阅读说明：本技术 牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮mdbk细胞 (Infectious bovine rhinotracheitis virus and mycoplasma bovis combined inactivated vaccine, preparation method thereof and suspension MDBK (multidrug-associated Virus) cells used in vaccine ) 是由 吴文学 王朋朋 格勒图 于 2020-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞。本发明提供了悬浮MDBK细胞,在此基础上建立了悬浮培养IBRV抗原病毒液的方法,采用该方法所得的IBRV抗原病毒液具有抗原含量高、抗原批量大、批次稳定等特点,而且避免了因培养基中加入的牛血清引起的副反应,在节约经济成本的同时又能生产出更加安全和高效的疫苗。同时本发明的IBRV与MB二联灭活疫苗一针可防两病,简化免疫程序,减少了动物的免疫次数,降低了动物的应激,也节省了劳动力,进一步降低了动物养殖的成本。(The invention provides a combined inactivated vaccine of infectious bovine rhinotracheitis virus and mycoplasma bovis, a preparation method thereof and a suspension MDBK cell used by the combined inactivated vaccine. The invention provides a suspension MDBK cell, and establishes a method for suspension culture of IBRV antigen virus liquid on the basis, the IBRV antigen virus liquid obtained by the method has the characteristics of high antigen content, large antigen batch, stable batch and the like, the side reaction caused by bovine serum added into a culture medium is avoided, and the safe and efficient vaccine can be produced while the economic cost is saved. Meanwhile, one needle of the IBRV and MB dual inactivated vaccine can prevent two diseases, simplifies the immunization procedure, reduces the immunization times of animals, reduces the stress of the animals, saves the labor force and further reduces the cost of animal breeding.)

牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方 法与所用悬浮MDBK细胞

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域中一种牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞。

背景技术

牛肾细胞(MDBK)是一株来源于表观正常的牛的肾脏的传代细胞系，其通常在含有胎牛血清的培养基中进行贴壁生长，其对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛病毒性腹泻/粘膜病毒(BVDV)等多种病毒均较为敏感。

牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)又称牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)，可引起奶牛及肉牛高热、食欲不振、咳嗽、流鼻涕和结膜炎等症状，导致牛传染性鼻气管炎。

牛支原体(MB)可引起牛呼吸系统相关疾病，如支气管肺炎，喉炎，咽炎等，同时牛支原体还可引起牛的***炎和关节炎，其与IBRV均是引起牛呼吸道综合征 (BRDC)的主要病原。

目前预防牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体感染的有效手段是免疫牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体的灭活疫苗。目前关于牛支原体疫苗的CN110420323A、CN109022314A、CN107050451A等专利文献均为单苗，有关IBRV疫苗的 CN106729692B等专利文献均未涉及牛支原体的预防，若要同时防控这两种病原需要分别免疫，这既增加了动物的应激，同时也影响了疫苗的使用效果。

发明内容

本发明所要解决的问题是如何制备抗原含量高、抗原批量大和/或批次稳定的疫苗；如何避免牛血清引起的副反应；和/或如何简化免疫程序，减少动物的免疫次数，降低动物的应激。

本发明的第一个目的是提供牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗的制备方法，包括：

1)用悬浮MDBK细胞培养牛传染性鼻气管炎病毒，得到牛传染性鼻气管炎病毒液，将所述牛传染性鼻气管炎病毒液进行灭活，得到灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液；用液体培养基培养牛支原体，得到牛支原体液，将所述牛支原体液进行灭活，得到灭活的牛支原体抗原液；

所述悬浮MDBK细胞按照包括如下步骤的方法制备：将贴壁MDBK细胞以低血清悬浮培养基传代培养，再以无血清悬浮培养基传代培养，获得生长性能好而且稳定的无血清悬浮培养MDBK细胞系，即为悬浮MDBK细胞；

所述低血清悬浮培养基是胎牛血清的体积含量为3％的液体培养基；所述无血清悬浮培养基是不含血清的液体培养基；

2)将所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分，得到牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

上述方法中，所述牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗为将所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分，和佐剂以一定比例混合，得到的牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

上述方法中，所述贴壁MDBK细胞为在含有10％胎牛血清的培养基中进行贴壁生长的牛肾细胞(MDBK)。

上述制备方法中，所述IBRV具体可用IBRV-SZH株；所述MB具体可用牛支原体PD株。

上述方法中，所述低血清悬浮培养基为向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；

所述无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为 0.1mg/ml。

上述方法中，所述以低血清悬浮培养基传代培养是用所述低血清悬浮培养基传代培养7代～15代(具体可为13代)，所述培养在悬浮条件下进行；所述以无血清悬浮培养基传代培养是用所述无血清悬浮培养基传代25代～45代(具体可为40代)，所述培养在悬浮条件下进行。

