阅读说明：本技术 一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法 (Experimental method for multiple drug-resistant bacterial infection of burn wound ) 是由 于洵洲 肖树文 赵志钢 王强 楚妍 于磊 朱典勇 于 2020-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明涉及医疗技术领域,尤其为一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法,包括以下步骤：A、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料靶向细菌作用研究；B、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料光热诱导靶向抗菌作用研究；C、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料对多重耐药细菌感染创面愈合的影响及其作用机制研究；D、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料生物安全性研究。本发明为在更复杂条件下光动力治疗和光热疗法的应用提供了更多的选择,为烧伤创面多重耐药细菌感染提供新的治疗方向和策略,并有利于进一步探索用于多重耐药细菌治疗新的多功能纳米平台。(The invention relates to the technical field of medical treatment, in particular to an experimental method for multiple drug-resistant bacterial infection of a burn wound, which comprises the following steps: A. the functional graphene nano composite material modified by the free radical initiator under in-vivo and in-vitro conditions is used for researching the targeted bacterial action; B. researching the photo-thermal induction targeted antibacterial effect of the functionalized graphene nanocomposite modified by the free radical initiator under in-vivo and in-vitro conditions; C. the influence of the functionalized graphene nanocomposite modified by the free radical initiator on healing of multiple drug-resistant bacterial infection wound surfaces and the action mechanism thereof are researched; D. and (3) researching the biological safety of the functionalized graphene nanocomposite modified by the free radical initiator. The invention provides more choices for the application of photodynamic therapy and photothermal therapy under more complex conditions, provides a new treatment direction and strategy for multiple drug-resistant bacterial infection of burn wounds, and is favorable for further exploring a new multifunctional nano platform for multiple drug-resistant bacterial treatment.)

一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法

技术领域

本发明涉及医疗技术领域，具体为一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法。

背景技术

控制创面多重耐药细菌感染是临床上救治重度烧伤患者主要环节之一，传统的实验方法中涉及大量抗生素的应用，不仅会使得细菌耐药性大幅提高，而且会严重伤害患者身体健康。

现有国内外在这方面的研究现状及趋势主要集中于采用自由基代替传统的实验方法，但在研究及实验中依然存在一定的问题，具体问题有以下几点：

1、在单独治疗时，通常所需的辐照强度会高于皮肤承受温度，由此导致的局部高温可能会对附近的健康组织造成严重损害，因而研制克服光动力治疗和光热治疗缺点的新型医用纳米生物材料是下一步工作的重点；

2、在生理温度下，偶氮引发剂分解产生的烷自由基诱导细胞凋亡是有限的，需要有效的光热剂来加速自由基的产生；

3、现有的纳米生物材料在光热转换效率方面依旧存在较大缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法，具备为烧伤创面多重耐药细菌感染提供新的治疗方向和策略的优点，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法，包括以下步骤：

A、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料靶向细菌作用研究：①纳米材料在体外与细菌靶向结合作用，②纳米材料在体内向感染部位靶向聚集作用；

B、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料光热诱导靶向抗菌作用研究：①采用标准平板计数法、活/死细菌染色法检测纳米材料体外靶向抗菌能力，②建立小鼠多重耐药细菌皮下脓肿模型、创伤感染模型，尾静脉注射纳米材料后观察纳米材料光热诱导靶向抗菌效果，并对脓肿及感染组织进行菌落计数定量分析；H&E染色分析脓肿部位组织愈合情况；

C、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料对多重耐药细菌感染创面愈合的影响及其作用机制研究：①采用电子自旋共振技术检测纳米材料烷自由基生成，采用电子自旋共振技术检测纳米材料与细菌结合后烷自由基的生成，采用电子自旋共振技术检测纳米材料在正常氧气及无氧条件下烷自由基的治疗机制，②在正常氧气及无氧条件下活性氧水平检测、谷胱甘肽水平检测以及DNA损伤检测，探究烷自由基导致细菌氧化应激反应的分子生物学作用，③采用免疫组化、免疫印迹手段探究创面愈合相关分子的表达变化情况以及与此过程密切相关的细胞信号转导途径；

