一种治疗早期子宫内膜异位症的中药单体及其应用
阅读说明：本技术 一种治疗早期子宫内膜异位症的中药单体及其应用 (Traditional Chinese medicine monomer for treating early endometriosis and application thereof ) 是由 曹阳 张婷婷 朱焰 庄梦斐 崔金刚 张瑜 杜尘 王馨悦 王唯迪 于 2020-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种治疗早期子宫内膜异位症的中药单体及其应用,所述中药单体是人参皂苷Rg3。结果表明,人参皂苷Rg3能抑制子宫内膜异位症大鼠的异位内膜的血管生成,但又不会影响在位内膜的形态,说明生理性的血管未受其影响,故其对正常组织毒性极小。因此,人参皂苷Rg3可应用于子宫内膜异位症的早期治疗及腹腔镜术后消除残留术中残留的病灶的治疗,防止复发又不妨碍排卵,符合理想的早期治疗及预防内异症发生的药物。另人参皂苷Rg3能明显下调内异症大鼠血清E2的水平,但对血清P水平无显著影响,提示其可能通过调节体内激素水平,调整体内内分泌环境,在治疗疾病的同时不影响受孕,同时怀孕本身也是对EMs最有效的治疗,实用性强。(The invention relates to a traditional Chinese medicine monomer for treating early endometriosis and application thereof, wherein the traditional Chinese medicine monomer is ginsenoside Rg 3. The results show that the ginsenoside Rg3 can inhibit the angiogenesis of the ectopic intima of the rat with endometriosis, but can not affect the shape of the ectopic intima, which indicates that physiological blood vessels are not affected by the angiogenesis, so the toxicity to normal tissues is extremely low. Therefore, the ginsenoside Rg3 can be applied to the early treatment of endometriosis and the treatment of eliminating residual focus in operation after laparoscopy, prevents relapse without obstructing ovulation, and meets the ideal medicine for early treatment and prevention of endometriosis. In addition, the ginsenoside Rg3 can obviously reduce the level of the serum E2 of rats with the endometriosis, but has no obvious influence on the level of serum P, which suggests that the ginsenoside Rg3 can regulate the hormone level in vivo and adjust the endocrine environment in vivo by regulating the hormone level in vivo, does not influence conception while treating diseases, is the most effective treatment on EMs during pregnancy, and has strong practicability.)
技术领域
本发明涉及中药单体的应用技术领域，具体地说，是一种治疗早期子宫内膜异位症的中药单体及其应用。
背景技术
子宫内膜异位症(内异症，endometriosis，EMs)是妇科常见病、疑难病，由具有生长功能的子宫内膜出现在子宫腔以外部位引起的以盆腔疼痛和***为特点的持续性病变。本病最典型的症状是继发性、进行性加剧的下腹部及腰骶部疼痛，常于经前1～2d发作，经行第1天最甚，同时可伴有***坠胀感，多在经净时消失。子宫内膜异位症的病因和发病机制复杂多变，疼痛、***及诱发卵巢癌风险等并发症严重影响女性的生活质量。临床对子宫内膜异位症的病因病机尚不明确，有研究者认为该病由于经血逆流种植引起，也有研究资料显示其发病机制与血管机淋巴转移、体腔上皮生化等因素相关。有报道称，该病的发生发展涉及自体吞噬功能缺陷、异位细胞失巢凋亡、血管生成、炎症、类固醇激素生成、氧化应激等多个病理过程，这也决定了该病的复杂性和困难程度，尤其对早期疾病的诊断剂治疗存在较多障碍。
研究表明，从痛经或盆腔痛发展为EMs需要一个过程，早期EMs也并不一定合并典型临床症状，患者往往因为痛经加剧或者合并有盆腔包块才就诊，在人体形成肉眼所见EMs病灶需要7年左右的时间，如何在EMs发生早期就进行充分甄别，并进行有效的干预，及时切断EMs的病理发展进程，对于提高有效率、预防EMs的发生，减轻患者痛苦具有重要意义。
