一种合成ghk醋酸盐的方法
阅读说明：本技术 一种合成ghk醋酸盐的方法 (Method for synthesizing GHK acetate ) 是由 陈海佳 陈东煌 王小燕 岳坤 姜交华 罗日朗 于 2020-07-31 设计创作，主要内容包括：本发明属于多肽合成技术领域,尤其涉及一种合成GHK醋酸盐的方法。本发明合成GHK醋酸盐的方法采用常规市售保护氨基酸,容易获得,转产有保障,采用活化酯法形成酰胺键,全保护氨基酸自肽序C端逐个偶联至肽序N端,合成过程采用的反应均为温和反应,避免了诸多不利副反应；同时采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐,可避免产物三氟乙酸根的存在,保障了产品的安全性,适合工业放大生产,无需使用昂贵设备,可有效控制成本。(The invention belongs to the technical field of polypeptide synthesis, and particularly relates to a method for synthesizing GHK acetate. The method for synthesizing GHK acetate adopts conventional commercially available protected amino acid which is easy to obtain and can ensure the yield, an activated ester method is adopted to form an amido bond, the fully-protected amino acid is coupled to the N end of a peptide sequence one by one from the C end of the peptide sequence, and the reactions adopted in the synthesis process are mild reactions, so that a plurality of adverse side reactions are avoided; meanwhile, anion exchange resin treated by an acetic acid hanging column is adopted for carrying out ion exchange to obtain GHK acetate, so that the existence of trifluoroacetic acid radicals can be avoided, the safety of products is guaranteed, the method is suitable for industrial scale-up production, expensive equipment is not needed, and the cost can be effectively controlled.)
技术领域
本发明属于多肽合成技术领域，尤其涉及一种合成GHK醋酸盐的方法。
背景技术
GHK(glycyl-L-histidyl-L-lysine，蓝铜胜肽小分子肽)存在于人的血液、唾液和尿液中，由美国科学家LorenPickart等于1973年发现。GHK作用于真皮层，能促进细胞外基质如I型胶原蛋白和III型胶原蛋白、弹性蛋白及结构糖蛋白如层黏连蛋白和纤维连接蛋白的合成，促进伤口恢复和组织更新重建，加强真皮层，使皮肤变得更厚，紧致，皱纹得到舒缓，对抗紫外线照射的能力更强。因此，GHK及其铜络合物和修饰后产物被广泛用于功能性化妆品。GHK是重要的化妆品功能性活性物，也是制备铜肽的重要原料。
目前，GHK功效评价的报道甚多，都已验证功效真实性，而在其制备工艺方面，也有针对性开发，但多存在各种弊端。公开号CN103665102A专利通过采用亲脂性保护基改变中间体的亲脂性使工艺过程更好操作、产率提升，但是工艺使用非常规市售保护氨基酸，需为氨基酸上保护，路线步骤多，工艺链长，并且最终产物未进行脱三氟乙酸根处理，具有毒害性，不利于应用；公开号CN107098950A专利通过酰氯与硅烷保护的组氨酸反应得到相应的氯取代二肽，与三氟乙酸酐反应得到三氟乙酰基保护物，再与酰氯化试剂反应制成相应的酰氯产物，然后与三氟乙酰赖氨酸反应得到相应的氯取代三肽，最后氨解并脱去三氟乙酰基得到GHK或AHK，但是工艺使用非常规市售保护氨基酸，氨水氨解去保护，过程中反应条件都较剧烈，容易造成氨基酸消旋；公开号CN107778349A专利则使用Trt基团保护氨基，醋酸脱保护来降低工艺成本，但Trt基团不容易脱除干净，并且原子经济性不好，也无工业化市售原料，需定制。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种合成GHK醋酸盐的方法，用于解决现有合成方法原料需定制、存在工艺受限的问题，并且，采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐，可避免产物三氟乙酸根的存在，保障了产品的安全性。
