阅读说明：本技术 含有不可消化寡糖的发酵配方物 (Fermentation formulations containing indigestible oligosaccharides ) 是由 S·蒂姆森 A·R·奥泽尔 J·科诺尔 于 2019-02-11 设计创作，主要内容包括：向婴儿给予包含不可消化寡糖、还优选部分发酵的婴儿配方物,使得肠道代谢组学谱和微生物群功能与喂食常规婴儿配方物的婴儿相比更类似于母乳喂养的婴儿。(Administering to the infant an infant formula comprising non-digestible oligosaccharides, preferably also partially fermented, results in an intestinal metabolomics profile and microbiota function that is more similar to breast-fed infants compared to infants fed conventional infant formulas.)

含有不可消化寡糖的发酵配方物

技术领域

本发明涉及用于改善肠道微生物群的婴幼儿营养领域。

背景技术

普遍认为新生婴儿的最佳营养是人乳。当母亲无法母乳喂养其婴儿或选择不进行母乳喂养时，基于成熟人乳组成开发的婴儿配方物(IF)被认为是最佳的替代物。提高婴儿配方物的质量的研究不一定是为了模拟人乳的精确组成，而是为了实现超出在母乳喂养的婴儿中仅观察到营养方面的功能效果。

人类肠道具有复杂的微生物生态系统，即肠道微生物群，它被认为是人类生理学的重要部分。在成年人中，肠道微生物群被认为是稳定的生态系统，因此，生命早期的微生物定植过程——其与胃肠道本身的成熟密切相关——可以被认为是健康发育的基本步骤。可以在生命早期存在的几个环境因素已被证明对肠道微生物群及其活性具有长期的影响，从而增加了以后生活中患病的风险。生命早期的营养是影响肠道微生物群落发育的主要因素。双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌种通常在母乳喂养婴儿的肠道微生物群中占主导地位，而在常规配方物喂养的婴儿中通常观察到富含厚壁菌门(Firmicutes)成员的肠道微生物群。然而，相关的不仅仅是肠道微生物群的组成。此外，微生物群的功能和/或代谢物的存在将在很大程度上影响肠道生理和生物，并对现在和以后生活的健康产生影响。在这些方面观察到了母乳喂养的婴儿和常规配方物喂养的婴儿之间的差异，这可以解释为什么母乳喂养的婴儿在关于肠道、免疫系统、大脑和代谢健康的许多方面具有改善的健康结果。

补充有益生元scGOS/lcFOS混合物的配方物已被证明可以调节肠道微生物群的组成和功能，即将代谢活性和发酵特性提高到人乳喂养婴儿中发现的水平(Knol等人，2005，JPGN 40：36-42)。先前已表明，当将这种scGOS/lcFOS混合物添加到使用短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)进行部分发酵的婴儿乳配方物时，其对代谢活性和发酵特性的影响可以在很大程度上得以保持(Huet，F.等人，2016，JPGN 63：e43-53)。

上述现有技术文件公开了调节特定代谢参数的干预措施，对其进行了靶向分析，例如特定的短链脂肪酸的数量和相对贡献，和pH值，但没有关注整个代谢组。

WO 2017/021476涉及一种包含岩藻糖基化和N-乙酰化寡糖的营养组合物，与常规营养组合物喂养的婴儿相比，所述营养物用于促进或诱导总体肠道微生物群使得其功能更接近于纯母乳喂养的婴儿。

然而，需要一种营养组合物，其用于进一步改善婴儿或幼儿的整个肠道微生物群，甚至更类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群。

本发明人应用代谢组学，一种组学工具，在该工具中，同时测量了数百种代谢物(通常是小分子，通常＜1,000-1,500Da)，以研究婴儿肠道微生物群的功能图，以及喂食含有不可消化寡糖的实验配方物、含有不可消化寡糖的部分发酵的实验配方物或对照配方物的效果。代谢物表现出更最终的表型，这是生态系统中所有基因编码功能的结果，因为它们代表了所有激活基因、表观遗传表达修饰和其他转录调控、翻译后蛋白质修饰以及环境因素(生物和非生物)的最终总和。本发明人发现，与微生物群组成的数据相比，代谢组学数据显示几乎在每个时间点，研究组之间的极端差异越来越大(每次比较180-404种代谢物)。在基线时，实验组和对照组仍然相对接近，但随着时间的推移，模式发生了变化，其中实验组与在母乳喂养的婴儿中观察到的模式接近，而对照组和母乳喂养的参考组之间的差异变得更加明显。这组非靶向数据集表明，婴儿肠道生态系统的功能高度依赖于饮食并对饮食具有反应性。明显不同的代谢物来源于许多功能类别。一个实例是次级胆汁盐的不同特性，其中实验组的模式与母乳喂养参考组的模式更相似或偏离较少。

在这项研究中，粪便样品的特征反映出，与对照组相比，喂食含有不可消化寡糖的实验配方物的婴儿具有更类似于母乳喂养的肠道生理条件。在接受另外进行部分发酵的配方物的组中，其效果甚至更为明显。

具体实施方案

因此，本发明涉及一种促进在36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群发育的方法，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者肠道微生物群的功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能，该方法包括给予包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物。

在一个实施方案中，本发明的方法可视为一种促进肠道微生物群功能发育的非医疗方法。

本发明还可表述为不可消化寡糖在制备用于促进36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群的发育的营养组合物的用途，所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能。

本发明还可表述为一种包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，其用于促进36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群的发育，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能。

优选地，在本发明的方法或用途中，营养组合物至少由产乳酸细菌部分发酵，且包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐。此外，优选地在本发明的方法或用途中，促进肠道微生物群功能的发育为与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐的营养组合物的同龄人类受试者肠道微生物群的功能相比。

因此，本发明还涉及一种促进36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群发育的方法，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能，该方法包括给予至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖。

本发明还可表述为发酵成分和不可消化寡糖在制备用于促进36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群的发育的至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物的用途，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖。

本发明还可表述为一种至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，其用于促进36月龄以下的人类受试者中肠道微生物群的发育，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群功能相比，该肠道微生物群的功能更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群功能。

发酵成分

在本发明的方法或用途中的营养组合物(下文还称为本营养组合物，或本发明的营养组合物或最终的营养组合物)优选至少部分发酵。部分发酵的营养组合物包含至少由产乳酸细菌部分发酵的组合物。已表明，在给药后，在最终营养组合物中存在的发酵成分使得肠道微生物群的功能更类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群的功能。

优选在营养组合物的制备过程中进行发酵。优选地，由于发酵后的热灭活或通过其他方式灭活，营养组合物在最终产品中不包含显著量的活细菌。优选地，发酵成分是乳衍生产品，其为由产乳酸细菌发酵的乳底物，其中所述乳底物包含至少一种选自以下的物质：乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物或其混合物。合适地，包含发酵成分和不可消化寡糖的营养组合物及其制备方法记载于WO 2009/151330、WO 2009/151331和WO 2013/187764中。

发酵成分优选包含细菌细胞碎片，如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸(LTA)、脂蛋白、核苷酸和/或荚膜多糖。有利的是将包含灭活细菌和/或细胞碎片的发酵成分直接用作最终营养产品的一部分，因为这将产生更高浓度的细菌细胞碎片。当使用产乳酸细菌的商业制剂时，通常洗涤这些制剂，并将材料与包含细菌细胞碎片的水性生长培养基分离，从而减少或消除细菌细胞碎片的存在。此外，在产乳酸细菌与乳底物的发酵和/或其他相互作用时，可以形成另外的生物活性化合物，例如短链脂肪酸、生物活性肽和/或寡糖和其他代谢物，这也会导致肠道微生物群功能更类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群功能。由产乳酸细菌或其他食品级细菌在发酵过程中产生的这种生物活性化合物还可称为后生物素(post-biotic)。包含这种后生物素的组合物被认为有利地更接近于母乳，因为母乳不是纯净的合成配方物，而是含有代谢物、细菌细胞、细胞碎片等。因此，与不含或仅含产乳酸细菌的未发酵的乳衍生产品相比，认为发酵成分、特别是发酵的乳衍生产品对肠道微生物群功能具有改善的效果。

优选地，最终营养组合物包含基于干重计5至97.5重量％、更优选10至90重量％、更优选20至80重量％、甚至更优选25至60重量％的发酵成分。作为表示最终营养组合物包含至少部分发酵的组合物和表示发酵程度的方式，可以采用最终营养组合物中乳酸和乳酸盐的总水平，因为这是产乳酸细菌在发酵时产生的代谢终产物。本发明的最终营养组合物包含基于组合物的干重计总共0.02至1.5重量％、更优选0.05至1.0重量％、甚至更优选0.1至0.5重量％的乳酸和乳酸盐。优选地，总共至少50重量％、甚至更优选至少90重量％的乳酸和乳酸盐为L(+)-异构体的形式。因此，在一个实施方案中，L(+)-乳酸和L(+)-乳酸盐的总和大于50重量％、更优选大于90重量％，基于乳酸和乳酸盐的总和计。在本文中，L(+)-乳酸盐和L(+)-乳酸也称为L-乳酸盐和L-乳酸。