所述悬浮条件为100rpm(旋转半径15mm)。

所述悬浮为在摇床中震荡培养。所述摇床可为莱普特科学仪器(北京)有限公司0S-30型号的摇床。

上述方法中，所述传代，每代细胞接种密度为1×10⁶cells/ml，在100rpm/min、37℃、 5％CO₂条件下培养，每间隔48～72h传代。

上述方法中，所述用液体培养基培养牛支原体，所用液体培养基按照如下方法配制(以100ml体系为例)：取2.1g PPLO肉汤培养基，2.5g酵母浸出液，加80ml ddH₂O，高压灭菌，之后加20ml马血清(12000rpm/min离心10min，0.45μm滤器过滤)，加 100μl Amp(1g氨苄溶于10ml ddH₂O，0.45μm滤器过滤后分装)。上述方法中，所述牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗中，牛支原体抗原含量以灭活前的牛支原体计，牛传染性鼻气管炎病毒抗原含量以灭活前的牛传染性鼻气管炎病毒计，所述牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗中牛传染性鼻气管炎病毒抗原含量不低于0.5×10⁷TCID₅₀/ml和牛支原体抗原含量的不低于1×10⁸cfu/ml。

本发明的第二个目的是提供由上述的方法制备得到的牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

本发明的第三个目的是提供一种制备悬浮MDBK细胞的方法，包括将贴壁MDBK 细胞以低血清悬浮培养基传代培养，再以无血清悬浮培养基传代培养，获得的细胞即为悬浮MDBK细胞；所述低血清悬浮培养基是胎牛血清的体积含量为3％的液体培养基；所述无血清悬浮培养基是不含血清的液体培养基。

上述方法中，所述低血清悬浮培养基为向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；

所述无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为 0.1mg/ml。

上述方法中，所述以低血清悬浮培养基传代培养是用所述低血清悬浮培养基传代培养7代～15代(具体可为13代)，所述培养在悬浮条件下进行；所述以无血清悬浮培养基传代培养是用所述无血清悬浮培养基传代25代～45代(具体可为40代)，所述培养在悬浮条件下进行。

所述悬浮条件为100rpm(旋转半径15mm)。

所述悬浮为在摇床中震荡培养。所述摇床可为莱普特科学仪器(北京)有限公司0S-30型号的摇床。

上述方法中，所述传代，每代细胞接种密度为1×10⁶cells/ml，在100rpm/min、37℃、 5％CO₂条件下培养，每间隔48～72h传代。

本发明的第四个目的是提供由上述的方法制备得到的悬浮MDBK细胞。

本发明的第五个目的是提供如下Y1-Y7中的任一种应用：

Y1、所述悬浮MDBK细胞在悬浮培养病毒抗原中的应用；

Y2、所述悬浮MDBK细胞在悬浮培养IBRV抗原中的应用；

Y3、所述悬浮MDBK细胞在制备疫苗中的应用；

Y4、所述悬浮MDBK细胞在制备含有IBRV抗原的疫苗中的应用；

Y5、所述悬浮MDBK细胞在制备IBRV与MB二联灭活疫苗中的应用。

本发明还提供悬浮培养IBRV病毒液的方法，其为以所述悬浮MDBK细胞悬浮培养IBRV的方法，所述IBRV的接毒量为MOI＝0.1，接毒后72～96h(即细胞死亡率达到60％左右时)收毒，得到IBRV病毒液。

本发明还提供上述方法制备得到的IBRV病毒液。

本发明将牛肾细胞(MDBK)由贴壁生长驯化为可在无血清悬浮状态下生长，可以保证不同批次疫苗间的稳定性，在节约经济成本的同时，又能够生产出高质量的生物制品。本发明筛选了包括专利CN108570454A所涉及的培养基在内的五种培养基，选出更加适合MDBK细胞悬浮生长的无血清悬浮培养基，所驯化的悬浮MDBK细胞以0.3×10⁶～1×10⁶cells/ml的初始密度进行传代培养，在培养48～72h后MDBK细胞密度能达到6×10⁶～8×10⁶cells/ml。通过优化培养条件，细胞密度可达到7×10⁶～2.5 ×10⁷cells/ml，具有较为明显的优势。同专利CN108570454A与CN107201334A相比，本发明所驯化的悬浮MDBK细胞同样对IBRV等病原保持了较高的敏感性，可以用于疫苗病毒抗原的制备。在此基础上，本发明创新性的发明了一种可同时预防牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体这两种病原感染的二联灭活苗制备方法，用于临床上这两种疾病的防控。

本发明提供了一种牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞。本发明通过无血清悬浮驯化得到了悬浮MDBK细胞，在此基础上建立了无血清悬浮培养IBRV抗原病毒液的方法，采用该方法所得的IBRV抗原病毒液具有抗原含量高、抗原批量大、批次稳定等特点，而且避免了因培养基中加入的牛血清引起的副反应，在节约经济成本的同时又能生产出更加安全和高效的疫苗。同时本发明的IBRV与MB二联灭活疫苗一针可防两病，简化免疫程序，减少了动物的免疫次数，降低了动物的应激，也节省了劳动力，进一步降低了动物养殖的成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中贴壁MDBK细胞的无血清悬浮培养基筛选结果图。其中，A为使用壹生科ST细胞全悬浮培养基的处理；D为使用CD MDBK 249悬浮培养基的处理，E为使用OPM-MDBK SFM1 DPM悬浮培养基的处理。