中医药在这一方面有着独特的优势。早期内异症病灶的形成，需要病灶周围血管新生以提供氧气和营养，而这些血管多为病理性血管，本研究表明，人参皂苷Rg3能抑制子宫内膜异位症大鼠的异位内膜的血管生成，但又不会影响在位内膜的形态，说明生理性的血管未受其影响，故其对正常组织毒性极小。因此，人参皂苷Rg3可应用于子宫内膜异位症的早期治疗及腹腔镜术后消除残留术中残留的病灶的治疗，防止复发又不妨碍***，符合理想的早期治疗及预防内异症发生的药物。另人参皂苷Rg3能明显下调内异症大鼠血清E2的水平，但对血清P水平无显著影响，提示其可能通过调节体内激素水平，调整体内内分泌环境，在治疗疾病的同时不影响受孕，同时怀孕本身也是对EMs最有效的治疗。
综上所述，我们课题组发现，人参皂苷Rg3可用于子宫内膜异位症的早期治疗，预防内异症的发生，且用药期间还可促进受孕，为治疗内异症的有效中药。其他关于该药治疗内异症的研究未见有此报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种中药单体人参皂苷Rg3的用途。
本发明的再一目的是针对现有技术的不足，提供一种治疗早期子宫内膜异位症的药物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备治疗早期子宫内膜异位症的药物中的应用。
第二方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备抑制子宫内膜异位症大鼠的异位内膜体积及血管生成的药物中的应用。
第三方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备治疗腹腔镜术后消除残留术中残留的病灶的药物中的应用。
第四方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备降低早期子宫内膜异位症患者血清E2的水平的药物中的应用。
第五方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备调节早期子宫内膜异位症患者体内激素水平的药物中的应用。
第六方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备促进早期子宫内膜异位症患者***的药物中的应用。
第七方面，本发明提供了中药单体人参皂苷Rg3在制备改善早期子宫内膜异位症患者受孕情况的药物中的应用。
优选地，所述的药物包括中药单体人参皂苷Rg3和药学上可接受的辅剂。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种治疗早期子宫内膜异位症的药物，所述的药物是由中药单体人参皂苷Rg3和药学上可接受的辅剂制成的。
优选地，药物制剂包括颗粒剂、散剂、胶囊剂、片剂、合剂或口服液。
以上所述的人参皂苷Rg3分子式如下：
本发明优点在于：
本发明首次提出了人参皂苷Rg3用于治疗早期子宫内膜异位症。本领域技术人员熟知，子宫内膜异位症是妇科常见病、疑难病，由具有生长功能的子宫内膜出现在子宫腔以外部位引起的以盆腔疼痛和***为特点的持续性病变，研究表明，从痛经或盆腔痛发展为EMs需要一个过程，早期EMs也并不一定合并典型临床症状，患者往往因为痛经加剧或者合并有盆腔包块才就诊，在人体形成肉眼所见EMs病灶需要7年左右的时间，由于该病病因及机理复杂，现有技术中有很多关于子宫内膜异位症后期的诊断及治疗，但关于早期子宫内膜异位症的治疗微乎其微，本发明针对子宫内膜异位症早期的治疗提供了一种新的中药单体，实验结果表明：人参皂苷Rg3能抑制子宫内膜异位症大鼠的异位内膜体积及血管生成，但不会影响在位内膜的形态，说明生理性的血管未受其影响，故其对正常组织毒性极小。因此，人参皂苷Rg3可应用于子宫内膜异位症的早期治疗及腹腔镜术后消除残留术中残留的病灶的治疗，防止复发又不妨碍***，符合理想的治疗内异症***的药物。另人参皂苷Rg3能明显下调内异症大鼠血清E2的水平，但对血清P水平无显著影响，提示其可能通过调节体内激素水平，调整体内内分泌环境，在治疗疾病的同时不影响受孕。
此外，本研究还表明人参皂苷Rg3可通过抑制VEGFR-2介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制子宫内膜异位症血管新生，而该通路最新研究表明可加速子宫内膜异位症患者卵巢的静止始基卵泡活化，即卵巢储备功能的下降与PI3K/Akt通路的异常激活有关，故这也为人参皂苷Rg3还可能通过抑制此通路来治疗卵巢储备功能下降的EMs***患者，提供了强有力的依据，减轻了该类患者的痛苦，实用性强，有很好的应用前景，
附图说明
附图1是成年雌性SD大鼠***涂片检测。A：动情期***涂片全部是无核角化细胞；B：动情间期***涂片大量白细胞或间有少量上皮细胞，无白细胞。
附图2是EMs大鼠异位内膜组织形态学观察结果。A：白色囊状异位内膜；B：红色结节状异位内膜；→表示异位内膜。
附图3是EMs大鼠子宫内膜组织的HE染色检测。A：异位内膜；B：在位内膜；→表示腺上皮细胞，×100。
附图4是药物处理前、后各组EMs大鼠的周体重增长值。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(n＝12，*：P<0.05)