D、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料生物安全性研究：①纳米材料与3T3成纤维细胞共培养24小时后，通过CCK-8法检测3T3成纤维细胞的增殖情况，②通过溶血实验检测纳米材料血液相容性，③将纳米材料经小鼠尾静脉注射后1天及30天，观察小鼠各主要脏器、血液系统是否出现病理性损伤变化，探究其急性和慢性毒性作用。

优选的，所述步骤A中具体流程如下，

多重耐药细菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多重耐药铜绿假单胞菌)解冻后摇匀，在细菌培养至对数生长期时收集，使用时调整细菌OD600nm＝0.48；

①体外条件下材料靶向细菌作用研究：将收集细菌以3500rpm离心，PBS缓冲液(pH6.3、pH7.4)冲洗；取适量对照组及实验组材料和测试细菌混合在一起，观察材料与细菌特异性靶向结合情况并拍照记录；步骤同前，使用纳米粒度仪对样品Zeta电位变化情况进行测量并记录；取适量对照组及实验组材料和测试细菌混合；静置30min后取适量纳米材料-细菌混合溶液滴加到48孔细胞爬片上，将细胞爬片放入2.5％的戊二醛中室温下固定2h；生理盐水清洗三次，梯度乙醇和叔丁醇脱水干燥，每组3-5min；最后将细胞爬片固定于扫描电子显微镜样品托上，喷金60s，用扫描电镜观察纳米材料结合细菌后的状态；

烧伤创面多重耐药细菌感染模型建立：选取20-25g、6-8周BALB/c雄性小鼠，1％戊巴比妥麻醉后刮去小鼠背部皮肤，脱毛膏进一步脱毛，酒精消毒皮肤，烫伤仪制造小鼠背部烧伤创面，将细菌滴于创面内，贴膜覆盖创面24h后观察创面感染情况；

皮下脓肿动物模型建立：小鼠准备步骤同前，适量细菌皮下注射至小鼠背部，24h后观察脓肿形成情况。

②体内条件下材料向烧伤创面感染部位靶向聚集能力研究：取15只BAL/c小鼠，将小鼠随机分成5组，每组3只；使用静脉可视小鼠尾静脉注射固定仪分别固定5组老鼠，每只尾静脉注射适量荧光染料标记的纳米材料，在注射后的不同时间点分别进行小鼠全身近红外用光成像，同样时间点处死小鼠，取感染部位和正常皮肤部位继续进行近红外用光成像，照射24h后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、感染部位、正常皮肤部位继续进行近红外用光成像，使用活体动物成像系统对材料近红外荧光成像和体内生物分布进行可视化分析检测，采用Living Image和IVIS Reagents软件进行器官组织荧光信号强度分析；采用热成像仪进行相同实验。

优选的，所述步骤B中具体流程如下，

①体外条件下材料靶向抗菌作用研究：采用标准平板计数法评价材料的体外靶向抗菌效果，细菌准备步骤同前，将800μL OD 600nm＝0.48的两种菌液分别与材料混合后加入到离心管中，充分混合30min后近红外光照射，将菌悬液充分摇匀，梯度稀释后均匀分散于营养琼脂平板上，37℃恒温箱孵育16-18h，使用菌落计数仪拍照后进行菌落计数，并统计分析；

②体内条件下材料靶向抗菌作用研究：小鼠动物模型成功建立后，通过腹腔注射1％戊巴比妥溶液麻醉小鼠，待小鼠深度麻醉后，注射器吸取上述各组样品材料溶液200μL，尾静脉注射入小鼠体内，样品材料注射6h及24h后，使用808nm近红外光照射小鼠背部多重耐药菌感染部位，于第10天拍照后断颈处死各组小鼠，用眼科剪沿脓肿创缘将脓肿剪下，无菌棉签蘸取各组等量分泌物，置于无菌生理盐水中梯度稀释，取100μL菌液稀释后均匀涂板，37℃恒温孵箱孵育过夜，采用菌落计数仪进行拍照计数并统计分析，定量观察细菌数目；将脓肿组织浸入4％多聚甲醛溶液中进行固定24h后，脱水、透明、包埋、切片、捞片、脱蜡、H&E染色，显微镜观察切片并拍照。