本发明的具体方案如下：
一种合成GHK醋酸盐的方法，包括以下步骤：
a)通过碳二亚胺类缩合剂作用，将Boc-Gly与HOSU和/或HONB进行活化反应得到Boc-Gly活化酯；
b)将所述Boc-Gly活化酯与H-His(Trt)-OH和/或H-His(Boc)-OH溶于惰性溶剂在碱性条件下反应得到Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或Boc-Gly-His(Boc)-OH；
c)将所述Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或所述Boc-Gly-His(Boc)-OH在极性有机溶剂中与碳二亚胺类缩合剂和缩合辅剂反应进行活化反应，再将活化产物与溶解在碳酸盐水溶液中的H-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和/或Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Boc)-OH；
d)将所述Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和/或所述Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Boc)-OH脱保护，再通过醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐。
本发明合成GHK醋酸盐的方法采用常规市售保护氨基酸，容易获得，转产有保障，采用活化酯法形成酰胺键，全保护氨基酸自肽序C端逐个偶联至肽序N端，合成过程采用的反应均为温和反应，避免了诸多不利副反应；同时采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐，可避免产物三氟乙酸根的存在，保障了产品的安全性，适合工业放大生产，无需使用昂贵设备，可有效控制成本。
优选的，步骤a)所述碳二亚胺类缩合剂选自DCC、EDC或DIC；
步骤a)所述Boc-Gly、所述HOSU和/或HONB与所述碳二亚胺类缩合剂的摩尔比为1:(1～1.5):(1.1～2)。
优选的，步骤a)所述活化反应的温度为-10～35℃，所述活化反应的时间为4～16h。
本发明中，Boc-Gly活化酯可纯化分离，优选通过重结晶得到高纯度的Boc-Gly活化酯。
优选的，步骤b)所述惰性溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃或乙酸乙酯；
步骤b)所述碱性条件中的碱为有机季胺碱；
步骤b)所述Boc-Gly活化酯、所述H-His(Trt)-OH和/或H-His(Boc)-OH与所述碱的摩尔比为1:(0.95～1.05):(2.5～3.5)。
优选的，步骤b)所述反应的温度为-10～25℃，所述反应的时间为5～24h。
本发明中，有机季胺碱优选为DIEA和/或三乙胺。步骤b)H-His(Trt)-OH的羧基端不保护，反应时，过量的碱与羧基形成盐形式降低反应活性，避免副反应发生。步骤b)反应后，优选进行酸洗/水洗再浓缩干有机溶剂后获得高纯度的Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或Boc-Gly-His(Boc)-OH。
优选的，步骤c)所述极性有机溶剂为1,4-二氧六环和/或DMF；
步骤c)所述碳二亚胺类缩合剂选自DCC、EDC或DIC；
步骤c)所述缩合辅剂选自HOSU、HONB或HOBT；
步骤c)所述碳酸盐水溶液中的碳酸盐选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸钾。
优选的，步骤c)所述Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或所述Boc-Gly-His(Boc)-OH、所述缩合辅剂、所述碳二亚胺类缩合剂、所述碳酸盐和所述H-Lys(Boc)-OH的摩尔比为1:(1～1.5):(1～2):(2～3):(1.05～1.6)。
优选的，步骤c)所述活化反应的温度为-10～25℃，所述活化反应的时间为5h～16h；
步骤c)所述缩合反应的温度为0～25℃。
本发明中，步骤c)缩合反应后，优选浓缩除去反应溶剂，再采用乙酸乙酯重新溶解，过滤除去不溶物，然后进行酸洗/水洗，再浓缩至加入乙酸乙酯体积的1/5，加入石油醚重结晶，获得高纯度Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH。
优选的，步骤d)所述脱保护具体为采用三氟乙酸和捕捉剂组合或浓盐酸与醋酸组合进行搅拌反应脱去保护。
优选的，步骤d)所述离子交换之后，所述得到GHK醋酸盐之前，还包括：