附图5是治疗前各组EMs大鼠异位内膜的体积。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(n＝12)
附图6是治疗后各组EMs大鼠异位内膜的体积。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(n＝12，*：P<0.05；**：P<0.01)
附图7是各组治疗后对异位内膜的抑制率。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(n＝12，**：P<0.01)
附图8是模型组EMs大鼠给药前、后病灶观察。移植物内有大量液体聚集，呈透明囊状，给药后囊未见明显缩小。A：处理前，B：处理后。
附图9是去势组EMs大鼠治疗前、后病灶观察。A：去势治疗前，B：去势治疗后。给药后移植物萎缩消失。
附图10是孕三烯酮(阳性对照)组EMs大鼠给药前后病灶观察。A：孕三烯酮给药前，B：孕三烯酮给药后。用药后移植物明显缩小。
附图11是低剂量人参皂苷Rg3组EMs大鼠给药前后病灶观察。A：低剂量Rg3给药前，B：低剂量Rg3给药后。移植物有缩小趋势，但透明囊腔仍清晰可见。
附图12是高剂量人参皂苷Rg3组EMs大鼠给药前后病灶观察。A：高剂量Rg3给药前，B：高剂量Rg3给药后。用药后移植物已基本萎缩消失。
附图13是EMs大鼠在位内膜的形态学观察(×100)，A：人参皂苷Rg3低剂量，B：人参皂苷Rg3高剂量，C：孕三烯酮组，D：模型对照组，E：去势组。
附图14是各组间异位内膜厚度的变化(×100)，A：人参皂苷Rg3低剂量组，B：人参皂苷Rg高剂量组，C：孕三烯酮组，D：模型对照组，E：去势组。(→：指向异位内膜；B组、C组、E组异位内膜上皮层高度均显著低于D组)
附图15是人参皂苷Rg3对异位内膜腺上皮高度的影响，A：人参皂甙Rg3低剂量组；B：人参皂甙Rg3低剂量组；C：孕三烯酮组；D：模型对照组；E：去势组。(n＝6；**：与D组相比，P<0.01)。
附图16是人参皂苷Rg3对EMs大鼠血清E2和P水平的影响，A：人参皂甙Rg3低剂量组；B：人参皂甙Rg3低剂量组；C：孕三烯酮组；D：模型对照组；E：去势组。(左：E2；右：P；n＝12；*，**：与D组相比，P<0.05或0.01)。
附图17是EMs大鼠异位内膜组织中VEGF蛋白的免疫组化检测，A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(×400)
附图18是EMs大鼠异位内膜组织中VEGFR-2蛋白的免疫组化检测。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(×400)
附图19是EMs大鼠异位内膜组织中p-Akt蛋白的免疫组化检测。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(×400)
附图20是EMs大鼠异位内膜组织中p-mTOR蛋白的免疫组化检测。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(×400)
附图21是EMs大鼠异位内膜中各待测蛋白IHC检测的平均灰度值。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(*：p<0.05；**：p<0.01；与D组相比)
附图22是EMs大鼠异位内膜中VEGF、VEGFR-2、Akt和mTOR蛋白的WB检测。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。
附图23是EMs大鼠异位内膜中各待测蛋白的相对表达量(WB检测)。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(*：p<0.05；**：p<0.01；与D组相比)
附图24是EMs大鼠异位内膜中各待测mRNA的相对表达量(RT-PCR检测)。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(*：p<0.05；**：p<0.01；与D组相比)
附图25是人参皂苷Rg3对异位内膜凋亡的影响。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(×200)
附图26是各组EMs大鼠异位内膜组织中细胞凋亡活性的检测(TUNEL法)。A：低剂量Rg3组；B：高剂量Rg3组；C：孕三烯酮组；D：模型组；E：去势组。(*：p<0.05，与D组相比；n＝6)
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1中药颗粒
制备方法如下：
取中药单体人参皂苷Rg3和颗粒剂辅剂，按照颗粒剂常规制剂方法制成即可。
实施例2中药胶囊
制备方法如下：
取中药单体人参皂苷Rg3和胶囊剂辅剂，按照胶囊剂常规制剂方法制成即可。
实施例3人参皂苷Rg3对子宫内膜异位症大鼠的治疗作用
1.1实验材料
1.1.1实验动物
健康成年(6-7周龄)的SPF级雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200g)购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2013-0016，合格证号：0022017。
1.1.2试剂与设备
1.1.2.1药物：