优选的，所述步骤C中具体流程如下，

①电子自旋共振技术检测材料本身烷自由基生成情况、材料与细菌结合后烷自由基生成情况：将材料和捕捉剂溶液混合在密封管中，室温下鼓入空气30min后，取约0.2mL混合溶液加入石英毛细管中，打开调谐窗口，模式由Standby切换到Tube，微波衰减调节到30dB，调节频率，寻找共振点，使尖峰dip的尖尽量对准屏幕中心竖线，调节模式从Tune切换到Operate，把微波衰减调节到50dB，调节Bias，使二极管电流达到200uA，把衰减调节到30dB，调节频率，使Lock offset靠近0，调节Iris使二极管电流达到200uA；把衰减降到10dB，调节Phase，使二极管电流指正达到最右，再调节Iris，使二极管电流回到200uA，依次增大衰减微波，观察二极管电流，如果所有衰减下二极管电流始终稳定在200uA，则调谐完毕，开始实验测量，设置参数，使用近红外光照射石英毛细管中混合溶液，检测自由基产生过程，保存图谱；

电子自旋共振技术检测检测不同氧分压下烷自由基治疗机制研究：采用三种不同的自由基捕捉剂POBN、MNP及DMPO，将材料和捕捉剂溶液混合在密封管中，分别室温下鼓入空气和氮气30min，实验步骤同前；

②标准平板计数法与活/死细菌染色法检测材料在不同氧分压抗菌能力：标准平板计数法步骤同前，材料在正常氧气(21％O₂)条件下和无氧(1％O₂)条件下与细菌均匀混合30min后近红外光照射，将混合液离心后收集沉淀，1mL灭菌去离子水重悬沉淀后，加入3μLSYTO9和3μL PI染料，黑暗条件下避光染色15min，待染色结束后取2μL溶液滴加到载玻片上，封片后使用激光共聚焦显微镜观察细菌染色情况；

不同氧分压下DNA损伤检测：实验分组及步骤如前所示，琼脂糖凝胶电泳法观察DNA损伤情况；

不同氧分压下处理细菌后谷胱甘肽(GSH)水平检测：配置GSH储备液、DTNB储备液、蛋白去除试剂S水溶液、NADPH储备液、5倍稀释谷胱甘肽还原酶溶液、0.5mg/ml NADPH溶液；ELISA法测定412nm处的吸光度值，记录数据并统计分析；

不同氧分压下处理细菌后活性氧(ROS)水平检测：配置DCFH-DA溶液，适量加入材料与细菌混合溶液中，黑暗条件下孵育30min，离心弃上清并洗涤，取2μL溶液滴加到载玻片上，封片后使用激光共聚焦显微镜观察细菌活性氧产生情况；

③体内条件下对感染创面愈合的影响及机制研究：小鼠治疗10天内，不同时间点拍照，记录外观、愈合时间，Image J软件测量创面面积，计算愈合率；10天后测量创面组织新生上皮长度、肉芽厚度，免疫组化检测增殖指标、血管化指标及炎性指标表达情况；10天后取材创面后，冷冻研碎，提取总蛋白，WB检测VEGF-PI3K-Akt信号通路上VEGF、PI3K等蛋白表达情况。

优选的，所述步骤D中具体流程如下，

①CCK-8法检测纳米材料的细胞毒性：选择成纤维细胞系(3T3细胞系)检测纳米材料的细胞毒性，将100μL含3×10⁴细胞数的DMEM培养基加入到96孔平底板中，置于37℃恒温细胞培养箱中培养24h，洗涤细胞3次，实验组分别加入200μL含不同浓度的材料培养基，对照组加入去离子水和DMEM培养基，37℃恒温细胞培养箱孵育4h后灭菌PBS溶液洗涤细胞三次，然后每孔加入100μL新鲜的DMEM培养基和10μL CCK-8试剂，37℃恒温细胞培养箱再次孵育4h后使用酶标仪检测在450nm波长下的吸光度值，吸光度值大小代表细胞活性的高低。细胞存活率＝[OD(samples)/OD(control)]×100％,其中OD(samples)和OD(control)分别代表样品和对照组下450nm波长下的吸光度值；

