一种同时检测母乳中九种重要位置异构体的方法
阅读说明：本技术 一种同时检测母乳中九种重要位置异构体的方法 (Method for simultaneously detecting nine important positional isomers in breast milk ) 是由 张兰威 陈玉洁 于 2019-03-06 设计创作，主要内容包括：本发明方法属于食品检测领域,涉及一种检测母乳中9种甘油三酯位置异构体(rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP,rac-LaOO/rac-OLaO,和rac-OPL/rac-PLO/rac-POL)的方法。本发明主要包括以下步骤：1)母乳中甘油三酯的定性2)一维反相色谱靶向收集目标甘油三酯分子；3)二维银离子HPLC APCI/MS检测九种位置异构体；4)检测方法在母乳中的应用。本发明方法能够同时检测9种母乳中位置异构体,并且具有操作简单、分离度好,稳定性高等优点。(The invention belongs to the field of food detection, and relates to a method for detecting 9 triglyceride positional isomers (rac-OPO/rac-OOP, rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO, and rac-OPL/rac-PLO/rac-POL) in breast milk. The invention mainly comprises the following steps: 1) characterization of triglycerides in breast milk 2) targeted collection of target triglyceride molecules by one-dimensional reverse phase chromatography; 3) detecting nine position isomers by two-dimensional silver ion HPLC APCI/MS; 4) the use of the detection method in breast milk. The method can simultaneously detect the position isomers in 9 breast milks, and has the advantages of simple operation, good separation degree, high stability and the like.)
技术领域
本发明属于脂质检测领域，本发明涉及一种同时检测母乳中九种重要位置异构体的方法。
背景技术
母乳脂不仅能够为婴儿提供50%的能量和必需脂肪酸并且不同的脂质结构具有不同的生理功能。甘油三酯是母乳脂质最主要的成分，约占母乳脂的97-98%。母乳甘油三酯中脂肪酸特殊的位置分布结合婴儿体内特殊的消化吸收条件造成婴儿体内脂肪消化吸收的特殊性。如饱和脂肪酸，尤其棕榈酸在Sn-2位分布时能够避免棕榈酸与钙离子形成皂钙，从而促进棕榈酸和钙离子的吸收。母乳中含有几十种甚至上百种甘油三酯，并且存在大量的同分异构体。而具有功能的往往只是其中某一种同分异构体，例如1,3-油酸-2棕榈酸（rac-OPO）和1,2-油酸-3-棕榈酸 (rac-OOP)两种位置异构体中，只有rac-OPO具有生理功能，有利于脂肪的消化吸收。
因此，母乳脂中甘油三酯同分异构体的研究有利于进一步研究甘油三酯结构与功能的关系。中国母乳中含量最高的甘油三酯为油酸-棕榈酸-亚油酸(OPL), 其次为OPO。OPL作为母乳中含量最丰富的ABC型甘油三酯，含有三种位置异构体rac-OPL，rac-PLO和rac-POL。月桂酸作为母乳中含量最多的中链脂肪酸，其组成的甘油三酯的位置异构体的组成也尤为重要。双油酸月桂酸酯（LaOO），是母乳含量母乳中含量最丰富的一种含有月桂酸的甘油三酯。LaOO同时含有俩种位置异构体rac-OLaO和rac-OOLa。
目前母乳中除双油酸棕榈酸甘油酯（OOP）和双棕榈酸-油酸甘油酯（PPO）的位置异构体能够通过色谱技术检测外，其他甘油三酯的位置异构体的色谱检测方法尚未报道。这形成了母乳成分更深层次研究的瓶颈，并为婴幼儿乳粉配方组织更深入仿母乳带来了困难。多种位置异构体同时检测方法的建立，突破了母乳甘油三酯成分检测的瓶颈，并且操作简单有利于生产过程中的成分监控。
发明内容
发明目的：提供一种同时检测母乳中甘油三酯 PPO(rac-POP/rac-PPO), OPO(rac-OOP/rac-OPO),LaOO(rac-LaOO/rac-OLaO),OPL(rac-OPL/rac-PLO/rac-POL)位置异构体的单柱二维液相色谱-APCI/MS的方法。该方法操作简单，能够实现母乳及婴幼儿配方奶粉中9种甘油三酯位置异构体的同时检测。
技术问题：本发明要解决的技术问题如下：1) 由于母乳中含有几十种甘油三酯分子；2) 二维色谱法排除了银离子色谱检测位置异构体过程中目标甘油三酯易与其他甘油三酯重叠现象；3) APCI/MS中提取色谱峰解决了rac-OPO和rac-LaOO的在色谱峰中的重叠现象，并且避免了其他甘油三酯分子的干扰；4) rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP,rac-LaOO/rac-OLaO,和rac-OPL/rac-PLO/ rac- POL九种甘油三酯在银离子色谱中的同时检测，简化了检测步骤，缩短了检测时间，为母乳中的成分检测提供了便利。