(1)人参皂苷Rg3购自上海盛中医药化工有限公司；批号140321；含量≥95％；性状白色粉末。
(2)孕三烯酮购自北京紫竹药业有限公司；批号06001011002；含量99.9％；性状白色粉末。
1.2实验方法
1.2.1SD雌性大鼠的饲养和动情周期监测：
成年雌性SD大鼠饲养于上海市计划生育科学研究所SPF级啮齿类实验动物房(许可证号:SCXK(沪)2013-0016)，室温控制在25℃±1℃，相对湿度控制在50％±10％，日光灯照12小时；予自由进食水，饲料购自上海仕林生物科技有限公司，产品标准编号：Q/TJCX1-2010，企业生产证编号：沪饲审(2008)04301。
造模前进行两周适应性饲养，期间每天检测***细胞，以监测大鼠动情周期：将大鼠固定，暴露下腹部，用玻璃棒旋转轻轻***大鼠***内约0.5cm，慢慢转动一周后取出，涂片，空气中自然挥干；显微镜下观察细胞类型，将连续2次或更多的4～5天性周期正常的大鼠列为实验对象。见图1。
1.2.2EMs大鼠模型的建立：
1.2.2.1EMs大鼠模型的制备：
参照Jones方法，选用动情周期正常的成年SD雌性大鼠，于动情期进行手术造模：在无菌条件下，用异戊巴比妥钠(30mg/ml)腹腔注射大鼠(60mg/kg)进行麻醉，术前肌注庆大霉素，备皮，腹部消毒后剖腹，游离左侧子宫，剪下一段子宫组织，放入含灭菌的生理盐水中；将子宫组织剖开，剥去子宫外侧的肌肉层，留下子宫内膜组织，并将其剪切呈约0.5mmx0.5mm大小的组织块；将一侧腹壁用手指翻出、顶起，暴露出血管丰富的腹壁，将子宫肌层面紧密地贴在血管上，然后用无伤害的缝针将子宫内膜的四角缝住；将造膜的腹壁轻轻的退回，缝上肌肉层和皮肤，造模结束，放回笼中后待醒；从腹壁种植第1天开始皮下注射苯甲酸***(30μg/kg)，连续注射3天。
1.2.2.2EMs表型的鉴定：
模型建立三周后，二次开腹，观察移植物的生长情况。根据文献报道的EMs造模成功的标准：移植灶体积增大，呈透明的结节状，囊状、有澄清液体积聚，移植物被***覆盖并有血管形成，质地软等，作为大体判定标准。用电子卡尺测量异位子宫内膜的长(mm)、宽(mm)、高(mm)，并记录。
1.2.3EMs大鼠的给药处理和取材：
1.2.3.1实验药物剂量的确定
根据文献，大鼠与临床用药剂量的换算公式，dB＝dA×KB/KA，按60kg的人每日摄入药量换算得出人参皂苷Rg3大鼠每千克体重剂量为5mg/d，并结合预实验的结果，设该剂量为低剂量组，并以该剂量的2倍剂量，即人参皂苷Rg3剂量为10mg/(kg·d)为高剂量组。阳性对照药物孕三烯酮的剂量根据参考文献，以人剂量的6倍确定大鼠的剂量。
1.2.3.2EMs大鼠的分组和处理：
计算异位内膜的体积(V1)，以V1 20mm3作为入组标准。休息3天后，将入组EMs大鼠随机分成五组，用不同的药物进行处理(表1)。
表1、EMs大鼠的分组及给药处理方案
1.2.3.3取材：
各组EMs大鼠在相同条件下灌胃21d后，于麻醉状况下打开腹腔，腹主动脉取血，分离血清，-20℃保存待测；再次测量异位内膜的体积(V2)，计算药物对异位内膜生长的抑制率(抑制率＝(V1－V2)/V1×100％)，并取下异位内膜组织，部分组织置于10％***液中，用于苏木素-伊红(HE)染色检测。
1.2.4EMs大鼠异位子宫内膜组织的HE染色观察：
石蜡包埋及切片：将放在甲醛固定液中的大鼠子宫与异位内膜，依次石蜡溶液浸泡包埋。将包埋好的蜡块固定于切片机上，切取5m连续厚切片，37℃水上展片，待组织切片完全展开后，去除水滴，切片放入60℃烤箱中烘烤2h后备用；
HE染色：
(1)切片放入二甲苯I，二甲苯Ⅱ中依次脱蜡5min。
(2)梯度酒***化:100％、95％、70％乙醇，各级为2min。蒸馏水洗涤。
(3)苏木精染液染色2min。
(4)流水冲洗20min，使细胞核呈蓝色，蒸馏水洗。
(5)0.1％伊红染液染色2min。
(6)依次85％、95％、100％乙醇脱水，每级1min。二甲苯透明2min×2次。
(7)封片：滴加适量中性树胶：二甲苯＝1：1溶液，加盖玻片封片。
镜检：切片在倒置显微镜下放大100倍，通过数码相机随机摄取三张异位内膜上皮层的照片，将照片输入计算机Qwin7图象分析系统中,每张照片测定三个上皮层高度，取其平均值作为上皮层高度。
1.2.5EMs大鼠血清***(E2)和孕激素(P)含量的电化学发光法检测：
(1)各组EMs大鼠腹主动脉血样品，3000rpm，离心10min，取上层血清；参照电化学发光法(ECLI)试剂盒说明书方法，测定血清中的E2和P的浓度：
(2)第一次孵育：35μl样品中添加生物素标记的激素特异性抗体，形成免疫复合物。
(3)第二次孵育：加入包被链霉亲和素的磁珠微粒和釕复合物标记的激素衍生物，形成抗体、半抗原复合物。
(4)将反应液吸入测量池中，通过电磁作用将磁珠吸附在电极表面。未与磁珠结合的物质通过Procell被去除。电极加压使复合物发光，测量发光强度。
(5)仪器通过2点定标效正试剂条形码包含的厂商定标曲线，自动计算得到检测结果。
1.2.6统计学方法：
采用SPSS17.0软件进行统计分析，符合正态分布的实验数据以均数±标准差(±s)表示，根据方差齐性检验结果，采用LSD或Games-Howell法进行单因素方差分析；不符合正态分布的数据采用中位数±四分位间距[M±Q]，数据采用Kruskal-Wallis H检验分析，组间两两比较用Mann-Whitney检验，检验水平α＝0.05。
1.3结果