②体外溶血实验检测纳米材料的血液相容性：实验使用新鲜人血，征得志愿者知情同意，取3mL全血1500rpm离心15min，去掉上层清液，保留红细胞沉淀，生理盐水洗涤红细胞并离心三次后稀释于11mL生理盐水中，取200μL稀释后红细胞加入1mL不同浓度材料溶液中(溶剂为生理盐水)，最终红细胞压积水平约为4％，保持在正常参考值范围期间，离子水为阳性对照，单纯生理盐水为阴性对照，将各实验组、阴性对照组以及阳性对照组混合溶液置于37℃水浴孵育3h，12000rpm离心15min后拍照并记录，多功能酶标仪检测上层清液540nm处的OD值；计算溶血率采用以下公式：Hemolysis(％)＝(A_S-A_N)/(A_P-A_N)×100％。

③纳米抗菌材料急性及慢性毒性实验：将治疗浓度及高于治疗浓度材料尾静脉注射小鼠体内，分别于注射1天及30天取静脉血，检测小鼠血常规、肝肾功能、凝血等指标；取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行活检，切片H&E染色后显微镜观察材料对各脏器组织结构的影响。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

该纳米复合材料通过在近红外光条件下产生烷自由基而发挥抗菌作用，在正常氧和无氧条件下均具有同等的治疗效果，但其作用机制各不相同：在常氧条件下，生成的烷基自由基经氧气转化为烷氧自由基，直接对细菌造成损伤；在无氧条件下烷自由基通过累积效应导致细菌氧化应激反应。烷自由基和烷氧自由基均可表现出DNA损伤活性，最终导致细菌死亡。本方法为在更复杂条件下光动力治疗和光热疗法的应用提供了更多的选择，并可成为一种有效的抗生素替代疗法，为烧伤创面多重耐药细菌感染提供新的治疗方向和策略，并有利于进一步探索用于多重耐药细菌治疗新的多功能纳米平台。

附图说明

图1为本发明研究流程图；

图2为本发明方法流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-2，实施例：

一种烧伤创面多重耐药细菌感染的实验方法，包括以下步骤：

A、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料靶向细菌作用研究：①纳米材料在体外与细菌靶向结合作用，②纳米材料在体内向感染部位靶向聚集作用；

B、体内、体外条件下自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料光热诱导靶向抗菌作用研究：①采用标准平板计数法、活/死细菌染色法检测纳米材料体外靶向抗菌能力，②建立小鼠多重耐药细菌皮下脓肿模型、创伤感染模型，尾静脉注射纳米材料后观察纳米材料光热诱导靶向抗菌效果，并对脓肿及感染组织进行菌落计数定量分析；H&E染色分析脓肿部位组织愈合情况；

C、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料对多重耐药细菌感染创面愈合的影响及其作用机制研究：①采用电子自旋共振技术检测纳米材料烷自由基生成，采用电子自旋共振技术检测纳米材料与细菌结合后烷自由基的生成，采用电子自旋共振技术检测纳米材料在正常氧气及无氧条件下烷自由基的治疗机制，②在正常氧气及无氧条件下活性氧水平检测、谷胱甘肽水平检测以及DNA损伤检测，探究烷自由基导致细菌氧化应激反应的分子生物学作用，③采用免疫组化、免疫印迹手段探究创面愈合相关分子的表达变化情况以及与此过程密切相关的细胞信号转导途径；

D、自由基引发剂修饰的功能化石墨烯纳米复合材料生物安全性研究：①纳米材料与3T3成纤维细胞共培养24小时后，通过CCK-8法检测3T3成纤维细胞的增殖情况，②通过溶血实验检测纳米材料血液相容性，③将纳米材料经小鼠尾静脉注射后1天及30天，观察小鼠各主要脏器、血液系统是否出现病理性损伤变化，探究其急性和慢性毒性作用。

所述步骤A中具体流程如下，

多重耐药细菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、多重耐药铜绿假单胞菌)解冻后摇匀，在细菌培养至对数生长期时收集，使用时调整细菌OD600nm＝0.48；

①体外条件下材料靶向细菌作用研究：将收集细菌以3500rpm离心，PBS缓冲液(pH6.3、pH7.4)冲洗；取适量对照组及实验组材料和测试细菌混合在一起，观察材料与细菌特异性靶向结合情况并拍照记录；步骤同前，使用纳米粒度仪对样品Zeta电位变化情况进行测量并记录；取适量对照组及实验组材料和测试细菌混合；静置30min后取适量纳米材料-细菌混合溶液滴加到48孔细胞爬片上，将细胞爬片放入2.5％的戊二醛中室温下固定2h；生理盐水清洗三次，梯度乙醇和叔丁醇脱水干燥，每组3-5min；最后将细胞爬片固定于扫描电子显微镜样品托上，喷金60s，用扫描电镜观察纳米材料结合细菌后的状态；