图2为本发明实施例1中贴壁MDBK细胞在含有3％FBS的培养基中连续传代的细胞密度和死亡率折线图。

图3为本发明实施例1中贴壁MDBK细胞在无FBS的培养基中连续传代的细胞密度和死亡率折线图。

图4为本发明实施例1中光学显微镜下贴壁培养状态下的MDBK细胞(即贴壁 MDBK细胞)和无血清悬浮培养状态下的MDBK527细胞(即悬浮MDBK细胞)的生长状态对比照片。

图5为本发明实施例1中MDBK527的细胞生长曲线。

图6为本发明实施例1中MDBK527致瘤性检验小鼠实验结果照片。

图7为本发明实施例2中悬浮培养IBRV-SZH株的生长曲线。

图8为本发明实施例2中豚鼠血清中IBRV中和抗体效价的差异显著性分析。

图9为本发明实施例2中豚鼠血清中MB抗体效价的差异显著性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1分子生物学试剂

以下实施例中的FBS(胎牛血清)(04-001-1ACS)为Biological Industries公司产品。

以下实施例中的BEI溶液的配制方法如下：将BEA(B8910，索莱宝生物科技有限公司产品)充分溶解于0.175mol/L NaOH，配制成浓度为0.1mol/L的BEA，将 BEA溶液置于37℃水浴中，当BEA溶液温度平衡到37℃时，开始计时，每20min振摇一次，共计1小时，得到0.1mol/L的BEI(二乙烯亚胺)溶液，然后0.2μm滤器过滤除菌。所用0.175mol/L NaOH配制方法为：取0.1g氢氧化钠溶于14.3ml ddH₂O，配置成0.175mol/l的氢氧化钠溶液。

以下实施例中的TN缓冲液按照如下方法配制：取0.12g Tris，溶解于96ml的无菌去离子水，再加0.9gNaCl，溶解，使用0.1mol/L的盐酸溶液调节pH值至7.2±0.1。所用0.1mol/L的盐酸溶液配制方法为：取3.75ml浓盐酸溶于41.25ml ddH₂O，配置成 0.1mol/L的盐酸溶液。

以下实施例中的201佐剂(全称为MONTANIDE ISA 201VG)(货号：36075M) 为SEPPIC公司产品。

PS(青链霉素混合液，货号P140)为索莱宝生物科技有限公司产品。

2培养基

以下实施例中的壹生科ST细胞全悬浮培养基(L10701)、壹生科通用全悬浮细胞培养基(L11501)均为壹生科(深圳)有限公司产品；MDBK细胞无血清培养基 (FG0102503)为上海倍谙基生物科技有限公司产品；CD MDBK 249(10502-249)为健顺生物科技有限公司产品；OPM-MDBK SFM1 DPM(V002201)为上海奥浦迈生物科技有限公司产品；DMEM基础培养基(C11995500BT)为Gibco公司产品；PPLO 肉汤培养基(LA7080)为索莱宝生物科技有限公司产品。

以下实施例中的低血清悬浮培养基为向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml。青霉素和链霉素以PS(青链霉素混合液)的形式添加。

以下实施例中的无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml。青霉素和链霉素以PS(青链霉素混合液)的形式添加。

以下实施例中的贴壁细胞完全培养基为在DMEM基础培养基中添加FBS、青霉素和链霉素得到的培养基；贴壁细胞完全培养基中，FBS含量为10％，青霉素含量为 100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml。

以下实施例中的贴壁细胞维持液为在DMEM基础培养基中添加FBS得到的液体培养基。贴壁细胞维持液中FBS的含量为2％。

以下实施例中牛支原体液体培养基按照如下方法配制(以100ml体系为例)：取2.1g PPLO肉汤培养基，2.5g酵母浸出液，加80ml ddH₂O，高压灭菌，之后加20ml 马血清(品牌：政博，12000rpm/min离心10min，0.45μm滤器过滤)，加100μl Amp 溶液(1g氨苄青霉素溶于10ml ddH₂O，0.45μm滤器过滤后分装)。

以下实施例中牛支原体固体培养基按照如下方法配制(以100ml体系为例)：取2.1g PPLO肉汤培养基，2.5g酵母浸出液，1g琼脂，加80ml ddH₂O，高压灭菌，之后加100μlAmp溶液(1g氨苄青霉素溶于10ml ddH₂O，0.45μm滤器过滤后分装)，在冷却到60～70℃左右时加入20ml马血清，过热或过凉倒出的平板会显浑浊。

3细胞株

以下实施例中的贴壁MDBK细胞为在含有胎牛血清的培养基中进行贴壁生长的牛肾细胞(MDBK)，该细胞株记载于非专利文献“李佳禾.牛支原体表达载体的构建[D].中国农业大学，2015.”，公众可从中国农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