1.3.1EMs大鼠异位内膜组织的形态学特征：
EMs大鼠自体子宫内膜移植三周后，剖腹探查可以看到：异位灶位于腹壁上，外观表现体积增大，有的呈透明囊状，质地较软(图2A)；有的呈红色结节状，***覆盖基底并有血管形成，质地较硬(图2B)
1.3.2EMs大鼠在位内和异位内膜的组织学特征：
对EMs大鼠的在位和异位内膜组织进行HE染色后观察发现，异位内膜较薄，腺体成囊状，腺体数量少见，仅少量核下空泡，有分泌活动，并可见脱落现象，腺腔内有炎性渗出物，间质排列不规则，部分生长活跃，血管分布不均匀(图3A)。在位内膜组织形态随动情周期的变化而变化，腺上皮细胞多为柱状，个别为立方状，可见到核下空泡和顶浆分泌，腺体数量多，腺腔内分泌活跃，且间质排列规则，血管分布正常(图3B)。
1.3.3人参皂苷Rg3对大鼠周体重增长变化的影响：
大鼠给药前及给药后三周内，每周称重一次，并计算大鼠体重周增长情况，公式为：周增长体重(g)＝后一周体重(g)-前一周体重(g)，取三周体重增长的平均数进行比较。结果显示：给药前各组大鼠的周体重增长数无显著差异(P>0.05)；各组给药前、后，除去势组(E)周体重呈增长趋势外，低剂量Rg3组(A)、高剂量Rg3组(B)、孕三烯酮组(C)和模型组(D)大鼠的周体重增长都有不同程度的下降；与模型组相比，给药后孕三烯酮组周体重增长数显著下降，而去势组周体重增长数显著增高(P<0.05)，而高、低剂量Rg3组周体重增长数无显著变化(表2，图4，提示人参皂苷Rg3在大鼠体内无明显副作用，也未出现致死等其它明显的不良后果，提示其可能具有较高的安全性。
表2、各组用药前后周体重增长情况
(注：*表示P<0.05，与用药后D组相比)
1.3.4人参皂苷Rg3对大鼠异位子宫内膜生长的抑制作用：
对各组EMs大鼠用药前、后异位内膜的体积及抑制率进行计量和非参数检验统计分析后发现：用药前各组大鼠的异位内膜体积无显著差异(P>0.05)，用药后，高剂量Rg3组(B)、孕三烯酮组(C)和去势组(E)的异位内膜体积与模型组相比，有显著差异(P<0.05)，而且高剂量Rg3组(B)与孕三烯酮组(C)之间没有显著差异(P>0.05)(表3，图5-7)，说明高剂量Rg3对异位内膜生长的抑制作用与孕三烯酮相近。
表3、人参皂苷Rg3对EMs大鼠异位子宫内膜体积的影响
注：**P＜0.01，*P＜0.05(与D组比较)
我们在受试大鼠给药21天后剖腹观察病灶，发现模型组异位子宫内膜的体积无明显变化，并有增大趋势，而且内膜囊泡积液仍存在(图8)。与对照组相比，去势组(图9)、孕三烯酮组(图10)和高剂量Rg3组(图12)给药后，移植物均明显萎缩，而且孕三烯酮组与高剂量Rg3组之间未见明显差别，提示高剂量Rg3的治疗效果与孕三烯酮相近。
1.3.5人参皂苷Rg3对EMs大鼠在位内膜组织形态的影响：
各组EMs大鼠的在位内膜组织切片经HE染色后，显微镜下观察形态学表现，结果显示：除了去势组(E)EMs大鼠的在位内膜发生萎缩外，其它各组EMs大鼠的在位内膜腺上皮细胞均呈柱状或立方体，间质排列规则，血管分布正常，提示Rg3和孕三烯酮给药后不会影响在位内膜的形态(图13)。
1.3.6人参皂苷Rg3对EMs大鼠异位内膜组织形态的影响：
各组EMs大鼠异位内膜组织切片经HE染色后，显微镜下观察发现：模型对照组异位内膜生长较好，内膜上皮呈柱状、立方状，胞浆丰富，腺体数量较其它各组多，腺上皮细胞呈高柱状或矮柱状，排列在囊泡内腔面，细胞间连接较紧密，细胞核大，呈椭圆形，腔内有炎性渗出物(图14D)；去势组异位内膜间质萎缩，有的可见无分泌现象的腺上皮细胞。有的异位内膜完全萎缩、退化，仅见周围肌肉组织(图14E)；其它各用药组均表现为不同程度的上皮变薄萎缩以及腺体的减少和萎缩(图14A、B、C)。同时，我们也通过检测异位内膜组织的上皮层高度，观察Rg3对异位内膜组织形态的影响，结果显示：模型对照组异位内膜上皮层高度较高，与模型组对照相比，人参皂苷Rg3高剂量组(B)、孕三烯酮组(C)及去势组(E)内膜上皮层高度均显著低于对照组(D)(P<0.01)(表4，图15)，提示这3组EMs大鼠异位内膜上皮层的生长受到有效抑制。
表4、人参皂苷Rg3对异位内膜腺上皮高度的影响
注：**表示P＜0.01，与模型组相比。
1.3.7人参皂苷Rg3对大鼠血清中E2和P水平的影响：
用药三周后，人参皂苷Rg3高剂量组(A)、孕三烯酮组(B)及去势组(E)的血清E2水平较模型组(D)有明显下降(P<0.05)；孕三烯酮组(B)及去势组(E)的血清P水平也较模型组(D)有明显下降(P<0.05)，但人参皂苷Rg3高、低剂量组(A和B)的血清P水平与模型组(D)相比，无明显变化，提示人参皂苷Rg3对EMs大鼠血清E2水平有降调作用，而对血清P水平无显著影响(表5，图17)。
表5、EMs大鼠用药后血清E2和P水平
注：**P<0.01，*P<0.05(与D组比较)
实施例4人参皂苷Rg3对大鼠异位内膜中VEGFR-2介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响
在实施例3中，我们利用EMs大鼠模型，以孕三烯酮作为阳性对照药物，观察了人参皂苷Rg3的在体疗效，结果发现高剂量人参皂苷Rg3能有效抑制异位内膜的生长，具有与孕三烯酮相近的疗效，且未见有明显的毒副作用。为了进一步探讨Rg3的作用机制，我们拟利用EMs大鼠模型，通过免疫组化、Western blot和实时定量PCR检测，观察人参皂苷Rg3对异位内膜组织中VEGF、VEGFR-2、Akt及mTOR蛋白表达水平的影响，并通过Tunel法检测，观察Rg3对异位内膜细胞凋亡活性的影响，以明确人参皂苷Rg3是否通过干扰VEGFR-2介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路活性而抑制异位内膜的存活和生长。