用于制备发酵成分的产乳酸细菌

用于制备发酵成分、特别是发酵乳底物的产乳酸细菌优选以单一培养物或混合培养物的形式提供。产乳酸细菌由以下属组成：双歧杆菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weissella)。优选地，用于发酵的产乳酸细菌包括双歧杆菌属和/或链球菌属的细菌。

优选地，链球菌是嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株。所选择的合适的嗜热链球菌菌株记载于EP 778885的实施例2和FR 2723960的实施例1中。在本发明的另一个优选的实施方案中，营养组合物包含10²-10⁵cfu嗜热链球菌活细菌/g最终营养组合物的干重，优选最终营养组合物包含10³-10⁴嗜热链球菌活细菌/g干重。

就本发明的目的而言，用于制备发酵成分的优选的嗜热链球菌菌株已被Compagnie Gervais Danone保藏在由Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，Paris，France运营的Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)处，于1995年8月23日保藏的登记号为I-1620且于1994年8月25日保藏的登记号为I-1470。其他的嗜热链球菌菌株是可以商购的。

由于嗜热链球菌不能在胃中存活，因此不认为它是益生菌。

双歧杆菌为革兰氏阳性厌氧杆状细菌。就本发明的目的而言，当与相应的双歧杆菌菌种的模式菌株相比时，用于制备发酵成分的优选双歧杆菌菌种优选地具有至少95％的16S rRNA序列的同一性，更优选至少97％的同一性，如在关于该主题的手册例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor(N.Y.)Laboratory Press中所定义。优选使用的双歧杆菌还由Scardovi，V.记载于Genus Bifidobacterium.第1418-1434页.记载于：Bergey’s manualof systematic Bacteriology.第2卷.Sneath，P.H.A.，N.S.Mair，M.E.Sharpe和J.G.Holt(编辑).Baltimore：Williams&Wilkins.1986.第635页中。优选地，用于发酵的产乳酸细菌包括或者为至少一种选自以下的双歧杆菌：短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、嗜热双歧杆菌、没食子双歧杆菌(B.gallicum)、动物双歧杆菌(B.animalis)或乳双歧杆菌(B.lactis)、角双歧杆菌(B.angulatum)、假小链双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、嗜酸嗜热双歧杆菌(B.thermacidophilum)和长双歧杆菌(B.longum)，更优选短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、链状双歧杆菌、长双歧杆菌，更优选长双歧杆菌和短双歧杆菌，甚至更优选短双歧杆菌，更优选选自以下的短双歧杆菌：短双歧杆菌Bb-03(Rhodia/Danisco)、短双歧杆菌M-16V(Morinaga)、短双歧杆菌R0070(Institute Rosell，Lallemand)、短双歧杆菌BR03(Probiotical)、短双歧杆菌BR92(CellBiotech)DSM 20091、LMG 11613和保藏在法国巴黎CNCM的短双歧杆菌I-2219。最优选地，短双歧杆菌为短双歧杆菌M-16V(Morinaga)或短双歧杆菌I-2219，甚至更优选短双歧杆菌I-2219。

最优选地，本发明的营养组合物包含由产乳酸细菌发酵的发酵成分，所述产乳酸细菌包括短双歧杆菌和嗜热链球菌两者。在一个实施方案中，产乳酸细菌发酵是通过嗜热链球菌和短双歧杆菌进行发酵的。在一个实施方案中，最终营养组合物包含发酵成分，其中产乳酸细菌在发酵后被灭活。

优选地，发酵成分不通过保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)进行发酵。保加利亚乳杆菌发酵的产品被认为不适合婴儿，因为在幼小婴儿中，将D-乳酸盐转化为丙酮酸盐的特异性脱氢酶的活性远低于转化L-乳酸盐的脱氢酶。

优选地，本发明的营养组合物包含灭活的产乳酸细菌和/或源自产乳酸细菌的细菌碎片，其获自基于每g最终组合物的干重计大于1x 10⁴cfu的产乳酸细菌，更优选1x10⁵cfu，甚至更优选1x 10⁶cfu。优选地，灭活细菌或细菌碎片获自基于每g最终组合物的干重计小于1×10¹²cfu的产乳酸细菌，更优选1x 10¹⁰cfu，甚至更优选1x 10⁹cfu。灭活乳酸菌和cfu的相关性可以通过本领域已知的分子技术或检查生产过程来确定。

发酵方法

优选地，发酵成分是乳衍生产品，其为由产乳酸细菌发酵的乳底物，并且所述乳底物包含至少一种选自以下的组分：乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物或其混合物。待发酵的乳衍生产品或乳底物适合存在于水性培养基中。待发酵的乳底物包含至少一种选自以下的组分：乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解物、酪蛋白、酪蛋白水解物或其混合物。乳可为全脂乳、半脱脂乳和/或脱脂乳。优选地，待发酵的乳底物包含脱脂乳。乳清可为甜乳清和/或酸乳清。优选地，乳清以3至80g干重/l含有乳底物的水性培养基的浓度存在，更优选40至60g/l。优选地，乳清蛋白水解物以2至80g干重/l含有乳底物的水性培养基存在，更优选5至15g/l。优选地，乳糖以5至50g干重/l水性底物存在，更优选1至30g/l。优选地，含有乳底物的水性培养基包含缓冲盐，以将pH保持在所需范围内。优选使用磷酸二氢钠或磷酸二氢钾作为缓冲盐，优选以0.5至5g/l、更优选1.5至3g/l使用。优选地，含有乳底物的水性培养基包含半胱氨酸，其量为0.1至0.5g/l水性底物，更优选0.2至0.4g/l。半胱氨酸的存在导致底物具有低的氧化还原电位，这有利于产乳酸细菌、特别是双歧杆菌的活性。优选地，含有乳底物的水性培养基包含酵母提取物，其量为0.5至5g/l含有乳底物的水性培养基，更优选1.5至3g/l。酵母提取物是产乳酸细菌的酶辅因子和生长因子的丰富来源。酵母提取物的存在将增强产乳酸细菌的发酵。

合适地，在发酵步骤之前，对乳底物、特别是含有乳底物的水性培养基进行巴氏灭菌，以消除不需要的活细菌的存在。合适地，在发酵后对产物进行巴氏灭菌，以使酶失活。合适地，酶失活在75℃下进行3分钟。合适地，含有乳底物的水性培养基在发酵前进行均质化和/或乳衍生产品在发酵后进行均质化。均质化使得底物和/或发酵产物更稳定，尤其是在脂肪的存在下。

接种密度优选为1x 10²至5x 10¹⁰、优选1x 10⁴至5x 10⁹cfu产乳酸细菌/ml含有乳底物的水性培养基，更优选为1x 10⁷至1x 10⁹cfu产乳酸细菌/ml含有乳底物的水性培养基。发酵后的最终细菌密度优选为1x 10³至1x 10¹⁰、更优选1x 10⁴至1x 10⁹cfu/ml含有乳底物的水性培养基。

发酵优选在约20℃至50℃、更优选30℃至45℃、甚至更优选约37℃至42℃的温度下进行。产乳酸细菌、更特别是乳酸杆菌(Lactobacilli)和/或双歧杆菌的生长和/或活性的最佳温度为37℃至42℃。

温育优选在4至8、更优选6至7.5的pH下进行。所述pH不会引起蛋白质沉淀和/或不好的味道，同时产乳酸细菌如乳酸杆菌和/或双歧杆菌能够使乳底物发酵。

温育时间优选为10分钟至48小时，优选2小时至24小时，更优选4小时至12小时。足够长的时间使得能够在足够或很大程度上进行发酵并同时产生免疫原性细胞碎片如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸(LTA)、鞭毛、脂蛋白、DNA和/或荚膜多糖和代谢物(后生物素)，然而出于经济原因，温育时间不必太长。

优选地，将乳衍生产品或乳底物、优选脱脂乳进行巴氏灭菌，冷却，并利用一种或多种产乳酸菌株、优选嗜热链球菌菌株发酵至一定程度的酸度，在所述酸度下冷却发酵产物并储存。优选地，以类似方式使用一种或多种用于发酵的双歧杆菌菌种制备第二乳衍生产品。随后，优选将两种发酵产物混合在一起并与构成婴儿配方物的除脂肪组分之外的其他组分混合。优选地，将混合物预热，然后在生产线上(in-line)加入脂肪，均质化，巴氏灭菌并干燥。或者在发酵罐中同时有双歧杆菌、优选短双歧杆菌和嗜热链球菌进行发酵。

制备适用于本发明目的的发酵成分的方法本身是已知的。EP 778885——通过引用的方式纳入本文——在实施例7中具体公开了一种制备发酵成分的合适方法。FR2723960——通过引用的方式纳入本文——在实施例6中具体公开了一种制备发酵成分的合适方法。简而言之，将包含乳糖和任选的其他常量营养素(如脂肪(优选植物脂肪)、酪蛋白、乳清蛋白、维生素和/或矿物质等)的乳底物、优选巴氏灭菌的乳底物浓缩至例如15至50％的干物质，然后用嗜热链球菌接种，例如用含有10⁶至10¹⁰个细菌/ml的5％培养物接种。优选地，所述乳底物包含乳蛋白肽。发酵的温度和持续时间如上所述。合适地，在发酵之后，可对发酵成分进行巴氏灭菌或杀菌，并且例如进行喷雾干燥或冻干，以提供一种适于在最终产品中进行配制的形式。

