miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用
阅读说明：本技术 miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用 (Application of miR-140-3p in preparation of lung adenocarcinoma treatment medicine ) 是由 吴朔明 于 2020-07-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用,属于生物医药技术领域。本发明证实了miR-140-3p可以通过抑制LUAD细胞中的Wnt/β-catenin信号传导,从而增强顺铂敏感性并减弱干细胞样特性。由此可知,miR-140-3p可用于制备肺腺癌治疗药物,为治疗肺腺癌(LUAD)的化学耐药性提供潜在的策略。(The invention discloses application of miR-140-3p in preparation of a lung adenocarcinoma treatment drug, and belongs to the technical field of biological medicines. The invention proves that miR-140-3p can enhance cis-platinum sensitivity and weaken stem cell-like characteristics by inhibiting Wnt/beta-catenin signaling in LUAD cells. Therefore, miR-140-3p can be used for preparing lung adenocarcinoma treatment medicines and provides a potential strategy for treating chemical resistance of lung adenocarcinoma (LUAD).)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用。
背景技术
目前，肺癌仍然是世界范围内与癌症相关的主要死亡原因之一，而非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌的主要形式，约占肺癌总数的80％。近年来，肺腺癌(LUAD)是非小细胞肺癌发展最快的亚型。顺铂可以改变DNA的结构和功能，被广泛用作一线NSCLC治疗药物并延长患者生存期，然而，它的功效常常会由于化学抗药性的发展而受损。肿瘤细胞对化学疗法的抗性总是表现出更多的恶性行为，例如更高的增殖能力和更强的抗凋亡能力。
肿瘤干细胞(CSCs)由于具有自我更新、分化、应激或耐药等功能，近年来受到广泛关注。CSCs在包括LUAD在内的多种人类癌症中都有报道。尽管CSCs只是一小部分肿瘤细胞，但在肿瘤的发生、发展，以及对放射疗法和化学疗法的抵抗中起着至关重要的作用。研究证实，CSCs受许多信号传导途径的调控，例如Wnt/β-catenin，Notch和Hedgehog。因此，通过靶向调节这些细胞的信号通路来抑制CSCs可以增加肺癌治疗的敏感性。
miRNAs是短的非编码RNA家族，通过直接结合其mRNA靶标的3'非翻译区(3'UTR)负调控基因表达，参与多种生物学过程的调控，例如癌细胞增殖、凋亡、敏感性化疗和CSCs干燥。先前的研究表明，许多miRNA在肺癌中被上调或下调，从而通过调节CSCs相关的信号通路而增强了对化学疗法的抗性和干细胞样特性。但是，miR-140-3p在LUAD中的表达和功能仍然未知。
发明内容
本发明的目的是提供miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用，为治疗肺腺癌(LUAD)的化学耐药性提供潜在的策略。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术手段：
miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用。
所述miR-140-3p的核苷酸序列为：
TTTTGAATAAAGCAGCATTCAGTTGAAATAACCCTTTCTGTGGTAATTCCAAGTGAATATTTTTCTTCTAGGTGATGAGTTTCTACTTCCTCTGGTTTTTACAACAGGAAATGAAATGGTATCTAAAATAAACAAGCTGTTTATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO.1)。
进一步地，miR-140-3p可以增强肺腺癌细胞对顺铂的敏感性。
进一步地，miR-140-3p可以减弱肺腺癌细胞的干细胞样特性。
一种肺腺癌治疗药物，包括顺铂和与载体结合的miR-140-3p。
本发明证实了miR-140-3p可以通过抑制LUAD细胞中的Wnt/β-catenin信号传导，从而增强顺铂敏感性并减弱干细胞样特性。由此可知，miR-140-3p可以在有效的治疗策略中发挥作用，而靶向miR-140-3p可以是提高LUAD中顺铂敏感性的策略。