1.1实验材料
1.1.1实验动物：
健康成熟未交配过的SPF级雌性SD大鼠(6-7周龄，180-200g)购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号:SCXK(沪)2013-0016；合格证号0022017。
1.1.2试剂与设备：
1.1.2.1药物：
(1)人参皂苷Rg3购自上海盛中医药化工有限公司；批号140321；含量≥95％；性状白色粉末。
(2)孕三烯酮购自北京紫竹药业有限公司；批号06001011002；含量99.9％；性状白色粉末。
1.2实验方法
1.2.1EMs大鼠的处理和取材：
EMs大鼠模型的建立及实验分组给药方法同实施例3(1.2.2和1.2.3)。各组EMs大鼠灌胃给药21天后，麻醉状况下打开腹腔，腹主动脉取血，并收集大鼠异位子宫内膜组织，取部分内膜组织样品置于10％***缓冲液中，固定48h，其余组织样品置于-80℃液氮中保存备用。
1.2.2EMs异位内膜中各待测蛋白的免疫组织化学检测(ABC法)：
1.2.2.1石蜡切片的制作：
将大鼠异位内膜组织进行常规石蜡包埋，并连续切取4μm厚切片，56℃烘烤1h，37℃下烘干过夜，备用。
1.2.2.2免疫组织化学染色(ABC法)：
(1)染色前，将切片置于60-65℃温箱烘烤30-60min；
(2)脱蜡至水；
(3)3％H2O2去离子水孵育10min，蒸馏水洗3次；
(4)煮沸热修复法抗原：先将组织切片放入0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)的烧杯中，加热至沸腾后断电，间隔5-10min，重复1次，冷却后摇床上PBS洗，3min×3；
(5)加一滴内源性过氧化酶阻断剂(试剂A)，室温孵育10min，PBS洗，3min×3；
(6)除去PBS，加一滴正常山羊血清，室温孵育20min，甩去多余液体，不洗；
(7)加1:100稀释的一抗(兔抗大鼠VEGF、VEGFR-2、p-Akt或p-mTOR抗体)，置湿盒内，4℃，过夜，PBS洗，5min×3；
(8)除去PBS，加1滴生物素标记二抗(试剂C)，室温孵育15min，PBS洗，3min×3；
(9)加1滴辣根过氧化物酶标记的链酶素亲和素(试剂D)，室温孵育15min，PBS洗，3min×3；
(10)加2滴新鲜配置的DAB溶液，混合均匀，室温显色，显微镜下控制反应时间，约5-10min，双蒸水洗去杂质；
(11)苏木素复染，梯度酒精逐步脱水，滴加中性树胶封固；
(12)镜下观察，拍照。
1.2.2.3结果分析：
应用Nikon显微镜观察免疫组化切片，采用Motic图像分析系统，镜下观察各组染色结果，测定VEGF、VEGFR-2、p-Akt及p-mTOR表达区域的细胞灰度值，每组取6张切片，每张切片选3个区域，其平均值为该张切片的灰度值，受体表达越强，相对灰度值越高。所有拍照和测量均在相同条件下进行。
1.2.3EMs异位内膜中各待测蛋白表达水平的Westernblot检测：
1.2.3.1组织总蛋白的抽提：
(1)用灭菌小剪刀将组织块剪为1mm3大小；
(2)加入RIPA(每100mg组织加1ml RIPA)及与RIPA体积等量的蛋白酶抑制剂，冰浴匀浆后放置30min；
(3)将样品转移到1.5ml EP管中，4℃下，12000g离心30min；
(4)吸出上清液，分装后，于-20℃保存。
1.2.3.2蛋白样品的制备：
将匀浆液与5×SDS上样缓冲液(4:1)混匀，100℃加热5min，冰浴冷却，待加样。
1.2.3.3蛋白定量(微孔板法)：
表6
(1)按上表标记各管号，分别将标准品按以上比例进行稀释；
(2)取A-I各种浓度的标准品及待测样品各25μL；
(3)加入200μL工作液(A液：B液＝50：1)，30s混匀；
(4)37℃孵育30min，冷却至是室温；
(5)酶标仪波长为562nm情况下，读取OD值，并根据标准品已知浓度与读取的OD值绘制标准曲线。
1.2.3.4制胶：
(1)分离胶(pH 8.8)
用注射器将配制好的溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上覆盖0.1％SDS，放置1h左右至聚合完全。
(2)积层胶(pH 6.8)
使用Whatman 3mm滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液，如上配制积层胶。用10ml注射器将积层胶加入板中至顶端，小心***梳子，注意不要产生气泡。凝胶聚合1h左右。
1.2.3.5转膜：
电泳后，切下需要进行转膜的部分胶，放入电转缓冲液中平衡30min，同时将3张滤纸放入电转缓冲液中，PVDF膜先放入甲醇中泡30s，去离子水漂洗5min，放入电转缓冲液中20min。从负极到正极的放置顺序是泡沫、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、泡沫。16V恒压，4℃过夜。丽春红染色3-5min，脱色液脱色后，去离子水漂洗后干燥备用。
1.2.3.6抗体孵育：