以下实施例中的Hela细胞(编号为CL16)为中国兽医微生物菌种保藏管理中心产品。

以下实施例中的ST细胞(编号为CL27)为中国兽医微生物菌种保藏管理中心产品。

以下实施例中的牛支原体PD株记载于非专利文献“刘梦瑶，张秋楠，吴文学，李金祥.BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立.中国兽医杂志,2019 (55)11，28-36”，公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

4病毒株

以下实施例中的牛传染性鼻气管炎病毒SZH株(以下简称IBRV-SZH株)记载于非专利文献“刘梦瑶，张秋楠，吴文学，李金祥.BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立.中国兽医杂志,2019(55)11，28-36”，公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。

5实验动物

以下实施例中无胸腺小鼠为标准品系，为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。

以下实施例中健康易感牛为荷斯坦杂交牛，购自吉林省镇赉县二华畜牧养殖农民专业合作社。

以下实施例中健康易感雌性豚鼠为标准品系，购自北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂。

下述实施例中所用的摇床为莱普特科学仪器(北京)有限公司0S-30型号的摇床。

实施例1能悬浮培养牛传染性鼻气管炎病毒的MDBK细胞的获得

1、无血清悬浮培养基的筛选

以5种悬浮培养基设置5个处理：

A处理：使用壹生科ST细胞全悬浮培养基配置悬浮培养基。

B处理：使用壹生科通用全悬浮细胞培养基配置悬浮培养基。

C处理：使用MDBK细胞无血清培养基配置悬浮培养基。

D处理：使用CD MDBK 249配置悬浮培养基。

E处理：使用OPM-MDBK SFM1 DPM配置悬浮培养基。

每种处理均将上述无血清培养基与DMEM基础培养基以1:1的体积比混合，并加入FBS和PS(青链霉素混合液)，得到的培养基称为悬浮培养基，悬浮培养基中FBS 体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml。

每种悬浮培养基分别接种生长状态良好的贴壁MDBK细胞，使其初始密度为1×10⁶个/ml贴壁MDBK细胞，培养于125ml细胞摇瓶，20～30ml/瓶，置于100rpm摇床， 37℃、5％CO₂温箱进行培养。连续传代观察细胞数量及生长状态，每代48～72h。

B、C两种处理在培养至第二代时，眼观可见细胞结团严重，传代离心发现细胞数量严重减少，故淘汰。对另外三种处理连续培养三代，每一代的细胞生长数量变化如图1所示。连续传代三次，D、E处理中细胞数量均逐步下降，而A处理中细胞密度较为稳定，且有所增长，同时其细胞结团数量也相对较少，因此选择A处理所用壹生科ST细胞全悬浮培养基作为MDBK细胞悬浮传代培养的基础培养基。

2、贴壁MDBK细胞的低血清至无血清悬浮驯化

2.1低血清悬浮驯化

2.1.1制备低血清悬浮培养基

向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为 100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml。青霉素和链霉素以青链霉素混合液的形式添加。

2.1.2驯化

使用2.1.1的低血清悬浮培养基对MDBK贴壁细胞进行悬浮传代。具体方法如下：将贴壁生长的贴壁MDBK细胞以1×10⁶个细胞/ml的密度(之后每次传代接种密度为均1×10⁶个细胞/ml)接种于125ml细胞摇瓶中，置于100rpm摇床(旋转半径15mm)，于37℃、5％CO₂温箱中培养，每间隔48～72h进行传代，连续传代多次，对于细胞团，每次传代时均弃去。每次传代培养均是置于100rpm摇床(旋转半径15mm)，于37℃、 5％CO₂温箱中培养。

如图2所示，从第7代以后细胞增长数量基本能在48h左右增长至2×10⁶个细胞 /ml以上，且死亡率基本低于8％(存活率高于92％)，生长状态稳定，无细胞结团现象，冻存第13代细胞为第1阶段细胞，冻存20支。

2.2无血清悬浮驯化

2.2.1制备无血清悬浮培养基

所述无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为 0.1mg/ml。青霉素和链霉素以PS(青链霉素混合液)的形式添加。

2.2.2驯化

取第1阶段细胞使用2.2.1的无血清悬浮培养基重悬，初始密度控制在1×10⁶个细胞/ml(之后每次传代接种密度为均1×10⁶个细胞/ml)，接种于125ml细胞摇瓶中， 25～30ml/瓶，置于100rpm摇床(旋转半径15mm)，于37℃、5％CO₂温箱中培养，每间隔48～72h进行取样计数观察，连续传代多次。每次传代培养均是置于100rpm摇床(旋转半径15mm)，于37℃、5％CO₂温箱中培养。

从图3所示的生长速率来看，传代15代以后细胞生长数量趋于稳定，约3×10⁶～4×10⁶cells/ml，传代25代以后细胞死亡率降至10％以内，即存活率在90％以上。选取细胞生长状态较稳定的第40代细胞进行作为种子细胞，冻存30支，作为悬浮MDBK 的基础细胞库，保存于液氮中，即为悬浮MDBK细胞，将其命名为悬浮MDBK527 细胞。