技术方案：本发明涉及一种同时检测母乳中九种位置异构体的方法。通过该方法，能够排除九种目标甘油三酯（rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO,和rac-OPL/rac-PLO /rac-POL）以外的甘油三酯的干扰。并且能够解决rac-OPO和rac-LaOO峰的重叠问题。同时监测rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO, 和rac-OPL/rac-PLO /rac-POL九种甘油三酯的位置异构体的含量。满足了操作简单，易于定量的要求。本发明采用的技术方案如下。
1. 准确获取OPO，PPO, LaOO，OPL甘油三酯分子组分：1）脂肪提取：样品用Folch法提取总脂，氮气吹干，然后用正己烷定容，过膜备用。2）甘油三酯反相色谱分离：HPLC C18柱，根据不同的ECN（碳原子当量）分离样品中的甘油三酯，将样品中的甘油三酯初步分离。液相梯度洗脱条件见表1:
表1C18非水相液相色谱流动相梯度洗脱条件
3）甘油三酯定性。采用ESI-MS/MS产生的离子碎片推断甘油三酯分子的结构。并且明确目标甘油三酯分子（OPO，PPO, LaOO, OPL）的保留时间。质谱条件如下：ESI离子源，fragmentor：70V，扫描范围：350~1200。4)目标甘油三酯分子的靶向收集。利用自动收集器，以2min/管的速度收集C18反向色谱的组分，将OPO，PPO, LaOO和OPL甘油三酯分子相应保留时间的试管收集起来，氮气吹干备用。
2.rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO, 和rac-OPL/rac-PLO /rac-POL九种位置异构体同时检测方法的建立。1）标准溶液配制：用正己烷溶解25mgrac-OPO、rac-OOP、rac-OLaO、rac-LaOO、rac-POP、rac-PPO、rac-OPL、rac-PLO、rac-POL九种标准品至25mL容量瓶中，配制成1mg/mL的标准储备液；2）银离子色谱液相条件的优化。采用银离子色谱柱，配合具有蒸发光散射检测器（ELSD）的高效液相色谱，对1 mg/L的混合标准品，进行检测。蒸发光检测器的条件为：漂移管温度恒定为40℃，喷雾气为氮气，压力为3.5bar。采用二氯甲烷、丙酮体系分别从流速和流动相梯度进行优化，进样体积 10μl。最终银离子色谱的液相梯度洗脱条件为：0-20 min 70%A+30%B, 20-21min 70%A+30%-57%A+43%B, 21-45 min 57%A+ 43%B, A 为正己烷, B 为正己烷:异丙醇 (99:2, v/v)，流速为0.5ml/min；3）银离子色谱HPLC-APCI/MS 的检测。采用阴离子色谱结合APCI/MS 检测器再次对1 mg/L的混合标准品，进行检测。质谱条件为：APCI离子源，fragmentor：70V，扫描范围：350~1200。
技术效果。1）本发明可以同时有效检测rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP,rac-LaOO/rac-OLaO, 和rac-OPL/rac-PLO /rac-POL九种位置异构体。有利于九种甘油三酯位置异构体的同时监测。并且利用二维液相色谱技术，能够有效快速获得目标甘油三酯组分，排除其他甘油三酯分子的干扰，实现了母乳等复杂样品中九种甘油三酯位置异构体的检测。2）本发明能够同时将rac-OPO/rac-OOP,rac-PPO/rac-POP, rac-LaOO/rac-OLaO,和rac-OPL/rac-PLO /rac-POL九种位置异构体分别进行分离（图1），且利用APCI/MS中的提取色谱功能将重叠的rac-OPO和rac-LaOO区别开，见图1和图2。
附图说明图中：图1是混合标准品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的总离子流图。图2是混合标准品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-OPO和rac-OOP的色谱图。图3是混合标准品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-LaOO和rac-OLaO的色谱图。图4是实例中母乳样品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的总离子流图。图5是实例中母乳样品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-PPO和rac-POP的色谱图。图6是实例中母乳样品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-OPO和rac-OOP的色谱图。图7是实例中母乳样品在银离子色谱HPLC APCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-LaOO和rac-OLaO的色谱图。图8是实例中母乳样品在银离子色谱HPLCAPCI/MS在本发明的洗脱条件下的提取的rac-PLO、rac-POL和rac-OPL的色谱图。
具体实施方式
：下面结合具体实施方式，进一步阐明本发明。应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施例：母乳样品，用刻度吸管移取2ml液体样品，加入40ml氯仿/甲醇（v:v，2:1），涡旋1min，2000rpm离心2min，取下层有机相，水相用20ml氯仿/甲醇（v:v，2:1）1次，合并有机相，旋转蒸干，备用。首先用表1中用的色谱条件将母乳样品中的TAGs进行一维分离，然后用银离子色谱HPLC APCI/MS进行二维检测。结果表明本发明能够有效将母乳样品中九种位置异构体的色谱峰提取出来，并且获得相对含量。母乳中rac-OPO与rac-OOP的相对含量比例为88.46%和11.54%；rac-OLaO与rac-LaOO的相对含量比例为73.40%和26.60%；rac-PPO与rac-POP的相对含量比例为93.92%和6.08%；rac-OPL、rac-PLO和rac-POL的相对含量为90.59%, 5.19%和4.22%。