烧伤创面多重耐药细菌感染模型建立：选取20-25g、6-8周BALB/c雄性小鼠，1％戊巴比妥麻醉后刮去小鼠背部皮肤，脱毛膏进一步脱毛，酒精消毒皮肤，烫伤仪制造小鼠背部烧伤创面，将细菌滴于创面内，贴膜覆盖创面24h后观察创面感染情况；

皮下脓肿动物模型建立：小鼠准备步骤同前，适量细菌皮下注射至小鼠背部，24h后观察脓肿形成情况。

②体内条件下材料向烧伤创面感染部位靶向聚集能力研究：取15只BAL/c小鼠，将小鼠随机分成5组，每组3只；使用静脉可视小鼠尾静脉注射固定仪分别固定5组老鼠，每只尾静脉注射适量荧光染料标记的纳米材料，在注射后的不同时间点分别进行小鼠全身近红外用光成像，同样时间点处死小鼠，取感染部位和正常皮肤部位继续进行近红外用光成像，照射24h后处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、感染部位、正常皮肤部位继续进行近红外用光成像，使用活体动物成像系统对材料近红外荧光成像和体内生物分布进行可视化分析检测，采用Living Image和IVIS Reagents软件进行器官组织荧光信号强度分析；采用热成像仪进行相同实验。

所述步骤B中具体流程如下，

①体外条件下材料靶向抗菌作用研究：采用标准平板计数法评价材料的体外靶向抗菌效果，细菌准备步骤同前，将800μL OD 600nm＝0.48的两种菌液分别与材料混合后加入到离心管中，充分混合30min后近红外光照射，将菌悬液充分摇匀，梯度稀释后均匀分散于营养琼脂平板上，37℃恒温箱孵育16-18h，使用菌落计数仪拍照后进行菌落计数，并统计分析；

②体内条件下材料靶向抗菌作用研究：小鼠动物模型成功建立后，通过腹腔注射1％戊巴比妥溶液麻醉小鼠，待小鼠深度麻醉后，注射器吸取上述各组样品材料溶液200μL，尾静脉注射入小鼠体内，样品材料注射6h及24h后，使用808nm近红外光照射小鼠背部多重耐药菌感染部位，于第10天拍照后断颈处死各组小鼠，用眼科剪沿脓肿创缘将脓肿剪下，无菌棉签蘸取各组等量分泌物，置于无菌生理盐水中梯度稀释，取100μL菌液稀释后均匀涂板，37℃恒温孵箱孵育过夜，采用菌落计数仪进行拍照计数并统计分析，定量观察细菌数目；将脓肿组织浸入4％多聚甲醛溶液中进行固定24h后，脱水、透明、包埋、切片、捞片、脱蜡、H&E染色，显微镜观察切片并拍照。

所述步骤C中具体流程如下，

①电子自旋共振技术检测材料本身烷自由基生成情况、材料与细菌结合后烷自由基生成情况：将材料和捕捉剂溶液混合在密封管中，室温下鼓入空气30min后，取约0.2mL混合溶液加入石英毛细管中，打开调谐窗口，模式由Standby切换到Tube，微波衰减调节到30dB，调节频率，寻找共振点，使尖峰dip的尖尽量对准屏幕中心竖线，调节模式从Tune切换到Operate，把微波衰减调节到50dB，调节Bias，使二极管电流达到200uA，把衰减调节到30dB，调节频率，使Lock offset靠近0，调节Iris使二极管电流达到200uA；把衰减降到10dB，调节Phase，使二极管电流指正达到最右，再调节Iris，使二极管电流回到200uA，依次增大衰减微波，观察二极管电流，如果所有衰减下二极管电流始终稳定在200uA，则调谐完毕，开始实验测量，设置参数，使用近红外光照射石英毛细管中混合溶液，检测自由基产生过程，保存图谱；