附图说明
图1为实施例1中miR-140-3p在LUAD中下调后的结果。
图2为实施例2中miR-140-3p对顺铂敏感性的影响。
图3为实施例3中miR-140-3p对LUAD细胞的干细胞样特性的影响。
图4为实施例4中miR-140-3p减弱了LUAD细胞中Wnt/β-catenin信号通路。
图5为实施例4中Wnt/β-catenin信号通路介导miR-140-3p对LUAD细胞的干细胞样特性的影响。
图6为实施例4中Wnt/β-catenin信号通路介导miR-140-3p对LUAD细胞的顺铂敏感性的影响。
具体实施方式
根据来自GEO和TCGA数据库的公开数据，发明人发现LUAD样品中的miR-140-3p表达低于正常肺组织，并且其表达与患者生存率呈正相关，这表明miR-140-3p可能与是LUAD的良好预后因素。
顺铂作为一线化疗药物广泛用于治疗包括LUAD在内的许多癌症。然而，化疗耐药性仍然是治疗失败的主要挑战。因此，提高LUAD细胞的顺铂敏感性是有效治疗癌症的重要策略。通过集落形成测定、MTT测定和Caspase-3测定，本发明证实了miR-140-3p的上调增强了LUAD细胞对顺铂的敏感性。同时，miR-140-3p的表达上调减少了LUC细胞中CD133+细胞的数量，减弱了肿瘤球的形成，并降低了多能性因子的表达。也就是说，miR-140-3p可能在调节对顺铂的敏感性和LUAD细胞的干细胞样特性中起关键作用，并成为LUAD的治疗靶标。
另外，本发明还进一步研究了miR-140-3p对Wnt/β-catenin信号通路激活的影响，并发现miR-140-3p的上调抑制了Wnt/β-catenin信号通路的激活，而Wnt/β-catenin信号通路的重新激活部分恢复了顺铂耐药性和LUAD细胞的癌干细胞样特性。同时，考虑到肿瘤抑制因子P53是许多与肿瘤相关的事件的中心，例如干性和治疗耐药性。本发明还进一步研究了在本发明中选择的细胞系中的P53法规，发现在蛋白质水平上miR-140-3p模拟细胞和对照模拟细胞之间没有差异(数据未显示)，表明这些miR-140-3p介导的表型不依赖于P53。总之，本发明的结果表明，miR-140-3p/Wnt/β-catenin信号传导对癌症干细胞样特性具有重要影响，并且可能在LUAD中对顺铂耐药性起新的调节作用。
以下结合具体实施例，进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。
本发明实施例中采用的实验方法具体如下：
1.细胞培养和细胞转染
人支气管上皮细胞系BEAS-2B和肺腺癌细胞系A549、H1299、H292和Calu3来自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，美国)。BEAS-2B在BEBM培养基(瑞士巴塞尔的Lonza Group Ltd.)中培养，所有肺腺癌细胞系在100μg/mL青霉素/链霉素10％胎牛血清(FBS；Gibco；Thermo Fisher Scientifc，Inc.，Waltham，MA，USA)的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI)1640培养基(Gibco；Invitrogen；Thermo Fisher Scientifc，Inc.)中培养，培养条件为37℃、5％CO2。
转染事，在六孔板中培养细胞，并用质粒(pcDNA3.1-ctnnb1或pcDNA3.1-Vector，GenePharma Company，中国上海)或模拟物(miR-140-3p模拟物5'-UACCACAGGGGGUAGAACCACGG-3'或对照模拟物5'-GCAAGAGACAAGCGCUUAGCC-3'，GenePharmaCompany，中国上海)通过Lipofectamine2000(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.)获得。详细地，将2μg质粒或50nM模拟物添加到一个小瓶中的200μl Opti-MEM(Gibco；赛默飞世尔科技公司)中，然后在另一个小瓶中，将4μL Lipofectamine 2000与200μlOpti-MEM培养基混合。在室温下孵育5分钟后，将两个小瓶合并，并在室温下再孵育20分钟。将该混合物加入细胞培养物中。在37℃下孵育6h后，将细胞培养基替换为新鲜培养基。在48小时收获转染的细胞。
2.RNA提取和实时qPCR测定
根据制造商的规程，使用Trizol试剂(Invitrogen；Thermo Fisher FisherScientific公司)提取培养细胞的总RNA。为了检测mRNA或miRNA，使用具有dNTP(PromegaCorporation)和随机引物(Promega Corporation)的莫洛尼氏鼠白血病病毒RT试剂盒(M-MLV，Promega Corporation)合成cDNA。由RiboBio设计并合成了miR-140-3p和内部参考U6的特异性引物。逆转录反应的温度规程包括在37℃下60分钟合成cDNA和在80℃下2分钟终止的cDNA合成。根据制造商的说明，使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix(Fermentas)和Bio Rad CFX96系统(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，美国)进行实时qPCR。反应条件如下：在94℃下2分钟，在94℃下20秒，在60℃下30秒，进行40个循环。用2-△△Ct方法计算相对mRNA或miRNA水平，分别将其标准化为GAPDH或U6(26)。所有测定均重复三次。表1列出了用于实时qPCR分析的特异性引物。
