留时间约13.49分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil对映异构体(SR构型)的色谱峰；图2中保留时间约17.86分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil非对映异构体SS构型的色谱峰；图3中保留时间约20.55分钟的色谱峰是为Baloxavir marboxil主化合物(RS构型)，保留时间约27分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil非对映异构体RR构型。

以上图1-图4证明，该检测方法能够将Baloxavir marboxil的4个构型异构体分离。本法可以用于Baloxavir marboxil及其异构体分离测定，从而用于质量监测。

实施例2

仪器与条件

色谱柱：以CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm；

检测器：DAD(紫外检测器)，检测波长210nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：35℃；

进样量：5μL；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)；

实验步骤

分别取Baloxavir marboxil混标样品(含有Baloxavir marboxil及其3种光学异构体)约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混标样品。

取Baloxavir marboxil混标样品溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图5。

图5中保留时间约11分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil对映异构体(SR构型)的色谱峰，保留时间约14分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil非对映异构体SS构型的色谱峰，保留时间约16分钟的色谱峰是为Baloxavir marboxil主化合物(RS构型)，保留时间约22分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil非对映异构体RR构型。

图5证明，Baloxavir marboxil与其3个构型杂质在流速为1.0mL/min的方法中，能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例3

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：25℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：60min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图6、图7.

图6中保留时间约25分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；保留时间约33分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RR构型的色谱峰。

图7中保留时间约15分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；保留时间约20分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SS构型的色谱峰。

图6、7证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在柱温为25℃时，4个色谱峰能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例4

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝80:20(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)；

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图8、图9.

图8中保留时间约28分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；保留时间约36分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RR构型的色谱峰。

图9中保留时间16分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；22分钟的色谱峰为Baloxavirmarboxil SS构型的色谱峰。

图8、9证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在洗脱比例为正己烷：乙醇(0.3％TFA，V/V)＝80:20时，4个色谱峰能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例5

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.5ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：60min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤：

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图10、图11.

图10中保留时间34分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；45分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RR构型的色谱峰。

图11中保留时间22分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；28分钟的色谱峰为Baloxavirmarboxil SS构型的色谱峰。

图10、11证明，Baloxavir marboxil与其3个构型杂质在流动相流速为0.5mL\min的方法中，能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例6

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：38℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图12、图13.

图12中保留时间约19分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；保留时间约26分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RR构型的色谱峰。

图13中保留时间约13分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；保留时间约17分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SS构型的色谱峰。

图12、13证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在柱温为38℃时，4个色谱峰能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例7

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-3 150*4.6mm，3μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝60:40(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图14、图15。

图14中保留时间约13.5分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；保留时间约17.5分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RR构型的色谱峰。

图15中保留时间约9分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；保留时间约11.5分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SS构型的色谱峰。

图14、15证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在洗脱比例为正己烷：乙醇(0.3％TFA)＝60:40时，4个色谱峰能够分离，该条件能用于Baloxavir marboxil的异构体质量监测。

实施例8

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD-H 250*4.6mm，5μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：40min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图16、图17.

图16中保留时间约29分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)的色谱峰；Baloxavirmarboxil RR构型的色谱峰未冲洗出来。

图17中保留时间约21.5分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；保留时间约28分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SS构型的色谱峰。

图16、17证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在AD-H柱子上，RS构型(主化合物)与其对映异构体(SR)能够分离，但是RS构型与SS构型分离情况不好，RR构型未能在该方法冲洗出来。该条件能用于Baloxavir marboxil的对映异构体质量监测。

实施例9

仪器与色谱条件：

色谱柱：CHIRALPAK AD 250*4.6mm，10μm

检测器：DAD(紫外检测器)

检测波长：210nm；

流速：0.8ml/min；

柱温：35℃；

进样量：5μl；

流动相A：正己烷

流动相B：乙醇(0.3％TFA，V/V)

洗脱比例：流动相A：流动相B＝70:30(V:V)

运行时间：80min；

稀释剂/空白溶液：乙醇：正己烷＝4:1(V:V)

实验步骤

取Baloxavir marboxil构型RS+RR样品约20mg，精密称定至10mL棕色量瓶，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型RS+RR溶液。

取Baloxavir marboxil构型SR+SS样品约20mg，精密称定至10ml棕色容量瓶中，用稀释剂超声溶解并稀释至刻度，摇匀，作为构型SR+SS溶液。

取构型RS+RR溶液、构型SR+SS溶液，按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，结果见图18、图19.

图18中保留时间约32分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil RS构型(主化合物)和构型RR的色谱峰。

图19中保留时间约20分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SR构型的色谱峰；保留时间约24分钟的色谱峰为Baloxavir marboxil SS构型的色谱峰。

图18、19证明，Baloxavir marboxil主峰与其他3个构型杂质在AD柱子上，RS构型(主化合物)与其对映异构体(SR)能够分离，但是RS构型与RR构型共出峰。该条件能用于Baloxavir marboxil的对映异构体质量监测。