将离子交换产物进行浓缩和析晶。
本发明中，步骤d)脱保护之后，优选采用不良溶剂(甲基叔丁基醚、***、环己烷或石油醚)析出GHK，离心分离并洗涤后，真空干燥。阴离子交换树脂优选为强碱性阴离子交换树脂，采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换，将GHK所带的反离子换成醋酸根离子，后续优选将目标馏分浓缩后加入乙醇、异丙醇或丙酮重结晶，收集晶体用纯化水重新溶解，冻干获得高纯度、高品质的GHK醋酸盐，保障产物的安全性。
本发明换盐过程采用阴离子交换树脂，不使用目前多肽合成广泛采用的制备型液相色谱，很好的保证了产物GHK醋酸盐的纯度和合成成本。
综上所述，本发明提供了一种合成GHK醋酸盐的方法，包括以下步骤：a)通过碳二亚胺类缩合剂作用，将Boc-Gly与HOSU和/或HONB进行活化反应得到Boc-Gly活化酯；b)将所述Boc-Gly活化酯与H-His(Trt)-OH和/或H-His(Boc)-OH溶于惰性溶剂在碱性条件下反应得到Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或Boc-Gly-His(Boc)-OH；c)将所述Boc-Gly-His(Trt)-OH和/或所述Boc-Gly-His(Boc)-OH在极性有机溶剂中与碳二亚胺类缩合剂和缩合辅剂反应进行活化反应，再将活化产物与溶解在碳酸盐水溶液中的H-Lys(Boc)-OH进行缩合反应，得到Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和/或Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Boc)-OH；d)将所述Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和/或所述Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Boc)-OH脱保护，再通过醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐。
本发明合成GHK醋酸盐的方法采用常规市售保护氨基酸，容易获得，转产有保障，采用活化酯法形成酰胺键，全保护氨基酸自肽序C端逐个偶联至肽序N端，合成过程采用的反应均为温和反应，避免了诸多不利副反应；同时采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐，可避免产物三氟乙酸根的存在，保障了产品的安全性，适合工业放大生产，无需使用昂贵设备，可有效控制成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的质谱图；
图2为本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的液相色谱图；
图3为本发明实施例1中得到的GHK醋酸盐的质谱图；
图4为本发明实施例1中得到的GHK醋酸盐的液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种合成GHK醋酸盐的方法，用于解决现有合成方法原料需定制、存在工艺受限的问题，并且，采用醋酸挂柱处理的阴离子交换树脂进行离子交换得到GHK醋酸盐，可避免产物三氟乙酸根的存在，保障了产品的安全性。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例进行GHK醋酸盐的合成，包括以下步骤：
1)合成Boc-Gly-OSU
称取500.00g Boc-Gly(1eq)和394.19g HOSU(1.2eq)于反应器中，加入6L四氢呋喃，开启搅拌，至物料全部溶解，缓慢加入706.69g DCC(1.2eq)，25℃下进行4h活化反应。反应结束后，将反应液过滤，除去白色不溶物，滤液真空浓缩至1L体积，加入250mL体积石油醚，58℃水浴溶解澄清，降至室温，置于4℃下析晶16h，过滤，滤饼用少量冷乙酸乙酯精洗3次，真空干燥滤饼，收695.62g产物Boc-Gly-OSU，纯度94.12％，收率84.3％。
2)合成Boc-Gly-His(Trt)-OH
准确称量999.14g H-His(Trt)-OH(1eq)置于反应器中，加入10L乙酸乙酯，搅拌，量取993.7mLDIEA(2.5eq)加入反应器中，冰水浴，搅拌30min，将步骤1)全部产物Boc-Gly-OSU(1eq)用5L四氢呋喃溶解，缓慢加入反应器中，1h后撤去冰水浴，25℃下搅拌反应5h。反应结束后，将反应液过滤，收集滤液用3％柠檬酸水溶液洗涤滤液(3次，每次等体积柠檬酸水溶液)，等体积饱和食盐水洗涤3次，400g无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩至干，收集白色或黄白色固体，真空干燥至恒重，收得产物1347.40g Boc-Gly-His(Trt)-OH，纯度92.69％，收率90.7％。