电子自旋共振技术检测检测不同氧分压下烷自由基治疗机制研究：采用三种不同的自由基捕捉剂POBN、MNP及DMPO，将材料和捕捉剂溶液混合在密封管中，分别室温下鼓入空气和氮气30min，实验步骤同前；

②标准平板计数法与活/死细菌染色法检测材料在不同氧分压抗菌能力：标准平板计数法步骤同前，材料在正常氧气(21％O₂)条件下和无氧(1％O₂)条件下与细菌均匀混合30min后近红外光照射，将混合液离心后收集沉淀，1mL灭菌去离子水重悬沉淀后，加入3μLSYTO9和3μL PI染料，黑暗条件下避光染色15min，待染色结束后取2μL溶液滴加到载玻片上，封片后使用激光共聚焦显微镜观察细菌染色情况；

不同氧分压下DNA损伤检测：实验分组及步骤如前所示，琼脂糖凝胶电泳法观察DNA损伤情况；

不同氧分压下处理细菌后谷胱甘肽(GSH)水平检测：配置GSH储备液、DTNB储备液、蛋白去除试剂S水溶液、NADPH储备液、5倍稀释谷胱甘肽还原酶溶液、0.5mg/ml NADPH溶液；ELISA法测定412nm处的吸光度值，记录数据并统计分析；

不同氧分压下处理细菌后活性氧(ROS)水平检测：配置DCFH-DA溶液，适量加入材料与细菌混合溶液中，黑暗条件下孵育30min，离心弃上清并洗涤，取2μL溶液滴加到载玻片上，封片后使用激光共聚焦显微镜观察细菌活性氧产生情况；

③体内条件下对感染创面愈合的影响及机制研究：小鼠治疗10天内，不同时间点拍照，记录外观、愈合时间，Image J软件测量创面面积，计算愈合率；10天后测量创面组织新生上皮长度、肉芽厚度，免疫组化检测增殖指标、血管化指标及炎性指标表达情况；10天后取材创面后，冷冻研碎，提取总蛋白，WB检测VEGF-PI3K-Akt信号通路上VEGF、PI3K等蛋白表达情况。

所述步骤D中具体流程如下，

①CCK-8法检测纳米材料的细胞毒性：选择成纤维细胞系(3T3细胞系)检测纳米材料的细胞毒性，将100μL含3×10⁴细胞数的DMEM培养基加入到96孔平底板中，置于37℃恒温细胞培养箱中培养24h，洗涤细胞3次，实验组分别加入200μL含不同浓度的材料培养基，对照组加入去离子水和DMEM培养基，37℃恒温细胞培养箱孵育4h后灭菌PBS溶液洗涤细胞三次，然后每孔加入100μL新鲜的DMEM培养基和10μL CCK-8试剂，37℃恒温细胞培养箱再次孵育4h后使用酶标仪检测在450nm波长下的吸光度值，吸光度值大小代表细胞活性的高低。细胞存活率＝[OD(samples)/OD(control)]×100％,其中OD(samples)和OD(control)分别代表样品和对照组下450nm波长下的吸光度值；

②体外溶血实验检测纳米材料的血液相容性：实验使用新鲜人血，征得志愿者知情同意，取3mL全血1500rpm离心15min，去掉上层清液，保留红细胞沉淀，生理盐水洗涤红细胞并离心三次后稀释于11mL生理盐水中，取200μL稀释后红细胞加入1mL不同浓度材料溶液中(溶剂为生理盐水)，最终红细胞压积水平约为4％，保持在正常参考值范围期间，离子水为阳性对照，单纯生理盐水为阴性对照，将各实验组、阴性对照组以及阳性对照组混合溶液置于37℃水浴孵育3h，12000rpm离心15min后拍照并记录，多功能酶标仪检测上层清液540nm处的OD值；计算溶血率采用以下公式：Hemolysis(％)＝(A_S-A_N)/(A_P-A_N)×100％。

③纳米抗菌材料急性及慢性毒性实验：将治疗浓度及高于治疗浓度材料尾静脉注射小鼠体内，分别于注射1天及30天取静脉血，检测小鼠血常规、肝肾功能、凝血等指标；取心、肝、脾、肺、肾等主要脏器进行活检，切片H&E染色后显微镜观察材料对各脏器组织结构的影响。

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尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。