3.细胞活力测定
将细胞接种到96孔板中(4×103细胞膨胀)，并在转染48小时后孵育过夜。以指定的浓度添加新鲜制备的顺铂。处理24小时后，将20μL3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)试剂(Sigma，St.Louis，Mo)添加到细胞培养物中并温育在37℃下放置4小时。除去培养上清液，并向每个孔中加入二甲亚砜(DMSO)(100μLL孔)以溶解甲the。使用酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)在490nm下测量吸光度。一式三份进行所有测定。
4.菌落形成试验
将细胞接种到24孔板中(10×104细胞/孔)，并在转染48小时后孵育过夜。含有顺铂(5μg/μL)的RPMI1640培养基用于培养细胞24小时。然后固定菌落并用结晶紫染色。该测定已经进行了三次。
5.Caspase-3活性
使用Caspase-3分析试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)评估Caspase-3的活性。用顺铂(5μg/mL)处理24小时后裂解细胞。通过在10μL含10μL caspase-c的反应缓冲液(1％NP-40、20mmol/L Tris-HCl pH 7.5，137mmol/L NaCl和10％甘油)中孵育10μL细胞裂解物蛋白质/样品，在96孔微量滴定板上进行测定。3种底物(2mmol/L Ac-DEVD-pNA)。将裂解液在37℃下孵育4h。用酶标仪(Bio-Rad Laboratories，Inc。)以405nm的吸光度定量样品中的Caspase-3活性。然后通过计算顺铂处理的细胞与未处理的细胞的OD 405nm的比值来评估Caspase-3的活性。详细的分析过程根据制造商的协议进行。该测定已经进行了三次。
6.流式细胞仪分析
收获1×106细胞，并用添加有0.5％牛血清白蛋白的PBS(BSA，馏分V；Gibco GrandIsland，纽约州，美国)和2mM放射免疫沉淀测定法(RIPA)洗涤两次，并与稀释的CD133孵育-PE抗体溶液(#372803，BioLegend)持续15分钟。在流式细胞仪分析之前，将细胞洗涤两次，然后使用FACSCalibur流式细胞仪(BD，海德堡，德国)进行评估(28)。该测定已经进行了三次。
7.肿瘤球形成试验
将转染的细胞接种在六孔超低附着培养板(Corning Inc.，Corning，NY，USA)中(3×103细胞/孔)，并在补充有20nggml EGF，20nggml bFGF的DMEMMF12无血清培养基中培养，5μggml胰岛素，0.4％BSA，2％B-27(美国Invitrogen)，治疗6天。然后拍摄球体并计数。
8.免疫印迹
转染48小时后，在冰上温育30分钟，将LUAD细胞溶解在RIPA裂解缓冲液(Beyotime生物技术研究所)中。根据制造商的说明，使用双辛可宁酸(BCA)分析试剂盒(Pierce；ThermoFisher Scientific，Inc.)测定蛋白质浓度。用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离等量的蛋白质裂解物(每种40μg)，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF，Millipore，MA，USA)上。用含有5％脱脂奶粉的Tween 20(TBST)Tris缓冲盐溶液将膜封闭1h，然后在4℃下与以下抗体一起孵育过夜：抗β-catenin(目录号ab32572，1)：4000，Abcam)，anti-c-Myc(目录号10828-1-AP，1：1000，Proteintech)，抗细胞周期蛋白D1(目录号#2978，1：1000，Cell Signaling Technology)，抗GAPDH(目录号60004-1-Ig，1：5000，Proteintech)，抗LMNB1(目录号ab16048，1：3000，Abcam)。将二抗(目录号ab6721；1：4000；Abcam)在室温下孵育1h。用含Tween 20的PBS洗涤3次15分钟后，使用增强型化学发光(ECL)底物试剂盒(目录号ab65623；Abcam)暴露膜，并使用Image LabTMSoftware2.0(Bio-RadLaboratories，Inc.)进行评估。)。GAPDH用作内部对照。用ImageJ 1.41软件(NIH，Bethesda，MA，USA)定量分析蛋白质水平的表达。
9.萤光素酶测定