制备用于本发明的营养组合物的发酵成分的优选方法公开于WO 01/01785中，更具体地公开于实施例1和2中。制备用于本发明的营养组合物的发酵成分的优选方法记载于WO 2004/093899中，更具体地记载于实施例1中。

在发酵成分中产乳酸细菌的活细胞在发酵后优选通过例如灭活和/或物理去除而被除去。优选使细胞灭活。优选地，在乳底物发酵之后将产乳酸细菌热灭活。优选的热灭活方法是(闪蒸)巴氏灭菌、杀菌、超高温处理、高温/短时热处理和/或在细菌不能存活的温度下喷雾干燥。细胞碎片优选通过热处理获得。通过所述热处理，优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少99％的活的微生物被灭活。优选地，发酵的营养组合物包含小于1x10⁵菌落形成单位(cfu)的活乳酸菌/g干重。热处理优选在70至180℃、优选80至150℃的温度下进行优选约3分钟至2小时，优选在80至140℃的温度下进行5分钟至40分钟。乳酸菌的灭活有利地导致较少的后酸化和更安全的产品。当将营养组合物给予婴儿或幼儿时，这是特别有利的。合适地，在发酵之后，可对发酵成分进行巴氏灭菌或杀菌，并且例如进行喷雾干燥或冻干，以提供一种适于在最终产品中进行配制的形式。

不可消化寡糖

本发明的营养组合物包含不可消化寡糖，并且优选包含至少两种不同的不可消化寡糖，特别是两种不同来源的不可消化寡糖。已显示，不可消化寡糖的存在改善了肠道微生物群的功能，使其更类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群的功能。因此，同时存在不可消化寡糖和发酵成分，特别是通过产乳酸细菌发酵获得的乳衍生产品协同且有利地导致肠道微生物群的功能更类似于主要或完全母乳喂养的婴儿的肠道微生物群的功能。

本文所用的术语“寡糖”是指聚合度(DP)为2至250、优选DP为2至100、更优选2至60、甚至更优选2至10的糖类。如果本发明的营养组合物包含DP为2至100的寡糖，则这导致可含有DP为2至5、DP为50至70和DP为7至60的寡糖的组合物。本发明中使用的术语“不可消化寡糖”是指不通过存在于人上消化道(如小肠和胃)中的酸或消化酶的作用而在肠道中被消化，但优选通过人肠道微生物群进行发酵的寡糖。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糖糊精被认为是可消化的。

优选地，本发明的不可消化寡糖是可溶的。当提及多糖、纤维或寡糖时，本文所用的术语“可溶的”意指根据L.Prosky et al.，J.Assoc.Off.Anal.Chem.71，1017-1023(1988)记载的方法，所述物质至少是可溶的。

在本发明的方法或用途中，本发明的营养组合物中包含的不可消化寡糖优选包括不可消化寡糖的混合物。不可消化寡糖优选选自低聚果糖，例如菊粉；不可消化糊精；低聚半乳糖，例如反式低聚半乳糖；低聚木糖、***寡糖(arabino-oligosaccharide)、***低聚半乳糖(arabinogalacto-oligosaccharide)、低聚葡萄糖(gluco-oligosaccharide)、低聚龙胆糖(gentio-oligosaccharide)、葡甘露寡糖(glucomanno-oligosaccharide)、半乳甘露寡糖(galactomannooligosaccharide)、甘露寡糖、低聚异麦芽糖、黑曲霉寡糖(nigero-oligosaccharide)、葡甘露寡糖(glucomanno-oligosaccharide)、壳寡糖(chito-oligosaccharide)、大豆低聚糖(soy oligosaccharide)、糖醛酸寡糖(uronicacidoligosaccharide)及其混合物。这种低聚糖具有许多生化特性，并且具有相似的功能益处，包括改善肠道微生物群功能。还应理解，一些不可消化寡糖和优选一些混合物具有更进一步的改善效果。因此不可消化寡糖更优选选自低聚果糖，如菊粉；低聚半乳糖，如β低聚半乳糖及其混合物，甚至更优选β低聚半乳糖和/或菊粉，最优选β低聚半乳糖。在本发明的营养组合物的一个实施方案中，不可消化寡糖选自低聚半乳糖、低聚果糖及其混合物，更优选β低聚半乳糖、低聚果糖及其混合物。

不可消化寡糖优选选自β-低聚半乳糖、α-低聚半乳糖和半乳聚糖(galactan)。根据更优选的实施方案，不可消化寡糖为β-低聚半乳糖。优选地，不可消化寡糖包括具有β(1，4)、β(1，3)和/或β(1，6)糖苷键和末端葡萄糖的低聚半乳糖。反式低聚半乳糖例如可以商品名

GOS(Domo FrieslandCampina Ingredients)、Bi2muno(Clasado)、Cup-oligo(Nissin Sugar)和Oligomate55(Yakult)获得。这些寡糖在更大程度上改善肠道微生物群功能。

不可消化寡糖优选包括低聚果糖。在其他情况下，低聚果糖可以具有例如果聚糖(fructopolysaccharide)、低聚果糖(oligofructose)、多聚果糖(polyfructose)、聚果聚糖(polyfructan)、菊粉、果聚糖(levan)和果聚糖(fructan)的名称，并且可指包含β-连接的果糖单元的寡糖，其优选通过β(2，1)和/或β(2，6)糖苷键连接且优选的DP为2至200。优选地，低聚果糖含有末端β(2，1)糖苷键连接的葡萄糖。优选地，低聚果糖含有至少7个β-连接的果糖单元。在另一个优选的实施方案中，使用菊粉。菊粉是一种低聚果糖，其中至少75％的糖苷键为β(2，1)键。通常，菊粉的平均链长为8至60个单糖单元。适用于本发明的组合物的低聚果糖可以商品名

HP(Orafti)商购获得。其他合适的来源为Raftilose(Orafti)、Fibrulose和Fibruline(Cosucra)以及Frutafit和Frutalose(Sensus)。

优选地，本发明的营养组合物包含低聚半乳糖和低聚果糖的混合物。优选地，低聚半乳糖和低聚果糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、更优选1/1至19/1、更优选2/1至15/1、更优选为5/1至12/1、甚至更优选8/1至10/1、甚至更优选约9/1的重量比存在。当低聚半乳糖具有低的平均DP并且低聚果糖具有相对高的DP时，该重量比是特别有利的。最优选的是平均DP低于10、优选低于6的低聚半乳糖和平均DP高于7、优选高于11、甚至更优选高于20的低聚果糖的混合物。这种混合物协同改善了婴儿肠道微生物群的功能，以使其更类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群功能。

优选地，本发明的营养组合物包含短链低聚果糖和长链低聚果糖的混合物。优选地，短链低聚果糖和长链低聚果糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、甚至更优选1/10至19/1、更优选1/5至15/1、更优选1/1至10/1的重量比存在。优选的是平均DP低于10、优选低于6的短链低聚果糖和平均DP高于7、优选高于11、甚至更优选高于20的低聚果糖的混合物。

优选地，本发明的营养组合物包含短链低聚果糖和短链低聚半乳糖的混合物。优选地，短链低聚果糖和短链低聚半乳糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、甚至更优选1/10至19/1、更优选1/5至15/1、更优选1/1至10/1的重量比存在。优选的是平均DP低于10、优选低于6的短链低聚果糖和低聚半乳糖的混合物。

本发明的营养组合物包含总共2.5至20重量％、更优选2.5至15重量％、甚至更优选3.0至10重量％、最优选5.0至7.5重量％的不可消化寡糖，基于营养组合物的干重计。基于100ml计，本发明的营养组合物优选包含总共0.35至2.5重量％、更优选0.35至2.0重量％、甚至更优选0.4至1.5重量％的不可消化寡糖，基于100ml营养组合物计。较低量的不可消化寡糖在改善肠道微生物群功能方面效果较差，而过高的量则会导致腹胀和腹部不适的副作用。

营养组合物

根据本发明使用的营养组合物还可被认为是药物组合物，优选适合于向婴儿给药。本发明的营养组合物优选肠内给药，更优选口服给药。

优选地，根据本发明使用的营养组合物不是益生菌组合物或包含益生菌的组合物。产乳酸细菌优选在生产过程中不复制或灭活，和/或在人体上胃肠道的条件下不存活。

本发明的营养组合物优选为婴儿配方物、第二阶段配方物(follow on formula)、幼儿乳或幼儿配方物或用于幼儿的成长乳(growing up milk)。本发明的营养组合物可有利地用作婴儿的完全营养物。优选地，本发明的营养组合物为婴儿配方物。婴儿配方物定义为用于婴儿的配方物，并且例如可为用于0至6或0至4月龄婴儿的起始配方物。第二阶段配方物用于4或6月龄至12月龄的婴儿。在这个月龄，婴儿开始断奶吃其他食物。幼儿或成长乳或配方物用于12至36月龄的儿童。本发明的组合物优选包含脂质组分、蛋白质组分和碳水化合物组分，并且优选以液体形式给予。本发明的营养组合物还可为干食品的形式，优选为粉末形式，其附有将所述干食品(优选粉末)与合适的液体(优选水)进行混合的说明书。根据本发明使用的营养组合物优选包含其他成分，例如维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素，以使其成为完全营养组合物。根据国际指令，优选婴儿配方物包含维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素。