用5％BSA封闭1h；TBST漂洗，5min，3次；用5％BSA稀释各待测蛋白的一抗(1:800稀释)，37℃孵育90min；TBST漂洗，5min，3次；5％BSA稀释二抗(1:3000稀释)，内参为β-actin(1:10000),37℃孵育50min；TBST漂洗，5min，3次。
1.2.3.7显色：
将TBST冲洗后的膜，吸干表明液体，加适量ECL反应液，室温30min，放入凝胶成像系统中拍照。
1.2.3.8结果分析：
用Image J图像分析软件对结果进行半定量分析，设定每个标本的内参浓度为一个固定值，测定每个标本的目的蛋白灰度值及内参灰度值，以目的蛋白灰度值与GAPDH灰度值比值代表目的蛋白的相对含量。
1.2.4EMs异位内膜中各待测蛋白表达水平的实时定量PCR检测：
1.2.4.1组织总RNA的抽提：
(1)匀浆：称取0.1g组织，放入装有1ml Trizol的10ml离心管中，冰浴中用电动匀浆器进行匀浆，然后转移至一新的1.5ml离心管内，室温静置5min；
(2)两相分离：加入2001氯仿，震荡混匀，室温静置5min，4℃下，14000rpm离心15min；
(3)RNA沉淀：收集上层水相转移到新离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后置于-80℃沉淀1h，4℃下，14000rpm离心20min，弃上清，收集沉淀；
(4)RNA清洗：移去上清液，每1ml TRIZOL试剂匀浆的样品中，加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀，振荡后，4℃下，7500×g，离心5min；
(5)RNA溶解：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10min，加入适量体积的DEPC-水，至完全溶解，-70℃冻存；同时取少量样品进行电泳与紫外分析检测，合格后用于后续实验。
1.2.4.2逆转录(RT)反应：
取1-4μg组织总RNA，加入到0.2ml无RNase的PCR管中，加入Oligo dT或RandomPrimer 1l，用DEPC-水补充体积至12μl，混匀后，70℃中放置5min，再冰浴中放置3-5min，然后在PCR管中依次加入：
最终体积为20μl，混匀后42℃下放置60min，再于70℃下放置10min后，于-20℃下保存，备用。
1.2.4.3引物：
引物设计是根据GenBank检索的目的基因序列，用primer5设计扩增引物序列，并于Pubmed网站Blast检测引物特异性，TAKARA基因公司合成引物。各待测基因名称和引物序列见下表：
1.2.4.4Real-time PCR反应：
(1)PCR体系：RT产物(或梯度稀释标准品)1l
(2)反应条件：95℃，5min；95℃，15s；58℃，20s；共45个循环。
1.2.4.5结果分析：
PCR仪能够对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时监测，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线，每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。
1.2.5EMs大鼠异位内膜组织中细胞凋亡活性的TUNEL检测：
1.2.5.1检测步骤：
(1)石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯，无水乙醇，酒精，蒸馏水洗。
(2)透膜：滴加20g/ml不含DNase的蛋白酶K工作液，37℃孵育30min，PBS洗2次。
(3)反应：每个组织滴加50μl的TUNEL反应液，阴性对照同时加50μl的LabelSolution，37℃湿盒避光孵育60min，PBS洗2次。
(4)染核：每个组织滴加50μl的DAPI(1：2000)工作液，37℃湿盒避光孵育10min，PBS洗2次。
(5)封片：抗荧光淬灭封片剂封片。
(6)观察及拍照：荧光显微镜拍照观察(激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm)。
1.2.5.2结果分析：
Image pro-plus 6.0软件分析凋亡tunel图片方法：每组内每张切片随机挑选3个200倍视野进行拍照。拍照时让组织充满整个视野。应用Image-Pro Plus6.0软件对每张照片进行分析得出凋亡的细胞(绿色荧光)占总细胞个数(蓝色荧光)比即为该视野的凋亡指数(AI)，3个视野的AI平均值即为该样本的AI。
1.2.6统计分析方法：
实验数据结果均以(平均值士标准差)表示。以SPSS17.0统计分析软件进行数据整理及数据统计分析，符合正态分布的实验数据以均数±标准差
1.3实验结果
1.3.1Rg3对大鼠异位内膜中各待测蛋白信号强度影响的IHC检测结果：
免疫组化检测结果显示：VEGF(图17)和VEGFR-2(图18)蛋白在大鼠子宫腺上皮细胞、***及血管内皮细胞内均有表达，以腺上皮细胞表达为强。p-Akt(图19)和p-mTOR(图20)蛋白的表达主要位于子宫内膜的***胞浆中，腺上皮胞浆也有少量表达。我们用平均灰度值来表示各待测蛋白信号的强度，模型对照组的内膜组织中，VEGF、VEGFR-2、p-Akt及p-mTOR蛋白的信号强度分别为56.02±8.20、43.28±5.90，48.83±7.61，53.97±5.69(表7D)。与模型对照组相比，人参皂苷Rg3高剂量组(表7B)、孕三烯酮组(表7C)和去势组(表7E)的异位内膜组织中，VEGF、p-Akt和p-mTOR蛋白的信号强度均显著降低(P<0.05)，提示这3个蛋白的表达量减少。由于去势组EMs大鼠体内激素水平较低，内膜明显萎缩，因此VEGFR-2蛋白信号明显减少，其平均灰度值与模型对照组比较显著降低(P<0.01)，其余各组与模型对照组相比无显著性差异(P>0.05)(表7，图21)。