3)合成Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH
将步骤2)收得的Boc-Gly-His(Trt)-OH(1eq)和336.89gHOSU(1.2eq)投入反应器中，加入10L 1,4二氧六环和5L四氢呋喃混合溶剂，搅拌溶解，称取603.97gDCC(1.2eq)，加入反应器中，冰水浴1h，恢复至25℃下进行6h活化反应，过滤，得到Boc-Gly-His(Trt)-OSU活化液，活化液待用；
另取一个反应器，称取477.32g碳酸钠(2eq)投入反应器，加入10L纯化水，搅拌至完全溶解，称831.89g H-Lys(Boc)-OH(1.5eq)，缓慢加入直至完全溶解，冰水浴30min后，将Boc-Gly-His(Trt)-OSU活化液缓慢滴加至溶解H-Lys(Boc)-OH的反应器中，进行1h缩合反应后撤去冰水浴，25℃下继续缩合反应10h。反应结束后，将反应液过滤，滤液浓缩除去部分有机溶剂，剩余16L，加入32L纯化水，柠檬酸调节pH至3.8，乙酸乙酯萃取(30L*3次)，合并萃取液，饱和食盐水洗涤，减压浓缩至体积3L，加入1.5L石油醚，60℃水浴溶解，降至室温，置于4℃下重结晶16h，过滤，滤饼用少量石油醚与乙酸乙酯1:1混合溶剂洗涤，真空干燥滤饼，收得1375.23g产物Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，纯度97.94％，收率76.1％。
4)Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH脱保护
称取1000g Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH，加入10L脱保护液(脱保护液组分三氟乙酸:二氯甲烷:1,2-乙二硫醇:H2O＝50:40:5:5)，冰水浴30min后，25℃下搅拌反应2h，反应完毕，反应液浓缩至原体积4L，边搅拌边倒入32L冷冻***中，自然沉降10min，倾倒上清，余下悬浊液用离心分离，收集底部白色固体，用冷***洗涤3次，所得固体真空干燥至恒重，收集产物866.25g，纯度98.22％，收率97.7％。
5)离子交换转盐
样品预处理：860g步骤4)产物用8.6L纯化水溶解，0.45μm滤膜过滤，待用。
树脂预处理：取500g阴离子交换树脂，用3％氯化钠水溶液洗涤数次至上清液澄清，两倍体积4％浓盐酸浸泡4h，纯化水洗涤数次至洗出液pH中性，两倍体积5％氢氧化钠浸泡过夜，纯化洗涤数次至流出液呈中性。将处理后阴离子交换树脂倾倒入离子柱中，纯化水洗涤数次管路后，将蠕动泵调节流速15ml/min。
CH3COO-挂柱：当柱中液面恰好在阴离子交换树脂层面上时，轻缓倒入1.6M醋酸水溶液(两倍体积*3)，每次倒入时，液面都恰好在阴离子交换树脂层上，切勿滴穿阴离子交换树脂层。最后一次醋酸水溶液液面恰好在阴离子交换树脂层上时，加入纯化水洗涤阴离子交换树脂层(两倍体积*3)，洗去未挂载的醋酸。
样品处理：纯化水洗涤时，液面恰好在阴离子交换树脂层面上时，缓慢倒入样品溶液，样品溶液液面在阴离子交换树脂层面上时加入纯化水，切勿让液面低于阴离子交换树脂层，检测器出口接样，紫外检测器读数变化快速上升，此为目标馏分，收集馏分9.4L。
目标馏分浓缩与析晶：将上步目标馏分浓缩至4L，缓慢滴入8倍量乙醇，4℃析晶，过滤收集析出固体，少量冷乙醇洗涤3次，真空干燥，收得793.63g产品GHK醋酸盐，纯度99.72％。
请参阅图1～4及表1～2，图1为本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的质谱图，图2为本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的液相色谱图，图3为本发明实施例1中得到的GHK醋酸盐的质谱图，图4为本发明实施例1中得到的GHK醋酸盐的液相色谱图，表1和表2分别为本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和GHK醋酸盐的液相色谱数据。图2中峰7为Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的出峰，图4中峰1为GHK醋酸盐的出峰。结果表明，本发明实施例得到了Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和GHK醋酸盐，并且，Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH和GHK醋酸盐的纯度高。
表1本发明实施例1中得到的Boc-Gly-His(Trt)-Lys(Boc)-OH的液相色谱数据
表2本发明实施例1中得到的GHK醋酸盐的液相色谱数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。