本发明的营养组合物优选包含脂质、蛋白质和可消化碳水化合物，其中脂质提供总卡路里的5至50％，蛋白质提供总卡路里的5至50％，并且可消化碳水化合物提供总卡路里的15至90％。优选地，在本发明的营养组合物中，脂质提供总卡路里的35至50％，蛋白质提供总卡路里的7.5至12.5％，并且可消化碳水化合物提供总卡路里的40至55％。为了计算蛋白质占总卡路里的百分比，需要考虑由蛋白质、肽和氨基酸提供的总能量。优选地，提供3至7g脂质/100kcal营养组合物，优选4至6g/100kcal营养组合物；提供1.6至4g蛋白质/100kcal营养组合物，优选1.7至2.5g/100kcal营养组合物，并且提供5至20g可消化碳水化合物/100kcal营养组合物，优选8至15g/100kcal营养组合物。优选地，本发明的营养组合物包含4至6g脂质/100kcal，1.6至2.0g蛋白质/100kcal、更优选1.7至1.9g蛋白质/100kcal，和8至15g可消化碳水化合物/100kcal营养组合物。在一个实施方案中，每100kcal营养组合物提供3至7g脂质，优选每100kcal营养组合物提供4至6g脂质；每100kcal营养组合物提供1.6至2.1g蛋白质，优选每100kcal营养组合物提供1.6至2.0g蛋白质；并且每100kcal营养组合物提供5至20g可消化碳水化合物，优选每100kcal营养组合物提供8至15g可消化碳水化合物，并且其中优选地可消化碳水化合物组分包含至少60重量％的乳糖，基于总的可消化碳水化合物计，更优选至少75重量％、甚至更优选至少90重量％的乳糖，基于总的可消化碳水化合物计。卡路里的总量由来自蛋白质、脂质、可消化碳水化合物和不可消化寡糖的卡路里的总和确定。

本发明的营养组合物优选包含可消化碳水化合物组分。优选的可消化碳水化合物组分为乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉和麦芽糖糊精。乳糖是人乳中存在的主要的可消化碳水化合物。本发明的营养组合物优选包含乳糖。由于本发明的营养组合物包含通过产乳酸细菌发酵获得的发酵成分，因此乳糖的量相对于其来源因发酵而减少，通过发酵乳糖转化为乳酸盐和/或乳酸。因此，在本发明的营养组合物的制备中，优选加入乳糖。优选地，本发明的营养组合物不包含除乳糖之外的大量碳水化合物。与可消化碳水化合物如麦芽糖糊精、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和具有高血糖指数的其他可消化碳水化合物相比，乳糖具有较低的血糖指数，因此是优选的。本发明的营养组合物优选包含可消化碳水化合物，其中至少35重量％、更优选至少50重量％、更优选至少60重量％、更优选至少75重量％、甚至更优选至少90重量％、最优选至少95重量％的可消化碳水化合物为乳糖。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含至少25重量％的乳糖，优选至少40重量％、更优选至少50重量％的乳糖。

本发明的营养组合物优选包含至少一种选自动物脂质(不包括人脂质)和植物脂质的脂质。优选地，本发明的组合物包含植物脂质和至少一种油的组合，所述油选自鱼油、动物油、藻油、真菌油(fungal oil)和细菌油(bacterial oil)。本发明的营养组合物优选提供3至7g脂质/100kcal营养组合物，优选提供4至6g脂质/100kcal营养组合物。当呈液体形式例如作为即食液体时，营养组合物优选包含2.1至6.5g脂质/100ml，更优选3.0至4.0g/100ml。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含12.5至40重量％、更优选19至30重量％的脂质。优选地，脂质包含必需脂肪酸α-亚麻酸(ALA)、亚油酸(LA)和/或长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)。LC-PUFA、LA和/或ALA可作为游离脂肪酸，以甘油三酯形式、甘油二酯形式、单甘油酯形式、磷脂形式或作为上述的一种或多种的混合物提供。优选地，本发明的营养组合物包含至少一种、优选至少两种选自以下的脂质来源：菜籽油(例如菜油(colza oil)、低芥酸菜籽油和芥花油)、高油酸葵花籽油，高油酸红花油、橄榄油、海产油(marine oil)、微生物油、椰子油、棕榈仁油。本发明的营养组合物不是人乳。

本发明的营养组合物优选包含蛋白质。营养组合物中使用的蛋白质优选选自非人动物蛋白质，优选乳蛋白；植物蛋白，例如优选大豆蛋白和/或大米蛋白；及其混合物。本发明的营养组合物优选含有酪蛋白和/或乳清蛋白，更优选牛乳清蛋白和/或牛酪蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明的营养组合物中的蛋白质包含选自乳清蛋白和酪蛋白的蛋白质，优选乳清蛋白和酪蛋白，优选地乳清蛋白和/或酪蛋白来自牛乳。优选地，蛋白质包含小于5重量％的游离氨基酸、二肽、三肽或水解蛋白质，基于总蛋白质计。本发明的营养组合物优选包含酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白∶乳清蛋白的重量比为10∶90至90∶10，更优选20∶80至80∶20，甚至更优选35∶65至55∶45。

根据凯氏定氮法，通过测量总氮并在酪蛋白的情况下使用6.38的转换因子或者对于除酪蛋白之外的其他蛋白质使用6.25的转换因子，基于本发明的营养组合物的干重计，计算蛋白质的重量％。本发明中使用的术语“蛋白质”或“蛋白质组分”是指蛋白质、肽和游离氨基酸的总和。

本发明的营养组合物优选包含1.6至4.0g蛋白质/100kcal营养组合物、优选1.6至3.5g蛋白质/100kcal营养组合物、甚至更优选1.75至2.5g蛋白质/100kcal营养组合物。在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含1.6至2.1g蛋白质/100kcal营养组合物、优选1.6至2.0g蛋白质/100kcal营养组合物、更优选1.75至2.1g蛋白质/100kcal营养组合物、甚至更优选1.75至2.0g蛋白质/100kcal营养组合物。在一个实施方案中，本发明的营养组合物包含的蛋白质的量小于2.0g/100kcal，优选1.6至1.9g，甚至更优选1.75至1.85g/100kcal营养组合物。基于总卡路里计太低的蛋白质含量将导致婴儿和幼儿的生长和发育不充分。过高量会在例如婴儿和幼儿的肾脏上造成新陈代谢压力。当呈液体形式例如作为即食液体时，营养组合物优选包含0.5至6.0g蛋白质/100ml、更优选1.0至3.0g蛋白质/100ml、甚至更优选1.0至1.5g蛋白质/100ml，最优选1.0至1.3g蛋白质/100ml。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含5至20重量％的蛋白质，优选至少8重量％的蛋白质，基于总营养组合物的干重计，更优选8至14重量％的蛋白质，甚至更优选8至9.5重量％的蛋白质，基于总营养组合物的干重计。

为了满足婴儿或幼儿的卡路里需求，营养组合物优选包含45至200kcal/100ml液体。对于婴儿，营养组合物更优选具有60至90kcal/100ml液体，甚至更优选65至75kcal/100ml液体。这种卡路里密度确保水和卡路里消耗之间的最佳比例。对于幼儿——12至36月龄的人类受试者，营养组合物更优选具有45至65的卡路里密度，甚至更优选50至60kcal/100ml。本发明的组合物的摩尔渗透压浓度优选为150至420mOsmol/L，更优选260至320mOsmol/L。低的摩尔渗透压浓度旨在进一步降低胃肠道压力。

当营养组合物为即食、液体形式时，每日给予的优选体积为每日约80至2500ml，更优选约200至1200ml。优选地，每日的喂食次数为1至10，优选3至8。在一个实施方案中，每日以液体形式给予营养组合物，持续至少2天，优选至少4周，优选至少8周，更优选至少12周，其中每日给予的总体积为200ml至1200ml，并且其中每日的喂食次数为1至10。

当呈液体形式时，本发明的营养组合物优选具有1至60mPa.s、优选1至20mPa.s、更优选1至10mPa.s、最优选1至6mPa.s的粘度。低粘度确保适当的液体给予，例如，适合通过整个奶嘴。所述粘度还非常类似于人乳的粘度。此外，低粘度导致正常的胃排空和更好的能量摄入，这对需要能量用于最佳生长和发育的婴儿是必需的。本发明的营养组合物可选地为粉末状，适于与水复溶成即饮液体。本发明的营养组合物优选通过将粉末状组合物与水混合来制备。通常，婴儿配方物以这种方式制备。因此，本发明还涉及一种包装的粉末组合物，其中所述包装提供有将粉末与适量液体混合从而得到粘度为1至60mPa.s的液体组合物的说明书。使用Physica Rheometer MCR 300(Physica Messtechnik GmbH，Ostfilden，Germany)在20℃下以95s^-1的剪切速率测定液体的粘度。

