阅读说明：本技术 一种母乳α-淀粉酶活性检测方法 (Method for detecting activity of alpha-amylase of breast milk ) 是由 李达 康学军 于 2020-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种母乳α-淀粉酶活性检测方法,包括如下步骤：将新鲜母乳样本与饱和硫酸铵溶液混合,充分震荡摇匀后,离心取清液,然后运用碘-淀粉比色法实现母乳α-淀粉酶活性测定。本方法能在实现澄清母乳样本的同时,不损伤α-淀粉酶活性的目的,且不用大比例稀释待测母乳,使得分光光度法能够准确检测母乳α-淀粉酶活性值。(The invention discloses a method for detecting the activity of alpha-amylase of breast milk, which comprises the following steps: mixing a fresh breast milk sample with a saturated ammonium sulfate solution, fully shaking and shaking uniformly, centrifuging to obtain a clear solution, and then measuring the activity of the alpha-amylase of the breast milk by using an iodine-starch colorimetric method. The method can realize the purpose of clarifying a breast milk sample without damaging the alpha-amylase activity, and does not dilute the breast milk to be detected in a large proportion, so that the spectrophotometry can accurately detect the alpha-amylase activity value of the breast milk.)

一种母乳α-淀粉酶活性检测方法

技术领域

本发明涉及一种母乳α-淀粉酶活性检测方法，尤其是对于母乳中含量极低的活性成分α-淀粉酶进行检测的前处理方法。

背景技术

基于天然母乳的乳浊液特性，不论是天然底物淀粉检测方法，还是分子组成确定底物(如还原性麦芽糖)的方法，均不能基于分光光度法有效检测母乳α-淀粉酶活性，这就要求在检测之前对母乳进行样本前处理。

目前国、内外前处理方法有首先对母乳样本高速离心去脂，并在特定的pH值下通过特定试剂(如磷酸盐缓冲溶液等)进行稀释一定比例，制成待测母乳样本等方法。存在不能完全澄清母乳，基于分光光度法进行活性检测会存在较大误差等问题。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中的技术问题，本发明提出一种母乳α-淀粉酶活性检测方法，尤其是对于母乳中含量极低的活性成分α-淀粉酶进行检测的前处理方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明的技术方案如下：一种母乳α-淀粉酶活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将新鲜母乳样本与饱和硫酸铵溶液混合，充分震荡摇匀后，离心取清液，然后运用碘-淀粉比色法实现母乳α-淀粉酶活性测定。

优选地，新鲜母乳与饱和硫酸铵溶液的体积比为1:1～1:5，进一步优选地，两者体积比为1:1。

震荡条件为：涡旋仪上震荡1～5min，在一个优选的实施方案中，在涡旋仪上震荡1min。

优选地，离心条件为离心2～10min，设定转速为2000～10000r/min，在一个优选的实施方案中，离心条件为离心5min，转速5000r/min。

在一个优选的实施方案中，按照如下方法进行测定：

(1)吸取1ml新鲜母乳于4ml规格塑料试管中，再加入1ml饱和硫酸铵溶液；

(2)将该塑料试管放于涡旋仪上震荡1min，充分混匀；

(3)将塑料试管放入离心机内离心5分钟，设定转速为5000r/min；

(4)取离心后清液100μl于玻璃比色皿中，其中，所述玻璃比色皿中含2ml浓度为0.8mg/ml淀粉溶液；

(5)在避光条件下滴入碘/碘化钾溶液，反应5～20min，优选地，在37℃保温(避光)条件下反应5～20min后，滴入浓度为50mmol/L的碘/碘化钾溶液，该溶液与玻璃比色皿中含有淀粉溶液的体积比为1：10～1：50，更优选地，比例为1：20；

(6)迅速放入可见分光光度仪中，读取吸光度值Abs；

(7)将吸光度值Abs代入计算公式求取母乳α-淀粉酶活性值。

其中，以加入2ml浓度为0.8mg/ml淀粉溶液计，母乳α-淀粉酶活性值AMY的计算公式为(单位U/L)：

其中，

代表测定管淀粉的水解程度，大小范围为0～1，

含义为在实验条件下，100μl离心清液中的淀粉酶在15分钟内水解0.4mg淀粉，则其活性为800个单位。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明意外的发现，采用饱和硫酸铵溶液作为反应试剂，能在实现澄清母乳样本的同时，不损伤α-淀粉酶活性的目的，且不用大比例稀释待测母乳(母乳α-淀粉酶活性极低)，使得分光光度法能够准确检测母乳α-淀粉酶活性值；

