阅读说明：本技术 智力障碍或自闭症治疗药 (Remedies for intellectual disability or autism ) 是由 山形要人 岛田忠之 杉浦弘子 安田新 于 2018-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了对智力障碍或自闭症的治疗有效的新颖治疗药。智力障碍或自闭症治疗药含有选自替吡法尼和洛那法尼的至少一种作为有效成分。作为智力障碍,可以列举记忆障碍,作为记忆障碍,可以列举由Tsc1基因和/或Tsc2基因的异常引起的记忆障碍和癫痫诱发性的记忆障碍。本发明还提供了智力障碍或自闭症的治疗方法,该治疗方法包括：对智力障碍或自闭症的患者给予有效量的选自替吡法尼和洛那法尼的至少一种。(The present invention discloses novel therapeutic agents effective for the treatment of intellectual disabilities or autism. A therapeutic agent for intellectual disability or autism comprising at least one selected from the group consisting of tipifarnib and lonafarnib as an active ingredient. Examples of the intellectual disorder include a memory disorder, and examples of the memory disorder include a memory disorder caused by an abnormality of Tsc1 gene and/or Tsc2 gene, and a seizure-induced memory disorder. The present invention also provides a method of treatment of intellectual impairment or autism comprising: administering to a patient with intellectual impairment or autism an effective amount of at least one selected from the group consisting of tipifarnib and lonafarnib.)

智力障碍或自闭症治疗药

技术领域

本发明涉及智力障碍或自闭症治疗药。

背景技术

智力障碍是由于在发育期以前产生的智力功能障碍而导致认知能力停留在低水平的状态。目前没有治疗药，需要疗育或教育、福利性的对策。自闭症直到3岁左右才显现出来，是以(1)难以和他人形成社交关系、(2)语言发育迟缓、(3)拘泥于特定事物为特征的行为障碍，推测中枢神经系统中存在由某些因素引起的功能不全。

专利文献1中记载了特定的氮杂喹啉衍生物，且记载了该氮杂喹啉衍生物对包括自闭症或发脾气(癇癪)在内的多种疾病的治疗有效。

另一方面，已知替吡法尼(Tipifarnib)和洛那法尼(Lonafarnib)作为抗癌药有用(例如专利文献2)。然而，却全然不知这些药剂对智力障碍或自闭症的治疗有效。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2002-508768号公报；

专利文献2：日本特表2003-525255号公报；

非专利文献

非专利文献1：Crino, P.B., K.L. Nathanson, and E.P. Henske, The tuberoussclerosis complex. N Engl J Med, 2006. 355(13): 第1345-56页。

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于：提供对智力障碍或自闭症的治疗有效的新颖治疗药。

用于解决课题的手段

由于智力障碍和自闭症经常并存，因此推测两种病态还存在共同的发病机理。于是，在遗传上探索引起这些病态的疾病，且着眼于结节性硬化症。结节性硬化症是在全身多发错构瘤的母斑病，伴有作为中枢神经症状的顽固性癫痫、精神迟缓或自闭症(非专利文献1)。已知结节性硬化症的病原基因是Tsc1m或Tsc2，因此考虑以敲除Tsc1m或Tsc2的小鼠作为两者共同的病态模型。

在本发明中，制作结节性硬化症的模型小鼠和显示由除此以外的原因引起的智力障碍或类自闭症行为异常的小鼠，首先确认到行为异常。然后，首次明确了迄今为止作为抗癌药来研究的替吡法尼和洛那法尼对这些智力障碍或类自闭症行为异常非常有效，从而完成了本发明。

即，本发明提供智力障碍或自闭症治疗药，该治疗药含有选自替吡法尼和洛那法尼的至少一种作为有效成分。另外，本发明提供智力障碍或自闭症的治疗方法，该治疗方法包括：对智力障碍或自闭症患者给予有效量的选自替吡法尼和洛那法尼的至少一种。而且，本发明提供：用于智力障碍或自闭症治疗的选自替吡法尼和洛那法尼的至少一种化合物。