用途

在本发明的上下文中，疾病或某种病症的“预防”还意指患疾病或某种病症的“风险降低”，并且还意指处于患所述疾病或所述某种病症的“风险的人的治疗”。

本发明的包括给予本发明的营养组合物的方法，还指将有效量的营养组合物给予需要这种治疗的个体。

在这个基于组学技术的时代，越来越复杂的工具已经可以在不同的分子水平上研究肠道微生物群。在过去的十年中，最广泛使用的研究肠道微生物群的工具基于测序(部分)细菌16S rRNA基因序列和识别哪些细菌谱系存在。然而，通过基于DNA的方法对肠道微生物群进行分析并不能提供肠道生态系统功能水平的直接观点。

代谢组学是对特定细胞过程留下的独特化学指纹的系统研究，是对其小分子代谢物谱的研究。代谢组代表生物细胞、组织、器官或生物体中所有代谢物的集合，它是细胞过程的最终产物。代谢组是指在生物样品中发现的一整组小分子化学物质。在特定的代谢组中发现的小分子化学物质可包括由生物体自然产生的内源性代谢物(如氨基酸、有机酸、核酸、脂肪酸、胺、糖、维生素、辅因子、色素、抗生素等)以及外源性化学物质。小分子的分子量通常必须＜1500Da，才能被认定为代谢物，或被认为是代谢组的一部分。代谢组学可对肠道微生物群的功能图有很大的贡献。毕竟，代谢物描绘了更最终的表型，这是生态系统中所有基因编码功能的结果，因为它们代表了所有激活基因、表观遗传表达修饰和其他转录调控、翻译后蛋白质修饰和环境因素(生物和非生物)的最终总和。

有显著性差异的代谢物代表了许多功能类别。这种非靶向数据集表明，婴儿肠道生态系统的功能高度依赖于饮食且对饮食反应。

本研究中粪便样品的特征反映了与对照组相比，喂食含有不可消化寡糖的配方物、优选喂食含有不可消化寡糖的部分发酵的配方物的婴儿，具有更类似于母乳喂养的肠道微生物群组成和更类似于母乳喂养的肠道生理条件。此外，更深入的非靶向分析表明，喂食本发明的优选部分发酵的配方物的婴儿的肠道微生物群的功能与母乳喂养参考组的偏差要小于喂食对照配方物的婴儿，这表明含有不可消化寡糖的配方物，优选含有不可消化寡糖的部分发酵的配方物，推动肠道生态系统向更类似母乳喂养的情况发展。已发现，与氨基酸、脂质、异生物质、碳水化合物、核苷酸、辅因子和维生素、能量和肽有关的超通路受到影响。代谢物数量变化的最大影响显示在与氨基酸、脂质有关的途径中，并且当观察相对变化时(变化的途径代谢物的数量/测试的总的途径代谢物的数量)，在与能量、核苷酸和辅因子以及维生素有关的途径中也观察到很高的差异。

在对代谢物谱的研究中，本发明人发现，在喂食本发明的营养组合物时，婴儿的肠道代谢组更类似于母乳喂养婴儿的肠道代谢组。与喂食不含不可消化寡糖的配方物的婴儿的肠道代谢组相比，以及与喂食不含不可消化寡糖的未发酵配方物的婴儿的肠道代谢组相比，所述肠道代谢组更类似于母乳喂养婴儿的肠道代谢组。

因此，在本发明的方法或用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，肠道代谢组更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

此外，在本发明的方法或用途的优选的实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，肠道代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组，该方法包括给予包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物。

在一个实施方案中，根据上述方面发明的方法可视为建立代谢组的非医疗方法。

本发明还可以表述为不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的营养组合物的用途，所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

本发明还可以表述为包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

在一个实施方案中，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组，该方法包括给予至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖。

本发明还可以表述为发酵成分和不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物的用途，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

本发明还可以表述为一种至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组更类似于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组。

优选地，与在母乳喂养婴儿中观察到的相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平。优选地，与对照配方物喂养的婴儿相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于显著性差异的水平。

在本发明的方法或用途的优选实施方案中，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，在肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于显著性差异的水平，并且与喂食不含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在本发明的方法或用途的优选实施方案中，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，该方法包括给予包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

本发明还可以表述为不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的营养组合物的用途，所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明还可以表述为一种包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平，该方法包括给予包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物。

本发明还可以表述为不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的营养组合物的用途，所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的营养组合物的用途，所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在本发明的建立代谢组的优选实施方案中，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，所建立的代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平，并且与喂食不含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，所建立的代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在本发明的方法或用途的优选实施方案中，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于显著性差异的水平，并且与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在本发明的方法或用途的优选实施方案中，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，在喂食本发明营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，该方法包括给予至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

本发明还可以表述为发酵成分和不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物的用途，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明还可以表述为至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物(与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相关)至少减少5％，更优选地，肠道代谢组中水平有显著性差异的代谢物至少减少10％。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平，该方法包括给予至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖。

本发明还可以表述为发酵成分和不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物的用途，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在一个方面，本发明涉及一种在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的方法，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为发酵成分和不可消化寡糖在制备用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组的至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物的用途，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

本发明还可以表述为至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，用于在36月龄以下的人类受试者中建立代谢组，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，该代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

在本发明的建立代谢组的优选实施方案中，与人乳喂养的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，所建立的代谢组中水平有显著性差异的代谢物小于45％，更优选小于40％，甚至更优选小于35％的代谢物处于有显著性差异的水平，并且与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道代谢组相比，所建立的代谢组中水平有显著性差异的代谢物大于10％，更优选大于15％，甚至更优选大于20％的代谢物处于有显著性差异的水平。

水平不同的代谢物的百分比是根据测试的总代谢物来表示的。本发明的营养组合物是包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖的营养组合物，优选本发明的营养组合物是至少由产乳酸细菌部分发酵的营养组合物，其中所述营养组合物包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐，以及其中所述营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖。

对照配方物是不包含不可消化寡糖的配方物。优选地，对照配方物是不含发酵成分且不含不可消化寡糖的配方物。

在优选的实施方案中，与在人乳喂养的婴儿中观察到的相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中，水平有显著性差异的代谢物小于350种，更优选小于300种代谢物处于有显著性差异的水平。在优选的实施方案中，与对照配方物喂养的婴儿相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中，水平有显著性差异的代谢物大于150种，更优选大于200种代谢物处于有显著性差异的水平。

在优选的实施方案中，与对照配方物喂养婴儿中没有统计学差异的代谢物(与人乳喂养婴儿相关)的数量相比，在喂食本发明的营养组合物的婴儿中观察到的肠道代谢谱或代谢组中没有统计学差异的代谢物(与人乳喂养的婴儿相关)至少有75种以上，优选至少有100种，更优选至少有125种。

在本发明的方法和用途的进一步优选实施方案中，本发明进一步用于促进36月龄以下的人类受试者肠道微生物群的发育，与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群相比，该肠道微生物群的组成更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群。优选地，促进肠道微生物群的发育是指与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的肠道微生物群相比，肠道微生物群具有较低的α-多样性，优选由Chao-1指数确定。此外，优选地促进肠道微生物群的发育是指与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的肠道微生物群相比，肠道微生物群具有较低丰度的Blautia和/或丹毒丝菌目(Erysipelotrichales)，和/或提高丰度的乳杆菌属，优选指肠道微生物群具有较低丰度的Blautia和/或丹毒丝菌目的，更优选指肠道微生物群具有较低丰度的Blautia。

在本发明的方法和用途的进一步优选实施方案中，本发明进一步用于促进36月龄以下的人类受试者肠道微生物群的发育，与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的同龄人类受试者的肠道微生物群相比，该肠道微生物群的组成更接近于人乳喂养的同龄人类受试者的肠道微生物群。优选地，促进肠道微生物群的发育是指与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的肠道微生物群相比，肠道微生物群具有较低的α-多样性，优选由Chao-1指数确定。此外，优选地促进肠道微生物群的发育是指与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的肠道微生物群相比，肠道微生物群具有较低丰度的Blautia和/或丹毒丝菌目，和/或提高丰度的乳杆菌属，优选指肠道微生物群具有较低丰度的Blautia和/或丹毒丝菌目，更优选指肠道微生物群具有较低丰度的Blautia。

本发明人发现了对粪便代谢组的影响，并认为从粪便样品中获得的结果代表了肠道的情况，特别是大肠或结肠。在本发明的背景下，“肠道代谢组”或“肠道微生物群功能”同样指“大肠代谢组”或“大肠微生物群功能”或“结肠代谢组”或“结肠微生物群功能”或“粪便代谢组”或“粪便微生物群功能”。