3、悬浮MDBK细胞的质量检验

3.1悬浮MDBK细胞生长状态及复苏活力检验

将2.2得到的悬浮MDBK527细胞(即按照步骤2.2.2的方法传代到第40代)，于光学显微镜下观察其生长状态与贴壁MDBK细胞(未经步骤2的传代)的生长状态的异同。如图4所示，在细胞瓶中培养的贴壁生长的MDBK细胞，形态呈现菱形、梭形，细胞间排列紧密；悬浮MDBK527细胞呈现圆形，透亮，边缘光滑，细胞呈现单个排列状态。将保存于液氮中的悬浮MDBK527细胞复苏，通过台盼蓝染色，在光学显微镜下，检查其复苏后的生长状态，悬浮MDBK527细胞存活率达到92％，细胞连续培养三代后，细胞生长状态趋于稳定。

3.2绘制悬浮MDBK细胞的生长曲线

将保存于液氮中的悬浮MDBK527细胞复苏，以1×10⁶个细胞/ml的初始密度接种于细胞摇瓶，同时作三个重复，每间隔24h进行取样，通过台盼蓝染液染色与光学显微镜下计数，并绘制生长曲线。如图5所示，在72～96h时细胞生长数量达到最高，约在6×10⁶～8×10⁶个细胞/ml。

3.3悬浮MDBK细胞的致瘤性检验

选4～6月龄无胸腺小鼠，每只体重17±4g，分为4组，每组3只，进行如下处理：

悬浮MDBK527细胞处理组：用2.2.1的无血清悬浮培养基配置悬浮MDBK细胞液，每只小鼠皮下注射0.1ml悬浮MDBK527细胞液，使悬浮MDBK527细胞的剂量为1.44×10⁷个悬浮MDBK细胞。

Hela细胞处理组(阳性对照组)：每只小鼠皮下注射0.1ml的Hela细胞液，使 Hela细胞的剂量为1.53×10⁶个Hela细胞。

ST细胞处理组(阴性对照组)：每只小鼠皮下注射0.1ml的ST细胞液，使ST 细胞的剂量为1.16×10⁷个ST细胞。

培养基处理组(控制对照组)：每只小鼠皮下注射2.2.1的无血清悬浮培养基0.1ml。

接种后连续观察14日，如图6所示，阳性对照组在注射部位有疑似肿瘤形成，解剖后进行病理组织学检查，确定为肿瘤。而另外三组裸鼠注射部位未发现肿瘤形成，继续观察84日，对接种部位进行解剖和病理学检查，观察到各***和各器官中均无结节形成。说明悬浮MDBK细胞无致瘤性。

4、悬浮MDBK细胞的放大培养

采用流加培养的方法，培养基为2.2.1的无血清悬浮培养基，以初始浓度为1×10⁶个细胞/ml将悬浮MDBK细胞接种在125ml摇瓶中进行培养，50ml/瓶，100rpm，于 37℃、5％CO₂温箱中培养72h后进行离心换液，100rpm，于37℃、5％CO₂温箱中继续培养48～72h细胞数量在6×10⁶～1.5×10⁷个细胞/ml时，再以1×10⁶个细胞/ml的初始密度将悬浮MDBK细胞转移至5L生物反应器中，培养液的体积为2L，待72h后，细胞密度长至6×10⁶～8×10⁶个细胞/ml时，补加2.2.1的无血清悬浮培养基至5L，设置生物反应器的培养参数：温度37℃，转速50～70rpm，溶氧40～60％，pH值7.0～7.20。培养72h，细胞的密度可达到7×10⁶～2.5×10⁷个细胞/ml。

实施例2牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗的获得

1、悬浮培养IBRV抗原的制备

1.1疫苗毒株的制备

将实施例1的悬浮MDBK细胞以初始密度为1×10⁶个细胞/ml，培养于125ml 摇瓶(每瓶25ml)，培养48h后，300g(或1000rpm)离心10min，使用新鲜的实施例1中2.2.1的无血清悬浮培养基(37℃预热30min)将细胞稀释至4×10⁶cells/ml (每瓶25～30ml)，置于新的细胞摇瓶中。将IBRV-SZH株以MOI＝0.1接种于悬浮细胞培养的摇瓶内，进行适应性培养，将摇瓶放入5％CO₂、37℃恒温培养箱的摇床上培养，摇床转速调整为100rpm，连续培养三代，每代48～72h。病毒IBRV-SZH株适应悬浮培养以后，如图7所示，在接毒后96h IBRV-SZH株的滴度达到峰值为10^8.6 TCID₅₀/ml(细胞死亡率约在60％左右)，收获病毒液，将病毒液于-80℃冰箱反复冻融三次，3000rpm离心15min，取上清保存，测量滴度。连续适应培养三代后收获IBRV 病毒液，注明名称、收获日期、代次等取样进行下一步的灭活。