表7、大鼠异位内膜中VEGF、VEGFR-2、p-Akt和p-mTOR蛋白信号强度
注：**P＜0.01，*P＜0.05(与D组比较)
1.3.2Rg3对大鼠异位内膜中各待测蛋白表达水平影响的WB检测结果：
Western blot(WB)检测结果显示，用药后EMs大鼠异位内膜组织中除VEGFR-2外，VEGF、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平均下调，人参皂苷Rg3高剂量组(B)、去势组(E)、孕三烯酮组(C)与模型对照组(D)间有显著差异(P<0.05)，这与免疫组化检测结果基本一致，但对总Akt和mTOR蛋白表达水平无明显影响(图22，表8和图23)。
表8、大鼠异位内膜中VEGF、VEGFR-2、p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量
注：**P<0.01,*P＜0.05(与D组比较)
1.3.3Rg3对大鼠异位内膜中各待测mRNA表达水平影响的PCR检测结果：
1.3.3.1RNA质量检测：
紫外吸收测定法：从各组EMs大鼠异位内膜组织中抽提的总RNA，经分光光度计检测OD值，计算RNA浓度，结果如表9所示，样品的OD260/OD280值均在1.9-2.0之间，说明没有DNA和蛋白质污染，纯度符合实验要求。
表9、EMs大鼠异位内膜组织总RNA样品的质量检测结果
1.3.3.2各待测mRNA表达水平的检测结果：
对抽取的VEGF、VEGFR-2、Akt及mTOR基因，进行实时定量PCR扩增，在各组大鼠异位内膜细胞的相对表达量见表10，可见除VEGFR-2外，人参皂苷Rg3高、孕三烯酮组和去势组均能显著降低VEGF、Akt及mTOR在大鼠异位子宫内膜细胞中的表达(P<0.05)，结果与免疫组化基本一致。(表10，图24)。
表10、异位内膜中VEGF、VEGFR-2、Akt和mTORmRNA相对表达量
注：*P<0.05，**P<0.01(与D组比较)
1.3.4人参皂苷Rg3对异位内膜细胞凋亡活性的影响：
如图25所示，凋亡主要发生在异位内膜***内，但与模型对照组(D)相比，去势组(E)间质萎缩明显，荧光标记不明显；人参皂苷Rg3组(A和B)核小体内颗粒松散，核裂解现象明显，提示人参皂苷Rg3可促进异位内膜***核裂解。细胞凋亡强度与异位内膜间质的丰富程度有关，与模型对照组相比，人参皂苷Rg3高剂量组异位内膜的荧光细胞明显增多，即发生凋亡的细胞数增多，提示Rg3能促进异位内膜***的凋亡(表11，图26)。
表11、EMs大鼠异位子宫内膜组织的细胞凋亡指数
早期内异症病灶的形成，需要病灶周围血管新生以提供氧气和营养，而这些血管多为病理性血管，本研究表明，人参皂苷Rg3能抑制子宫内膜异位症大鼠的异位内膜的血管生成，但又不会影响在位内膜的形态，说明生理性的血管未受其影响，故其对正常组织毒性极小。因此，人参皂苷Rg3可应用于子宫内膜异位症的早期治疗及腹腔镜术后消除残留术中残留的病灶的治疗，防止复发又不妨碍***，符合理想的早期治疗及预防内异症发生的药物。另人参皂苷Rg3能明显下调内异症大鼠血清E2的水平，但对血清P水平无显著影响，提示其可能通过调节体内激素水平，调整体内内分泌环境，在治疗疾病的同时不影响受孕，同时怀孕本身也是对EMs最有效的治疗。
此外，本研究还表明人参皂苷Rg3可通过抑制VEGFR-2介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制子宫内膜异位症血管新生，而该通路最新研究表明可加速子宫内膜异位症患者卵巢的静止始基卵泡活化，即卵巢储备功能的下降与PI3K/Akt通路的异常激活有关，故这也为人参皂苷Rg3还可能通过抑制此通路来治疗卵巢储备功能下降的EMs***患者，提供了强有力的依据。
综上所述，我们课题组发现，人参皂苷Rg3可用于子宫内膜异位症的早期治疗，预防内异症的发生，且用药期间还可促进受孕，为治疗内异症的有效中药。其他关于该药治疗内异症的研究未见有此报道。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院
<120> 一种治疗早期子宫内膜异位症的中药单体及其应用
<130> /
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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agtgccagcc tcgtctcata g 21
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ttggagaacc agcccataag a 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atgagatgtc gcttgcttga taa 23
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