使用Dual-Glo荧光素酶测定试剂盒(Promega Corporation，麦迪逊，威斯康星州，美国)进行TCF报告基因测定(TOPPFOP)，以评估Wnttβ-catenin信号通路的活性。对于该测定，将细胞接种在24孔板中并孵育过夜。然后使用Lipofectamine 2000将细胞分别用ToppFop Flash载体(100μng)，内部对照pRL-TK Renilla荧光素酶载体(10ng)和对照模拟物或miR-140-3p模仿物(50nM)共转染。萤火虫和海藻荧光素酶活性根据制造商的说明，在转染48小时后一式三份进行测定。萤光素酶活性被标准化为海肾萤光素酶活性。
统计分析
结果显示为平均值±SD，并使用SPSS 19.0软件(SPSS Inc.，IBM，NY，USA)进行了分析。所有实验至少重复三个独立的时间。使用学生t检验评估两组之间的差异，单向ANOVA，然后进行Dunnett事后检验，以衡量三组之间的差异，并使用混合设计ANOVA来确定组内差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。
实施例1
在LUAD中，miR-140-3p的表达下调，并且与患者的生存期呈正相关。
首先，本实施例从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/？term＝)分析了正常肺组织和LUAD样品中miR-140-3p的表达。数据显示，LUAD样品中的miR-140-3p表达明显低于正常肺组织(P<0.0001；图1A所示)，该数据得到TCGA数据库分析的结果的支持(P<0.0001，图1B所示)。来自TCGA数据库的LUAD数据的生存分析表明，与miR-140-3p表达较高的患者相比，miAD-140-3p表达较低的LUAD患者的存活率明显更低(P＝0.023，图1C所示)。此外，实时qPCR分析显示，与人类正常肺上皮Beas-2B细胞相比，LUAD细胞系(A549、H292、H1299和Calu3)中miR-140-3p的表达下调，尤其是在A549和Calu3细胞(图1D所示)，因此选择它们进行后续研究。
以上结果表明，miR-140-3p在LUAD中被下调，并且与患者的生存期呈正相关。
实施例2
miR-140-3p增强了LUAD细胞对顺铂的敏感性
由于miR-140-3p低表达的患者预后较差，并且据报道miR-140-3p在许多癌症中起着抑癌作用。本实施例研究了miR-140-3p对顺铂敏感性的影响，将miR-140-3p模拟物或对照模拟物转染到A549细胞和Calu3细胞中(P<0.01，图2A所示)。集落形成试验表明，与对照模拟细胞相比，在用顺铂处理的miR-140-3p模拟细胞中存活的细胞少得多(图2B所述)。通过MTT分析评估的细胞生存能力显示，与对照模拟细胞相比，用不同浓度的顺铂处理后，miR-140-3p模拟细胞的生存能力显着降低(图2C和图2D所示)。
此外，为了评估miR-140-3p对细胞凋亡的影响，还进行了Caspase-3分析以检测顺铂处理后的Caspase-3活性。如图2E和图2F所示，在顺铂处理的条件下，miR-140-3p的高表达可促进Caspase-3活性。
以上结果表明，miR-140-3p增强了LUAD细胞对顺铂的敏感性。
实施例3
miR-140-3p减弱LUAD细胞的干细胞样特性
CSC的存在被认为是化学耐药的重要原因，本实施例研究了miR-140-3p是否参与LUAD细胞中的干细胞样特性。CD133(CSCs标记)的流式细胞仪分析表明，miR-140-3p模拟物转染后，miR-140-3p的高表达降低了CD133+细胞的百分比(P<0.01，图3A和3B所示)。肿瘤球形成分析表明，用miR-140-3p模拟物转染的细胞形成的球体比用对照模拟物转染的细胞更少和更小(图3C所示)。此外，使用实时qPCR对干细胞相关基因的分析显示，与对照模拟细胞相比，miR-140-3p模拟细胞中的SOX2，OCT4，KLF4，NANOG和ABCG2表达降低(P<0.01，图3D和图3E所示)。
以上结果表明，miR-140-3p可以减弱LUAD细胞的干细胞样特性。
实施例4
miR-140-3p减弱了LUAD细胞中Wnt/β-catenin信号通路介导的干细胞样特性和顺铂耐药性
由于Wnttβ-catenin信号传导在调节CSC自我更新中起着重要作用，并且在包括LUAD在内的许多人类癌症中均被激活。在本实施例中，首先使用qRT-PCR和Western blot检测了miR-140-3p对Wnttβ-catenin信号传导的影响。如图4A-D所示，miR-140-3p模拟转染显着抑制了β-catenin，c-myc和cyclin D1的mRNA和蛋白质表达水平。另外，TOPPFOP荧光素酶测定结果表明，与用对照模拟物转染相比，在用miR-140-3p模拟物转染的细胞中β-连环素TCF转录活性被显着抑制(P<0.01，图4E所示)。