对于胆汁酸，已发现在肠道中观察到次级胆汁酸的差异。次级胆汁酸是由初级胆汁酸通过肠道细菌的酶产生的，因此反映了肠道微生物群的功能。在干预期后发现，实验组次级胆汁酸的模式比对照组更类似于母乳喂养参考组的模式。一般情况下，母乳喂养组和实验组的次级胆汁酸与对照组相比较低。在测量的23种次级胆汁酸中，有14种是这种情况，其中包括6种丰度更高的次级胆汁酸中的5种，1，2-脱氢胆酸盐、3-氢胆酸盐、7-酮脱氧胆酸盐、7-酮石胆酸盐和hyocholate。在6种丰度较高的次级胆汁酸中，母乳喂养组中只有牛磺胆烯酸硫酸酯(taurocholenate sulfate)高于对照组和实验组。对于其余9种少量或非常少量存在的次级胆汁酸，除了在实验组中都是最低的glycocholenate sulfate和硫酸牛磺石胆酸盐3，观察到没有或有非常低的差异。这些效果具体在3b-羟基-5-cholenoic acid、6-氧代石胆酸盐、7-酮石胆酸盐、7-酮脱氧胆酸盐、glycocholenate sulfate和乌索脱氧胆酸盐中观察到。此外，还发现对初级胆汁酸的效果，这不是微生物生物转化的直接结果，在实验组，其水平一般较低，比对照组更接近于母乳喂养参考组，特别是甘氨鹅脱氧胆酸盐和甘胆酸盐。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指胆汁酸谱，优选次级胆汁酸谱。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的胆汁酸的水平相比，胆汁酸的水平、优选次级胆汁酸的水平降低。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的胆汁酸的水平相比，胆汁酸的水平、优选次级胆汁酸的水平降低。

有趣的是，已发现肠道γ-氨基丁酸(GABA)的水平也受到影响。与对照组相比，实验组GABA水平在第8周和第17周显著升高。同样，母乳喂养组的水平也明显高于对照组。另一方面，实验组与母乳喂养组的差异无统计学意义。肠道GABA被认为是有益的，并对内脏敏感性和疼痛知觉具有有益的效果。GABA被认为有益地影响肠道和中枢神经系统。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指γ-氨基丁酸(GABA)的水平。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的GABA水平相比，γ-氨基丁酸(GABA)的水平提高。

在本发明的方法和用途的优选实施方案中，促进肠道微生物群功能的发育是指与喂食至少不由产乳酸细菌部分发酵且不包含基于干重计总共0.02至1.5重量％的乳酸和乳酸盐、不包含不可消化寡糖的营养组合物的人类受试者的GABA的水平相比，γ-氨基丁酸(GABA)的水平提高。

在本发明的背景下，促进肠道微生物群功能发育的同义词是发育、改善、诱导、维持、支持或驱动肠道微生物群功能。

与给予不包含发酵成分和不可消化寡糖、优选不包含发酵成分和不可消化寡糖的组合的营养组合物的婴儿的肠道微生物群功能相比，观察到本文所述效果，即促进、发育、改善、诱导、维持或驱动肠道微生物群功能，使之更类似于母乳喂养婴儿中发现的肠道微生物群功能。

在一个实施方案中，本发明的营养组合物用于改善0至36月龄的人类受试者的肠道微生物群的功能。在一个实施方案中，本发明营养组合物用于改善0至18月龄的人类受试者的肠道微生物群功能，甚至更优选12月龄以下的婴儿，甚至更优选0至6月龄的婴儿，最优选0至4月龄的婴儿。在一个实施方案中，本发明营养组合物用于改善12至36月龄的幼儿的肠道微生物群功能，最优选18至30或至24月龄的幼儿。优选地，本发明营养组合物进一步用于为所述人类受试者提供营养。优选地，营养组合物的给药持续至少1周，更优选至少4周，更优选至少8周，甚至更优选至少4个月。

在优选实施方案中，本发明的方法或用途用于***分娩的婴儿。在优选实施方案中，本发明的方法或用途用于足月婴儿，优选用于健康足月婴儿。在优选实施方案中，本发明的方法或用途用于健康的***分娩婴儿。在优选实施方案中，本发明的方法或用途用于剖腹产出生的健康婴儿。

在一个实施方案中，本发明的方法或用途用于肠道微生物群脆弱或失衡或肠道微生物失调的36月龄以下的人类受试者，或有肠道微生物群脆弱或失衡或肠道微生物失调风险的36月龄以下的人类受试者，优选选自以下的36月龄以下的人类受试者：早产儿、小于胎龄出生的婴儿、低出生体重的婴儿、接受过或已接受抗生素治疗的婴儿或幼儿、剖腹产出生的婴儿或患有或已经患有肠道炎症或肠道感染的婴儿或幼儿或已接受产前抗生素治疗的母亲生产的婴儿。微生物失调包括并且优选是菌群失调。优选地微生物失调或菌群失调是结肠中的失调。

在一个实施方案中，本发明的营养组合物用于提供健康的肠道功能和/或用于预防和/或治疗36月龄以下的人类受试者的肠道微生物群失调。

在本发明的方法或用途的一个实施方案中，最终的营养组合物包含基于干重计2.5至15重量％的不可消化寡糖，任选地包含本文定义的发酵成分。

在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其变形以其非限制性含义使用，意指包括该词后面的项目，但不排除未具体提及的项目。另外，由不定冠词“一(a)”或“一(an)”引出的元素不排除存在多于一个元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅一个元素。因此，不定冠词“一(a)”或“一(an)”通常意指“至少一个”。重量％意指重量百分比。

附图说明

图1显示了在每次就诊和比较不同饮食组时水平有显著性差异的代谢物的数值信息。

图2显示了每条代谢超通路、每次就诊、每组的显著变化的代谢物的分布；A：代谢物的数量；B：基于所分析的代谢物的总数计代谢物的百分比；上板：母乳喂养组与对照组；中板：母乳喂养组与实验组；下板：实验组与对照组。

实施例

实施例1：与母乳喂养参考组相比，含有不可消化寡糖的部分发酵的婴儿配方物或对照配方物对肠道微生物群功能的影响

在一项探索性临床研究中，对健康足月婴儿采用3-4个月的干预，研究了实验配方物(配方物1)与对照配方物(配方物2)的生长和安全性。在随机的、对照的、多中心的、双盲的、前瞻性临床试验中，婴儿在28日龄之前入组，并被指定接受两种配方物中的一种直至17周龄。

实验婴儿配方物1是一种含有0.8g/100ml重量比为9∶1的scGOS(来源

GOS)和lcFOS(来源)不可消化寡糖的婴儿配方物。在该婴儿配方物中，基于干重计，30％源自Lactofidus^TM，一种以商品名Gallia销售的市售可得的婴儿配方物。Lactofidus^TM是一种发酵乳衍生组合物，通过用嗜热链球菌发酵而制备，并且包含短双歧杆菌。采用温和的热处理。婴儿配方物1包含基于干重计约0.33重量％(乳酸+乳酸盐)，其中至少95％为L-乳酸+L-乳酸盐。在婴儿配方物1中，产乳酸细菌嗜热链球菌的菌落形成单位的水平约为2x 10⁴cfu/g干重，且源自发酵成分Lactofidus^TM。

对照婴儿配方物2是一种市售可得的不含scGOS/lcFOS的未发酵婴儿配方物。这两种配方物的组成在能量和常量营养素组成上相似(每100ml：66kcal、1.2g蛋白质(牛乳清蛋白/酪蛋白，重量比为1/1)、7.7g可消化碳水化合物(其中7.6g乳糖)、3.4g脂肪(主要是植物脂肪)。根据婴儿配方物的国际指令2006/141/EC，这两种婴儿配方物还包含维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素。

作为参考，一组婴儿被列入在17周龄前完全母乳喂养。意向治疗(ITT)人群由随机分配婴儿配方物的所有受试者组成(n＝199)，此外，100名受试者被列入母乳喂养参考组。ITT人群由实验组94名受试者、对照组105名受试者组成。

粪便样品是在随机分组或之后的第一天(基线)、8周龄和16-17周龄，不迟于最后一次摄入研究产品后的第一天收集的。对一个婴儿小组的粪便参数进行了分析，这些婴儿选择：自然出生(***分娩)，从出生到研究参与结束没有使用益生菌、增稠剂、抗生素或其他可能影响微生物群的药物，在粪便取样前三天或更短时间内没有泻药。这个小组由来自三个研究组中的每一个的30名受试者组成--共有90名受试者，共产生270个粪便样品。由于受试者可能已经食用了他们各自的研究产品一天，或者--甚至更相关的--可能已经食用了其他市售可得的含有发酵配方物或益生元或益生菌的婴儿配方物，与母乳喂养的参考组相比，已经产生了影响。

根据制造商的协议，除了添加两步珠磨步骤，使用QIAmp DNA Stool Mini Kit(Qiagen)从粪便样品中提取DNA。取0.2-0.3g粪便样品，300mg 0.1mm玻璃珠和1.4mL ASL(裂解)缓冲液，并在该悬浮液上，进行第一步珠磨步骤3x 30秒(FastPrep-24 instrumentprogram 5.5)。加入InhibitEx片剂后，进行第二步珠磨步骤3x 30秒(FastPrep-24instrument program 5.5)，使样品均匀化。在每个珠磨步骤后，将样品在冰上冷却5分钟。提取的DNA纯度用NanoDrop^TM分光光度计(Thermo Fisher Scientific Inc.)进行检查，而DNA质量和浓度则用Quant-iTTM 193 dsDNA BR Assay kit(Invitrogen^TM)进行测量。DNA等位基因在-80℃下储存直到使用。