发明效果

根据本发明，首次提供了对智力障碍或自闭症的治疗有效的治疗药。

附图说明

[图1]是显示下述实施例1中进行的、显示本发明治疗药的效果的情境依赖性恐惧辨别试验(文脈依存的恐怖弁別試験)的结果的图。a是情境依赖性恐惧辨别试验的示意图，b是显示畏缩时间(すくみ時間)的测定结果的图，所述畏缩时间显示Tsc2^+/-小鼠的情境依赖性恐惧记忆的异常和通过给予本发明的治疗药而获得的恢复。c是显示畏缩时间的测定结果的图，所述畏缩时间显示给予戊四唑的小鼠的情境依赖性恐惧记忆的异常和通过给予本发明的治疗药而获得的恢复。

[图2]是显示下述实施例1中进行的、显示本发明的治疗药对自闭症的效果的3室实验的结果的图。a是3室实验的示意图。b是显示在各室内的逗留时间的测定结果的图，所述逗留时间显示通过给予红藻氨酸(Kainic acid)而产生的类自闭症行为异常和通过给予本发明的治疗药而获得的恢复。

[图3]是显示下述实施例1中进行的、在Tsc2突变小鼠海马初代培养神经元的树突棘中观察到的形态异常和本发明治疗药的效果的图。a是显示对野生型(WT)和Tsc2突变(Tsc2^+/-)海马初代培养神经元给予3天本发明的两种治疗药(洛那法尼和替吡法尼)，再通过GFP和vGlut1 (兴奋性突触的标志物)抗体进行染色的结果的图。b是显示Tsc2^+/-神经元的树突宽度的测定结果的图。c是同样地显示树突长度的测定结果的图。d是显示棘突触数的测定结果的图。e是显示棘突触的比例的测定结果的图。

[图4]是显示下述实施例2中进行的、显示洛那法尼对显示社交行为异常(自闭症)的小鼠的治疗效果的3室实验的结果的图。

具体实施方式

如上所述，本发明的治疗药含有选自下述的至少一种作为有效成分：替吡法尼(6-[(R)-氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)和洛那法尼((11R)-5,6-二氢-3,10-二溴-8-氯-11-[1-[1-氧代-2-(1-氨基甲酰基-4-哌啶基)乙基]-4-哌啶基]-11H-苯并[5,6]环庚并[1,2-b]吡啶、4-[2-[4-[(11R)-8-氯-3,10-二溴-6,11-二氢-5H-苯并[5,6]环庚并[1,2-b]吡啶-11-基]-1-哌啶基]-2-氧代乙基]-1-哌啶甲酰胺)。这些药剂本身是已知的，也在市售，因此可以利用市售品。这些药剂既可以单独使用，也可以将两者组合使用。

如下述实施例中具体记载的那样，上述有效成分对敲除TSC2基因而制作的结节性硬化症模型动物中的记忆障碍、或在给予痉挛诱发药的戊四唑而制作的癫痫诱发性的记忆障碍模型动物中显示出优异的治疗效果。另外，上述有效成分在给予癫痫诱发药的红藻氨酸而制作的自闭症模型动物中显示出优异的治疗效果。根据这些实验结果，确认到上述有效成分对智力障碍、特别是记忆障碍、尤其是由Tsc1基因和/或Tsc2基因的异常引起的记忆障碍、以及自闭症的治疗有效。

上述有效成分既可以进行口服给予，也可以通过皮下、皮内、肌肉内、静脉内、经肠、经皮、腹腔内、眼内等肠胃外途径进行给予。

上述有效成分的给予量根据患者的症状、年龄、体重等条件而适当设定，通常患者的每1kg体重、每天的给予量(在两者并用的情况下是指总计给予量)为75mg～200mg左右、特别是100mg～150mg左右。

上述有效成分可以通过常规的制剂方法制成片剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、糖浆等口服给予用剂型或注射剂、涂抹剂、贴剂、栓剂、滴眼剂等肠胃外给予用剂型进行给予。

以下，根据实施例来具体地说明本发明。不过，本发明不受下述实施例的限定。

实施例

实施例1

1. 方法

(1) 动物

Tsc2^+/-小鼠是按照已知的方法(Kobayashi, T.等人, Renal carcinogenesis,hepatic hemangiomatosis, and embryonic lethality caused by a germ-line Tsc2mutation in mice. Cancer Res, 1999. 59(6): 第 1206-11页)进行繁殖、交配而制作的。不同于结节性硬化症的记忆障碍模型小鼠是通过给予10次戊四唑(35 mg/kg, i.p.(腹腔内投与))来制作的，而显示社交行为异常的小鼠是在出生后第1周通过给予1次红藻氨酸(1.5 mg/kg, i.p.)来制作的。