此外，进一步研究了Wnt/β-catenin信号传导是否介导了miR-140-3p减毒的干细胞样特性和顺铂耐药性。用蛋白质表达水平和RNA水平转染过表达β-catenin的质粒(ctnnb1)后，A549和calu3细胞中β-catenin的表达显着增加(P<0.01，图5A和图5B所示)。通过共转染ctnnb1和miAD-140-3p模拟物在LUAD细胞中恢复了总的和核的β-连环蛋白(图5C所示)。，与ctnnb1共转染的LUAD细胞可显着拯救β-catenin/TCF转录活性(图5D所示)，CD133+细胞群(图5E所示)和球形成能力(图5F所示)以及细胞活力和抗顺铂处理后的凋亡能力(图6A-D所示)。
以上结果表明，miR-140-3p可以抑制Wnt/β-catenin信号传导，介导miR-140-3p减弱的LUAD干细胞样特性和顺铂耐药性。
序列表
<110> 连云港市第一人民医院
<120> miR-140-3p在制备肺腺癌治疗药物中的应用
<130> 20200709
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttgaataa agcagcattc agttgaaata accctttctg tggtaattcc aagtgaatat 60
ttttcttcta ggtgatgagt ttctacttcc tctggttttt acaacaggaa atgaaatggt 120
atctaaaata aacaagctgt ggtatgatga ttattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 180
aaaaaaaa 188
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggatgtg gtccgagtgt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaagtgag ggctcccata 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaccaatcc catccacact 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaaacttcc tgcaaagctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccacacag gtgagaaacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtgtaagg cgaggtggtc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccttcctc catggatctg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctgctgga ggctgaggta 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtggccttgg cttgtatgat 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aacaattgct gctgtgcaac 20
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacggatttg gtcgtattg 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggaagatggt gatgggatt 19
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaagcggctg ttagtcactg g 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgagtcattg catactgtcc at 22
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggctcctggc aaaaggtca 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgcgtagtt gtgctgatgt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caatgacccc gcacgatttc 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
catggagggc ggattggaa 19
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagtgctgta ccacagggta ga 22
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tatccttgtt cacgactcct tcac 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ctcgcttcgg cagcacatat act 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
acgcttcacg aatttgcgtg tc 22