从纯化的粪便DNA提取物中，用引物357F和926Rb扩增了细菌16S rRNA基因的V3-V5区。用454 FLX测序仪(454 Life Sciences，Branford，CT，USA)对获得的16S rRNA基因扩增子进行了焦测序，如前所述。

利用1.8.0版本的Quantitative Insights Into Microbial Ecology(QIIME)对序列数据进行分析。设置质量控制过滤器以丢弃长度在200个碱基以下的序列，长度在1000个碱基以上的序列，其中平均序列质量分数小于25，具有任何模糊碱基，或包含大于6个碱基的均聚物段。嵌合序列用QIIME自有的ChimeraSlayer过滤。采用USEARCH算法对过滤后的序列进行从头操作分类单元(OUT)筛选，该算法对具有大于97％的同一性的序列进行分组。QIIME对OTU进行了稀疏处理，以确保每个样品的读取数量相同，以便使用以下度量来进行α-多样性计算：Chao1和观察物种。随后，通过与SILVA核糖体RNA数据库(发布版本1.0.8)比对，利用核糖体数据库项目分类器(RDP)对每个OTU的具有代表性的序列(即最丰富的序列)进行分类。

统计：对于靶向生理和微生物参数，采用Wilcoxon Rank Sum检验来计算每个时间点的实验和对照之间差异的p值。如果在70％以上的样品中检测到给定参数的值的百分比，则将低于定量限的值替换为(检测限+定量限)/2，而低于检测限的值替换为检测限/根号2。如果任何一组的测量百分比低于定量限，则将参数转换为二进制(1表示存在，0表示缺失或低于检测限)。对于所有二进制参数，采用Chi-square检验(fisher Exact，如果预期的细胞计数＜5)进行推理。

对于16S rRNA基因扩增子测序结果，每个分类单元的相对丰度主要接受两部分统计检验(Wagner等人，2011)。在这个检验中，首先比较两组中零的比例，然后比较两组中非零数据的中位数。这两部分结合在一起，并在每次就诊时为每个分类单元获得一个p值。当最小组至少有10个观测值(即非零值)时，两部分统计检验是不可靠的(Wagner等人，2011)，因此数据按以下步骤进行分析：如果两组具有＞＝10个非零值，则进行两部分统计；如果任一组具有＜10个非零值，则将数据视为二进制，并进行Chi-square检验，除非50％细胞的预期计数＜5，在这种情况下进行Barnard检验。在得到的p值上，通过评估阳性假发现率(pFDR)，对多重检验进行校正(Benjamini&Hochberg，1995)。使用由Storey，Taylor，&Siegmund(2004)记载的引导方法估计π₀，并随后计算每个特征的显著性量度的q值。对于代谢组学的结果，归一化和重新缩放的信号只进行两部分统计测试(Wagner等人，2011)，然后也计算q值。当p值＜0.05，q值＜0.05时，测序结果被认为具有统计学意义。当p值＜0.05，q值＜0.1时，代谢组学结果被认为具有统计学意义。

冷冻粪便试样在干冰下运往商业实验室(Metabolon，Durham，NC)进行代谢物分析。代谢谱的程序已在先前描述过(Chow，J.等人，Journal of Proteome Research，2014.13(5)：p.2534-2542)，用于进行分析的联合使用的三个平台，包括GC/MS和两个LC/MS系统，一个优化用于正电离，一个优化用于负电离。数据在多个平台运行日收集，并通过缩放调节到每个单独化合物的每个组平衡运行日块的中位数。这使任何日间仪器增益或漂移最小化，但不干扰日间样品的变异性。数据没有进行其他调节或归一化。

结果：

用qPCR进行靶向微生物群定量研究表明，与对照相比，8周龄和17周龄实验组的样品显示，有统计学意义的双歧杆菌的量增加以及艰难梭菌(Clostridium difficile)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)组的量降低，而在基线时，这些测量显示治疗组之间没有显著性差异。观察到对细菌总量无显著影响。

非靶向16S rRNA基因扩增子测序表明，在干预4个月后，实验配方物与对照配方物比较时，使用实验配方物，各种细菌分类单元(4-11属，取决于时间点)确实发生了一致的变化。在干预2个月时，观察到了中间效应。在干预结束时，实验组中这些差异细菌群的水平似乎更符合母乳喂养参考组中检测到的水平。见表1。

特别是在第17周，实验组的梭菌属(Clostridium)、Blautia和丹毒丝菌目成员的相对丰度显著降低，与母乳喂养参考组更相当。双歧杆菌增多。发现对乳酸杆菌(对照组下降)也有影响，在第8周观察到有统计学意义的差异。此外，发现对照组具有较高的梭菌目(Clostridiales)、Blautia和丹毒丝菌目以及较低的双歧杆菌，更偏离于实验组和母乳喂养参考组。

总体微生物群谱多样性可归纳为每个样品的一个多样性指数。这种多样性指数，更好地称为α-多样性，可以用各种方式计算。母乳喂养参考组的Chao-1指数(基于丰度数据的物种丰富度估计)一直很低(4个月时中位数Chao1指数为91.37，Q1-Q3为66.71-119.2；平均值为90.17，95％置信区间(CI)范围为79.48-100.9)，而对照组的Chao-1指数随时间增加(4个月时中位数为117.9，Q1-Q3为96.46-128.1；平均值为114.3，95％CI范围为104.7-124)。实验组Chao-1指数仍然较低，并且更类似于母乳喂养参考组(4个月时中位数为96.5，Q1-Q3为86.17-114.3；平均值为105.2，95％CI范围为93.78-116.6)。与这个观察结果一致，实验组在4个月时以OTU(操作分类单位)表示的观察物种的中位数更低，更类似于母乳喂养参考组，而对照组的中位数更高。

这些结果表明，与对照组相比，喂食含有不可消化寡糖的部分发酵的配方物的婴儿的肠道微生物群更类似于母乳喂养的肠道微生物群组成。

其次，对粪便样品进行了非靶向代谢组学研究，共鉴定了总共786种独特的代谢物(每个样品470-625种独特的代谢物)。通过主成分分析(PCA)对代谢组学数据进行分析，观察到两种配方物喂养的婴儿和母乳喂养的婴儿在基线时的分离情况。试验期间和试验后，实验组的分离保持不变，但对照组的分离随时间增加(见图1)。代谢组学PCA图中观察到的分离大于在16S rRNA基因扩增子测序数据(数据未显示)上生成的PCA图，此外，前两个主要成分解释了代谢组学PCA中更多的变异。这些结果表明，代谢组学提供了更高分辨率的生物数据，代谢物谱在显示粪便微生物群的差异功能方面更敏感，因此饮食干预对肠道代谢组学的影响也更敏感。

母乳喂养组与对照组和实验组与对照组之间的代谢物数量有显著性差异，但同时母乳喂养组与实验组之间没有显著性差异，第8周为58，第17周为91。

检测到的代谢物表明，母乳喂养的婴儿与对照组或实验组之间在基线上有显著性差异，分别为268种(34.7％)或250种(32.6％)，而两种治疗组之间无显著性差异(即只有16种(2.1％)代谢物有显著性差异；图1)。这可以解释为，母乳喂养的参考组在列入时已经完全母乳喂养，而被纳入两种配方物喂养组的婴儿已经(部分)配方物喂养。有趣的是，母乳喂养组和对照组之间有显著性差异的代谢物数量在对照组中随时间增加到404种(51.9％)代谢物，而实验组和母乳喂养参考组之间的差异代谢物数量或多或少保持不变，即在研究结束时有261种(34.3％)代谢物，在第8周的中间时间点已经在很大程度上观察到了这种效应。在第8周有87种和在第17周有116种代谢物的水平在一方面有显著性差异(p＜0.05，q值＜0.1)，当母乳喂养参考组与对照组比较时，以及当对照组与实验组比较时，而在另一方面，母乳喂养参考组与实验组之间没有显著性差异。

这表明，在喂食对照配方物期间，微生物群的功能随时间逐渐偏离母乳喂养参考组。对于实验配方物喂养的婴儿中粪便微生物群的功能，基线差异在本文测量的3-4个月的时间段内没有增加。当将两个治疗组与16S rRNA基因扩增子序列进行比较时，显示的更详细的微生物群组成的差异表明，主要在实验组中检测到的17周龄差异细菌属的水平与母乳喂养参考组中观察到的水平相同。与代谢组学测量的靶向生理参数相比，这些变化似乎以较慢的速度跟随，在第8周已经有显著性差异(图1)。在实验中减少的许多属是已知的成人共生细菌，并且在母乳喂养的参考组婴儿中不存在/减少。