1.2灭活

取IBRV病毒液，用生理盐水稀释至2.15×10⁷TCID₅₀/ml，得到2.15×10⁷ TCID₅₀/ml的IBRV病毒液。取50ml的2.15×10TCID₅₀/ml的IBRV病毒液，加入1ml 0.1mol/L的BEI溶液，得到51ml液体(该51ml液体中BEI的含量约为2mmol/L)。 37℃的恒温摇床中(100r/min)，反应24h。向该51ml灭活后的病毒液中加入2.125ml 的50％硫代硫酸钠溶液(配置方法：1g硫代硫酸钠加入2mlH₂O中)，终止灭活1小时，使硫代硫酸钠终浓度为2％，得到53.125ml液体。该53.125ml液体即为灭活的IBRV 病毒抗原液。该灭活的IBRV病毒抗原液中的IBRV抗原含量以灭活前的IBRV计为 2.024×10⁷TCID₅₀/ml。

1.3灭活检验

将贴壁MDBK细胞接种到细胞六孔板上，每孔加入2ml贴壁细胞完全培养基(含有10％FBS，100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的DMEM基础培养基)，待细胞密度达到80％-90％时，将灭活的IBRV病毒抗原液样本按照100μl/孔接种到细胞六孔板中。在接毒前用含有100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的PBS溶液洗涤细胞3遍。每个样品做3个平行。吸附1h后，弃去培养上清，加入2ml含2％胎牛血清的贴壁细胞维持液培养5d。并设置只加2％胎牛血清的贴壁细胞维持液、不加病毒的阴性对照孔。逐日观察细胞病变(CPE)情况，收获培养物，冻融2次，继续在MDBK细胞上连续盲传2代，均未出现细胞病变。

2、牛支原体(MB)抗原的制备

2.1牛支原体的纯化培养

取冻存牛支原体PD株，稀释约10～1000倍后，取100μl涂布于牛支原体固体培养基，于37℃，5％CO₂温箱培养约3天后，挑取单菌落于5ml牛支原体液体培养基，于37℃，5％CO₂温箱培养3天后，按1:1000比例接种至1L牛支原体液体培养基中扩大培养，得到牛支原体培养液。

2.2活菌计数

将2.1的牛支原体培养液按10倍倍比稀释，取3个合适的稀释度(经验值10^-7、 10^-8、10^-9)的待测菌液各0.1ml，涂布于牛支原体固体培养基上，每个稀释度3个平行，3天后进行计数。活菌浓度(CFU/ml)＝菌落数×稀释倍数/0.1ml。一般扩大培养三天后，牛支原体培养液中牛支原体活菌数可达到1×10⁹CFU/ml.

2.3牛支原体抗原液的浓缩

将2.1的牛支原体培养液在12000rpm/min条件下离心10min，用相同体积PBS (pH＝7.2)重悬，重复离心和重悬2次，菌体沉淀置-80℃冰箱冻存。用时取菌体沉淀，室温融解，重复冻融2次。根据2.2计数结果，用TN缓冲液重悬菌体沉淀并稀释至 4.3×10⁸cfu/ml，得到牛支原体抗原液。

2.4牛支原体的灭活

取步骤2.3中得到的牛支原体抗原液50ml(4.3×10⁸cfu/ml)，加入1ml 0.1mol/L的BEI溶液，得到51ml液体(该51ml液体中BEI的含量约为2mmol/L)，然后置于 37℃的恒温摇床中(100r/min)作用。灭活24h后，向该51ml液体中加入2.125ml 50％的硫代硫酸钠溶液(配置方法：1g硫代硫酸钠加入2ml H₂O中)，终止灭活1小时，使硫代硫酸钠终浓度为2％，得到53.125ml的灭活的牛支原体抗原液。该灭活的牛支原体抗原液中的牛支原体抗原含量以灭活前的牛支原体计为4.05×10⁸cfu/ml。

2.5灭活检验

取2.4的灭活的牛支原体抗原液，接种于牛支原体液体培养基中进行传代培养，连续盲传3代，均未发现牛支原体生长。

3、牛传染性鼻气管炎病毒和牛支原体二联灭活疫苗的制备

3.1水相制备

将步骤2制备的灭活的牛支原体抗原液和步骤1制备的灭活的IBRV抗原液各 50ml按相同比例混合，加入4％的硫柳汞溶液0.5ml，混匀。

3.2乳化

将201佐剂37℃温育1小时后无菌过滤。将过滤后的201佐剂与3.1的水相分别预热至31±1℃，在350rpm搅拌条件下将水相缓慢加入201佐剂，两者的体积比为 1:1，继续搅拌5分钟。置20℃冷浴中1小时，避免移动和搅拌。分装至无菌塑料瓶中， 4℃保存，得到牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

疫苗中IBRV抗原含量以灭活前的IBRV计为0.5×10⁷TCID₅₀IBRV/ml，牛支原体抗原含量以灭活前的牛支原体(MB)计为1×10⁸cfu MB/ml。