(2)本发明的前处理方法能够有效凝结母乳中的脂肪，可有效阻止离心去脂过程中脂肪不可避免再次进入母乳样本而带来的实验误差，也提高操作可行性；

(3)由于该前处理方法为体积加入母乳样本中进行反应，不用大比例稀释待测母乳(母乳α-淀粉酶活性极低)，确保分光光度法检测结果的准确性；

(4)由于该前处理方法能完全澄清母乳，可有效避免比例稀释法不能完全澄清母乳带来的实验误差，确保分光光度法检测结果的准确。

附图说明

图1是本发明方法对母乳的澄清凝结效果图，左侧图A为1ml纯奶+1ml饱和硫酸铵，右侧B图为1ml去离子水+1ml饱和硫酸铵。

图2是本发明方法对母乳α-淀粉酶活性值无影响的验证效果图，实验组C为(1ml饱和硫酸铵+1ml不同梯度α-淀粉酶标液)，对照组D(1ml去离子水+1ml不同梯度α-淀粉酶标液)各取100ul加入淀粉溶液，充分反应后加入碘/碘化钾溶液，呈现出蓝色变化，不同梯度混合溶液723可见分光仪检测所得吸光度值Abs数值均相同。

具体实施方式

本发明提出了一种母乳α-淀粉酶活性检测方法，该方法将待测母乳样本解冻后，按比例添加饱和硫酸铵溶液，充分震荡摇匀后，离心取清液转移到塑料试管中待检测，再运用碘-淀粉比色法实现母乳α-淀粉酶活性测定的目的。

各步骤具体操作如下：

(1)从冰箱冷冻层取出冷冻新鲜母乳，放置于室温(25℃)避光条件下解冻；

(2)手持移液枪吸取1ml新鲜母乳于4ml规格塑料试管中，再加入1ml饱和硫酸铵；

(3)将该塑料试管放于涡旋仪上震荡1min，充分混匀；

(4)将塑料试管放入离心机内离心5分钟，设定转速为5000r/min；

(5)取离心后清液100ul于玻璃比色皿(内含2ml浓度为0.8mg/ml淀粉溶液)；

(6)滴入100ul浓度为50mmol/L的碘/碘化钾溶液，该过程要求避光；

(7)迅速放入723可见分光光度仪中，读取吸光度值Abs；

(8)将吸光度值Abs代入计算公式求取母乳α-淀粉酶活性值。

下面通过具体的实施例详细说明本发明。

实施例1饱和硫酸铵溶液对母乳的澄清凝结效果

将1ml纯母乳和1ml饱和硫酸铵在塑料试管中混合，另外将1ml去离子水和1ml饱和硫酸铵在塑料试管中混合，离心5min，转移至玻璃比色皿中测定吸光度Abs数值，如图1所示，图1A为1ml纯母乳+1ml饱和硫酸铵，右侧图1B为1ml去离子水+1ml饱和硫酸铵，从图中可以看出，纯母乳在饱和硫酸铵溶液下产生凝结，图1A和1B混合液透明度相当，经723可见分光光度仪检测得到吸光度Abs数值均接近于0。

根据文献中常规前处理方法，首先对母乳样本高速离心去脂，并取1ml在PH＝7.4条件下通过磷酸钾缓冲溶液稀释10倍，制成待测母乳样本,经723可见分光光度仪检测3次，所得吸光度Abs平均值为0.06。

从结果可以得出，本发明的前处理方法能够有效凝结母乳中的脂肪，可有效阻止离心去脂过程中脂肪不可避免再次进入母乳样本而带来的实验误差，也提高操作可行性。

进一步地，用本发明的方法(首先将母乳与饱和硫酸铵混合，然后5000r/min离心处理，检测Abs值)处理不同母乳样本量以及不同母乳与饱和硫酸铵体积比的样本，经饱和硫酸铵预处理后离心测定吸光度Abs数值，结果如表1所示：

序号	母乳量(ml)	饱和硫酸铵量(ml)	Abs值
				1	1.0	1.2	0.001
2	1.0	1.5	0.002
				3	2.0	2.0	0.001
4	4.0	4.0	0.001
				5	5.0	6.0	0.002