有显著性差异的代谢物代表了许多功能类别。这一非靶向数据集表明，婴儿肠道生态系统的功能高度依赖于饮食和对饮食反应。

本研究中粪便样品的特征反映了与对照组相比，喂食部分发酵配方物的婴儿具有更类似于母乳喂养的肠道微生物群组成和更类似于母乳喂养的肠道生理条件。此外，更深入的非靶向分析表明，喂食部分发酵配方物的婴儿的肠道微生物群的功能与母乳喂养参考组的偏差小于喂养对照配方物的婴儿，这表明部分发酵配方物促使肠道生态系统更类似于母乳喂养的情况。涉及关于氨基酸、脂质、异生物质、碳水化合物、核苷酸、辅因子和维生素、能量和肽的超通路(见图2)。代谢物数量变化的最大影响表现在与氨基酸和脂质有关的途径上，在观察相对变化时，在与能量、核苷酸、辅因子和维生素有关的途径上也观察到很高的差异。

放大胆汁酸，发现在肠道中观察到次级胆汁酸的差异。次级胆汁酸是由初级胆汁酸通过肠道细菌的酶产生的，因此反映了肠道微生物群的功能。干预阶段后发现，实验组次级胆汁酸的模式比对照组更类似于母乳喂养参考组的模式。通常，与对照组相比，母乳喂养组和实验组的次级胆汁酸较低。测量的23种次级胆汁酸中有14种是这种情况，其中包括6种更丰富的次级胆汁酸中的5种，1，2-脱氢胆酸盐、3-氢胆酸盐、7-酮脱氧胆酸盐、7-酮石胆酸盐和hyocholate，特别是7-酮石胆酸盐。母乳喂养组的牛磺胆烯酸硫酸酯高于对照组和实验组。对于其余9种少量或非常少量存在的次级胆汁酸，除了在实验组中都是最低的glycocholenate sulfate和硫酸牛磺石胆酸盐3，没有或有非常低的差异。对于3b-羟基-5-cholenoic acid、6-氧代石胆酸盐、7-酮石胆酸盐、7-酮脱氧胆酸盐、glycocholenatesulfate和乌索脱氧胆酸盐，变化显著。此外，还发现对初级胆汁酸的影响，这不是微生物生物转化的直接结果，在实验组中，其水平一般较低，比对照组更接近于母乳喂养的参考组，特别是甘氨鹅脱氧胆酸盐和甘胆酸盐。

有趣的是，发现肠γ-氨基丁酸(GABA)水平也受到影响。实验组GABA的水平在第8周和第17周显著高于对照组。同样，母乳喂养组的水平也显著高于对照组。另一方面，实验组与母乳喂养组之间的差异无统计学意义。肠道GABA被认为是有益的，并对内脏敏感性和疼痛知觉具有有益的效果。GABA被认为有益地影响肠内和中枢神经系统。

这些结果表明，与给予对照配方物相比，在给予部分发酵并包含不可消化寡糖的营养配方物时，促进肠道微生物群的发育，使其功能更接近于人乳喂养的肠道微生物群功能。

实施例2：喂食含有不可消化寡糖的配方物改善肠道微生物群

在另一个随机的、多中心的、双盲的、前瞻性临床试验中，婴儿在28日龄之前入组，并被指定接受三种配方物中的一种直至17周龄：

测试组1：婴儿配方物1包含每100ml：66kcal、1.35g蛋白质(牛乳清蛋白/酪蛋白，重量比为1/1)、8.2g可消化碳水化合物(其中5.6g乳糖和2.1g麦芽糖糊精)、3.0g脂肪(主要是植物脂肪)、0.8g包含重量比为9∶1的scGOS(来源GOS)和lcFOS(来源)的不可消化寡糖。基于干重计，在该婴儿配方物中约50％源自Lactofidus^TM。婴儿配方物包含基于干重计约0.55重量％的乳酸+乳酸盐，其中至少95％为L(+)-乳酸/乳酸盐。根据婴儿配方物的国际指令2006/141/EC，组合物还包含维生素、矿物质、微量元素和其他微量营养素。

测试组2：婴儿配方物2，类似于配方物1，其中基于干重计约15％源自Lactofidus^TM。该婴儿配方物包含基于干重计约0.17重量％的乳酸+乳酸盐，其中至少95％为L(+)-乳酸/乳酸盐。

测试组3：婴儿配方物3，类似于婴儿配方物1，但不含不可消化寡糖scGOS和lcFOS。

测试组4：婴儿配方物4，一种包含0.8g不可消化寡糖的未发酵婴儿配方物，所述不可消化寡糖包含重量比为9∶1的scGOS(来源GOS)和lcFOS(来源

)，但不包含Lactofidus^TM，并且其余部分在组成上与婴儿配方物1相似。

在基线处以及在干预17周后，以类似于实施例1中所述的方式收集粪便样品用于微生物学分析，不同之处在于QIIME版本(1.6.0)，对16S rRNA基因扩增子测序结果的统计分析采用Wilcoxon秩和检验，计算各时间点组间差异的p值，并结合pFDR估计(q值计算)，以控制由于多次测试而产生的假发现。仅分析具有一组完整的粪便样品(两次就诊)的***出生的受试者小组的样品(每组30名受试者，产生240个粪便样品)，其中粪便量足以进行所有分析。此外，排除了来自以下婴儿的样品：在出生后任何时候使用任何全身性抗生素或在研究期间使用添加到配方物中的增稠剂的婴儿。

在选定的一组粪便样品中，评估所用的婴儿配方物对微生物群的影响。干预后(在第17周)，测量的来自测试组3(不含发酵成分，但含GOS/FOS)的婴儿的粪便微生物参数，显示双歧杆菌数量增加，艰难梭菌水平测量的病原体发生率较低。在至少5个分类单元中观察到与乳杆菌属、Blautia、梭菌属、消化链球菌科和丹毒丝菌目有关的差异，结果如表2所示。

表2：在17周时，具有显著q值＜＝0.1的分类单元丰度

与第3组和第4组相比，第1组的乳酸杆菌含量增加。与第3组和第4组相比，第1组和第2组的Blautia和丹毒丝菌目含量下降。在所有情况下，第1组和第3组之间的差异有统计学意义，p＜0.05。

总体微生物群谱多样性可归纳为每个样品的一个多样性指数。对于每个样品，Chao-1指数以每个样品1496个序列的深度计算(在没有缺失值的情况下，可能的深度测量)。在4个月时，第1组的Chao-1估计值较低，因此表明多样性(中位数为70.68，Q1-Q3为52.5-145.9；平均值为73.11，95％CI区间为60.34-85.89)低于不含不可消化寡糖的第3组(中位数为104.2，Q1-Q3为77.69-139.8；平均值为104.8，95％CI区间为88.97-120.7)，也低于不含发酵成分的第4组(中位数为97.32，Q1-Q3为68.99-120.5；平均值为96.04，95％CI为82.71-109.4)。第1组与第3组之间的差异有统计学意义(p＝0.005)。

代谢组学：

以类似于实施例1的方式确定了喂食配方物1、3和4的组之间代谢物数量的差异(未分析第2组)。在第17周时，NDO的存在对代谢物数量和百分比的差异影响最大。喂食配方物4和3的组之间的代谢物差异为41.4％(393种代谢物)，喂食配方物3和1的组之间的差异为34％(323种代谢物)。

观察到由于NDO的存在，对氨基酸和肽超通路产生了影响，并观察到在NDO旁边存在的发酵配方物对其他超通路产生了额外的影响。当观察代谢物的数量时，与脂质有关的超通路就是如此，当观察代谢物的百分比时，与脂质、核苷酸、维生素和辅因子、能量、异生物质和碳水化合物有关的超通路就是如此。

此外，对于初级和次级胆汁酸，配方物4和1之间的差异小于配方物3和1之间的差异，但在测试的9种初级胆汁酸中，配方物1的硫酸甘氨鹅脱氧胆酸盐3和硫酸胆酸盐最低。对于鉴定的25种次级胆汁酸，与配方物3相比，配方物1和4的水平较低，在喂食配方物1的组中3-氢胆酸盐、6-氧基石胆酸盐、脱氢石胆酸盐、牛磺胆烯酸硫酸酯和3b-羟基-5-cholenoic acid最低。

放大特定代谢物，在第1组中观察到4羟基苯丙酮酸的最高水平，其在实施例1的母乳喂养组中也较高。色氨酸、半胱亚磺酸、高瓜氨酸(homocitruline)、硬脂酰乙醇胺、鞘氨醇、尿苷、5-甲基尿苷、β-丙氨酸、草酸和D-***的水平在第1组中最低，而在实施例1的母乳喂养参考组中也最低。

当结合临床试验实施例1和2的结果时，对照组和母乳喂养参考组是存在的。因此，可以推断，与不含不可消化寡糖的配方物相比，在喂食含有不可消化寡糖的配方物的婴儿中，观察到对肠道微生物群功能的改善效果，其更类似于母乳喂养参考组。当营养组合物是部分发酵的，观察到进一步改善效果。与不含发酵成分和不含不可消化寡糖的配方物相比，观察到了改善效果。

这些结果表明，与不含不可消化寡糖的配方物喂养的婴儿相比，不可消化寡糖，特别是GOS和/或FOS，更具体地是GOS和FOS，对肠道微生物群的肠道代谢组或功能有影响，使其更接近于母乳喂养婴儿的肠道微生物群的肠道代谢组或功能。当婴儿食用另外至少由产乳酸细菌部分发酵的配方物时，这种效果会得到进一步改善。