3.4无菌检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明上述疫苗均无菌生长。

3.5安全性检验

选取2～6月龄健康易感牛，5头，每头经颈部肌肉注射4ml上述疫苗。观察15日，结果上述疫苗均未见局部或全身明显不良反应。

3.6免疫效力检验

3.6.1替代动物法

试验方法：用体重350g±50g的健康易感雌性豚鼠35只，随机分为7组，每组5 只，按照表1设置各组处理。

IBRV单苗组注射的疫苗是取1.075×10⁷TCID₅₀/ml的IBRV病毒液，按步骤1灭活，取灭活后IBRV抗原液50ml，加入4％的硫柳汞溶液0.25ml，混匀后所得水相按照3.2的方法进行乳化制成。

MB单苗组注射的疫苗是取2.15×10⁸cfu/ml的牛支原体抗原液，按步骤2灭活，取灭活的牛支原体抗原液50ml，加入4％的硫柳汞溶液0.25ml，混匀后所得水相按照 3.2的方法进行乳化制成。

IBRV+MB二联灭活苗1组注射的疫苗是步骤3.2制备的IBRV+MB二联灭活苗 1。

IBRV+MB二联灭活苗2组注射的疫苗是在步骤1.2中用生理盐水将IBRV病毒液稀释至6.45×10⁷TCID₅₀/ml后按照后续步骤制备的IBRV+MB二联灭活苗2。

IBRV+MB二联灭活苗3组注射的疫苗是在步骤2中用TN缓冲液重悬MB并稀释至8.6×10⁸cfu/ml后按照后续步骤制备的IBRV+MB二联灭活苗3。

商品苗阳性对照组注射的疫苗是IBRV+BVDV二联灭活疫苗。

阴性对照注射的疫苗是生理盐水。

健康易感雌性豚鼠共35只，随机分为七组，每组5只。三个IBRV+MB二联灭活苗组、商品苗阳性对照组和阴性对照组均经后腿肌肉注射疫苗或生理盐水1ml，每支后腿各0.5ml；IBRV单苗和MB单苗组每支后腿注射疫苗0.25ml。

免疫后21天采用相同途径加强免疫一次。二免后14天，连同空白阴性对照组心脏无菌采血。

表1试验分组

采用微量中和抗体效价方法检测豚鼠血清中IBRV抗体效价(参考非专利文献周玉龙，吴海涛，任亚超，耿静，王密，谢金鑫，朴范泽.牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究[J].中国人畜共患病学报,2011,27(01):23-28)，结果见表2。结果表明，阴性对照组均≤1:4，IBRV+MB二联灭活苗、IBRV单苗组和商品苗阳性对照组的中和抗体效价均大于1:50，使用GraphPadPrism5.0软件对IBRV中和抗体效价进行统计学分析，表明各疫苗组间差异均不显著性分析(如图8所示)。由此说明，IBRV与MB联合免疫不存在免疫干扰，均可诱导较高的中和抗体。

表2各处理组IBRV中和抗体效价测定结果

采用牛支原体抗体间接ELISA方法检测豚鼠血清中牛支原体的抗体水平，具体方法如下：

(1)抗原制备:用Tris缓冲液(pH7.2)重悬并稀释牛支原体菌体沉淀(约10¹⁰CFU)，用BCA试剂盒测定牛支原体蛋白含量。

(2)包被：用碳酸盐缓冲液(pH9.6)将牛支原体抗原悬液浓度稀释至10μg/mL，加入96孔酶标板中，每孔加入100μL，4℃包被16小时。

(3)洗涤:弃去包被液，在无菌纸上拍干，用1xPBST溶液浸泡洗涤3次，300μL/ 孔，3min/次。最后一次洗涤完成后，弃去洗涤液，在无菌纸上拍干。

(4)封闭:每孔加入2％明胶封闭液，200μL/孔，37℃封闭2小时。

(5)样品稀释:用TN缓冲液按1:1000稀释待检血清、豚鼠阳性对照血清和阴性对照血清。

(6)加样:将样品加至抗原包被板中，100μL/孔，37℃温育30分钟。

(7)洗涤:温育结束后取出包被板，弃去液体，拍干，用1xPBST溶液浸泡洗涤3 次，300μL/孔，3min/次。最后一次洗涤完成后，弃去洗涤液，在无菌纸上拍干。

(8)孵育二抗:用1xPBS缓冲液(pH7.2-7.4)将“HRP兔抗豚鼠IgG”1:10000 稀释，加至抗原包被板中，100μl/孔，37℃温育1小时。

(9)洗涤:重复步骤(7)。

(10)显色:将室温孵育10分钟后的显色液A液、B液等比例混合(完成最后一次洗涤、拍干操作后混合A、B液)，加至包被板中，100μ/孔，37℃避光显色10分钟。

(11)终止:加终止液(2M H₂SO₄)，50μl/孔。

(12)读数：使用自动酶标检测仪测定每孔单波长OD_450nm。

(13)结果判定计算阴性对照的平均值和标准差，设定CUT OFF值＝平均值±2.58x标准差。计算各样品的OD_450nm平均值，当OD_450nm≥CUT OFF值为阳性， OD_450nm<CUT OFF值为阴性。