从上述结果可知，经有效量的饱和硫酸铵处理后，所得样本的澄清度均较好，Abs值基本均为0，说明本发明的预处理方法可以有效的对母乳进行澄清。

实施例2饱和硫酸铵对α-淀粉酶活性的影响

图2C将1ml饱和硫酸铵溶液与1ml浓度为800U/L的α-淀粉酶标液混合均匀，以5000r/min离心5min；图2D将1ml去离子水与1m浓度为800U/L的α-淀粉酶标液混合均匀，以5000r/min离心5min。分别取100ul加入淀粉溶液，充分反应后加入碘/碘化钾溶液，重复3次，呈现出相同的蓝色变化，图2C和图2D混合溶液经723可见分光仪检测，所得吸光度值Abs平均数值分别为0.501和0.503，可知吸光度值Abs基本相等,证明了饱和硫酸铵对α-淀粉酶活性无影响。

实施例3母乳α-淀粉酶活性的检测

选择某一位哺乳期的母亲，采集母乳样本，母乳α-淀粉酶活性检测过程如下：

(一)配制饱和硫酸铵溶液

在室温(25℃)条件下，准确称取50g硫酸铵晶体，放入100ml的烧杯，再加入足量的蒸馏水至烧杯100ml刻度位置，用玻璃棒搅拌至晶体不能溶解，即配置成饱和硫酸铵溶液，转移至10ml塑料试管备用。

(二)母乳样本前处理

在室温(25℃)避光条件下，手持移液枪吸取1ml新鲜母乳于4ml规格塑料试管中，再加入1ml饱和硫酸铵溶液。将该塑料试管放于涡旋仪上震荡1min，充分混匀。将塑料试管放入离心机内离心5分钟，设定转速为5000r/min。取塑料试管内清液转移到另外一个4ml塑料试管制成待测溶液。按照相同的方法处理4批平行试验。

(三)碘-淀粉比色法测定

取离心后清液100ul于玻璃比色皿(内含2ml浓度为0.8mg/ml淀粉溶液)。滴入100ul浓度为50mmol/L的碘/碘化钾溶液，该过程要求避光。迅速放入723可见分光光度仪中，读取4组样品的吸光度值Abs分别为0.232、0.231、0.232、0.232。将吸光度值Abs代入计算公式(单位U/L)：

其中，代表测定管淀粉的大致水解程度，大小范围为0～1。当测定管淀粉未被水解时，其α-淀粉酶活性为0；含义为在实验条件下，100μl离心清液中的淀粉酶在15分钟内水解0.4mg淀粉，则其活性为800个单位。再将其乘以水解程度，则整个公式代表了测定管α-淀粉酶的活性值AMY。

按照上述方法，同批处理4组母乳样本，求得母乳α-淀粉酶活性值AMY等于614.4U/L。

根据文献中常规前处理方法，首先对母乳样本高速离心去脂，并取1ml在pH＝7.4条件下通过磷酸钾缓冲溶液稀释10倍，制成待测母乳样本,所得清液取100ul加入淀粉溶液，充分反应后加入碘/碘化钾溶液，重复4次，经723可见分光光度仪检测，所得吸光度Abs平均值为0.281。将吸光度值Abs代入计算公式(单位U/L)，求得α-淀粉酶的活性值AMY平均数值为575.2U/L。

从结果中看出，运用本发明的方法对母乳样本进行前处理，能最大程度地的在不损伤母乳淀粉酶活性值的前提下澄清母乳样本，使得比色法能够尽可能准确地运用于母乳淀粉酶活性值的检测。

实施例4检测方法的可重复性测定

根据本发明的前处理方法，依次将1ml母乳样本与1ml饱和硫酸铵溶液混合，将2ml母乳样本与2ml饱和硫酸铵溶液混合，将3ml母乳样本与3ml饱和硫酸铵溶液混合，将4ml母乳样本与4ml饱和硫酸铵溶液混合，将5ml母乳样本与5ml饱和硫酸铵溶液混合，以5000r/min离心5min，所得清液取100ul加入淀粉溶液，充分反应后加入碘/碘化钾溶液，重复3次，经723可见分光光度仪检测得到吸光度Abs平均数值分别为0.232，0.232，0.231，0.233，0.231。将吸光度值Abs代入计算公式(单位U/L)，求得α-淀粉酶的活性值AMY平均数值分别为614.4U/L，614.4U/L，615.2U/L，613.6U/L，615.2U/L。可以看出，本发明的检测方法具有很好的可重复性和准确性。

本发明提供了一种母乳中乳α-淀粉酶活性检测的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。