使用GraphPad Prism5.0软件对各组MB抗体效价进行差异显著性分析。

具体的结果如表3和图9所示，阴性对照组均≤1:4，IBRV+MB二联灭活苗1 组、IBRV+MB二联灭活苗2组和IBRV+MB二联灭活苗3组与MB单苗组均至少有4/5只豚鼠抗体效价≥1:32，且组间差异不显著，说明IBRV和MB联合免疫不存在免疫干扰，均可诱导较高的抗体水平。

表3各处理组牛支原体抗体效价测定结果

3.6.2靶动物法

根据步骤3.6.1的结果，选择IBRV+MB二联灭活苗1作为IBRV+MB二联灭活苗 (即抗原含量为IBRV抗原含量为0.5×10⁷TCID₅₀IBRV/ml，牛支原体抗原含量为1 ×10⁸cfu MB/ml)进行靶动物免疫保护效力检验。

选择IBRV、MB血清抗体阴性且病原核酸检测阴性的2～6月龄健康易感牛，随机分为6组，每组5头牛：

第1组为二联苗免疫+IBRV攻毒组。

第2组为二联苗免疫+MB攻毒组。

第3组为二联苗免疫不攻毒组。

第4组为不免疫+IBRV攻毒组。

第5组为不免疫+MB攻毒组。

第6组为不免疫不攻毒组。

第1组、第2组和第3组的二联苗免疫具体为经颈部肌肉注射接种2ml的 IBRV+MB二联灭活苗。第4组、第5组和第6组不免疫，具体为经颈部肌肉注射接种2ml的生理盐水。2周后，各组按相同方法重复接种一次。

二免后3周，进行攻毒处理：第1组和第4组经鼻腔喷雾方式攻毒IBRV-SZH株， 4×10⁷TCID₅₀/ml，共30ml，分3次；第2组和第5组经鼻腔喷雾方式攻毒牛支原体 PD株，1×10⁹cfu/ml，共30ml，分3次；第3组和第6组不攻毒处理，经鼻腔喷雾生理盐水30ml，分3次。攻毒后连续观察3周，并每日测定体温，3周后采集不攻毒组牛的血清，对攻毒组牛进行尸体剖检。

根据临床症状和体温变化呼吸道及肺组织病变情况确定免疫后IBRV攻毒组的发病和保护牛只数，评价疫苗免疫保护力，具体结果见表4：5头接受IBRV攻毒的免疫牛中至少有4头得到保护。

表4各攻毒处理疫苗免疫保护力评价结果

根据肺组织病变情况确定免疫后MB攻毒组的肺部病变改善情况，具体结果见表5：5头接受MB攻毒的免疫牛的肺部病变计分减少率分别为72.73％、83.64％、50.92％、67.28％和78.91％，即至少有4头的肺部病变计分减少率大于60％(判为保护的最低标准)。

表5各攻毒处理疫苗免疫保护力评价结果

牛血清采用微量中和抗体效价方法检测IBRV抗体效价(参考非专利文献周玉龙，吴海涛，任亚超，耿静，王密，谢金鑫，朴范泽.牛副流感病毒3型的分离鉴定及感染牛抗体消长规律的研究[J].中国人畜共患病学报,2011,27(01):23-28)，采用间接ELISA 检测牛血清中牛支原体抗体效价，具体方法如下：

(1)包被：将重组牛支原体P48蛋白(参考非专利文献Fu P,Sun Z,Zhang Y,Yu Z,Zhang H,Su D,Jiang F,Wu W.Development of a direct competitive ELISA for thedetection of Mycoplasma bovis infection based on a monoclonal antibody of P48protein. BMC Vet Res.2014Feb 18；10:42.doi:10.1186/1746-6148-10-42；)用碳酸盐缓冲液 (pH9.6)稀释至8μg/mL，加入96孔微孔板中，每孔加入100μL。4℃包被16小时。

(2)洗涤：甩去包被液，用PBST洗涤液洗三次，3min/次。

(3)封闭：加2％明胶，每孔200uL，37℃2h。

(4)甩去封闭液，拍干。

(5)加样：加入1:500稀释的待检牛血清、牛支原体阳性血清和阴性血清各100 μL，37℃1h。

(6)洗涤：甩，拍干，用PBST洗涤液300uL，洗板机洗涤6次、3min/次。

(7)HRP二抗：甩，拍干，加1:10000稀释的HRP兔抗牛IgG，37℃1小时。

(8)洗涤：甩，拍干，重复洗涤。

(9)显色：拍干洗涤液，每孔加入新鲜配制的显色液100μl，室温暗处放置10 分钟。

(10)终止：每孔加入2M H₂SO₄50μL。

(11)读数：使用自动酶标检测仪测定每孔单波长OD_450nm。

(12)结果判定：计算阴性对照的平均值和标准差，设定CUT OFF值＝平均值±2.58x标准差。计算各样品的OD_450nm平均值，当OD_450nm≥CUT OFF值为阳性， OD_450nm<CUT OFF值为阴性，具体结果见表6。

表6二联苗免疫后的血清抗体效价

从表6可以看出，第3组未攻毒的5头免疫牛中，IBRV中和抗体效价均不低于 1:56，MB抗体效价均不低于1:32。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。