(2) 情境依赖性恐惧辨别试验

通过情境依赖性恐惧辨别试验(Auerbach, B.D., E.K. Osterweil, and M.F. Bear,Mutations causing syndromic autism define an axis of synapticpathophysiology. Nature, 2011. 480(7375): 第63-8页.)，测定了小鼠的情境依赖性恐惧记忆。即，将小鼠放入施加足底电击(footshock，FS)的笼子内，在施加FS之后，第二天返回到相同笼子(已知条件(熟悉的条件，Familiar condition))中，测量了畏缩时间(冻结时间，Freeze time) (图1a)。为了研究替吡法尼或洛那法尼(以下，有时仅称作“活性成分”)的效果，对小鼠口服给予载体(Vehicle (媒介物)、羧甲基纤维素)和活性成分，6小时后施加FS，比较了第二天返回相同笼子时的畏缩时间。另外，作为对照实验，测量了在FS的第二天放入不同笼子(新颖条件(Novel condition) )内的情况下的畏缩时间(图1a)。

(3) 3室试验

通过3室试验研究了社交性互动。这是将房间隔成3个房间、且其间可以自由来往的实验装置，首先，在一个房间放置了装有小鼠的笼子(陌生(Stranger) 1小鼠)，在另一个房间放置了空笼子(图2a)。将受试小鼠放在中央的房间，测量了其在各个房间中逗留的时间(图中的室内逗留时间(s)：用秒表示)。接下来，将位于一个笼子内的小鼠转移到空笼子中(陌生1 小鼠)，在空出来的笼子内放入了新的小鼠(陌生2 小鼠) (图2a)。然后，测量并比较了受试小鼠在最初就存在的小鼠的房间(陌生1 室)内的行走时间、在新的小鼠所在的房间(陌生2 室)内的行走时间。

(4) 海马神经元的初代培养

自出生后0或第1天的Tsc2^+/-小鼠体内摘出海马，在含有0.25%胰蛋白酶的Hank’s缓冲液中、在37℃下反应了10分钟。洗涤之后，悬浮细胞，使用含有B27添加物的Neurobasal培养液在37℃、5% CO₂的条件下进行了培养。在固定的2天前向培养液中添加了载体(DMSO)、活性成分(2μM)。在基因强制表达中使用了Lipofectamine (脂质转染胺) 2000。

(5) 免疫细胞染色

用4%多聚甲醛固定了培养神经元。用含有10%山羊血清的缓冲液封闭已固定的神经元，使其与一次抗体进行了反应。而且，使用荧光二次抗体标记了目标蛋白。用Carl Zeiss公司制造的LSM780观察了已标记的神经元。

2. 结果

(1) 对由Tsc2基因异常引起的记忆障碍的效果

为了研究活性成分对智力障碍的效果，首先，使用显示情境依赖性恐惧记忆异常的Tsc2^+/-小鼠进行了实验。在FS的6小时前对Tsc2^+/-小鼠口服给予洛那法尼(40mg/kg)或替吡法尼(40mg/kg)，研究了情境依赖性恐惧记忆(图1a)。第2天，让小鼠返回到接受过FS的箱内，测定了畏缩时间。野生型(WT)的任一组均记忆了前1天的FS，显示出畏缩反应的增加，但Tsc2^+/-小鼠的载体给予组没有显示畏缩反应的增加，认为不记得施加了FS的箱(图1b)。然而，在给予了洛那法尼或替吡法尼的组中畏缩行为增加，记忆得以恢复(图1b)。即，可知通过给予一次的活性成分，结节性硬化症的记忆障碍有所改善。

(2) 对癫痫诱发性的记忆障碍的效果

为了研究活性成分对结节性硬化症的记忆障碍以外的记忆障碍是否有效，尝试了制作其他的记忆障碍小鼠。对小鼠给予10次痉挛诱发药的戊四唑，连续地引起了癫痫发作。在按照与上述相同的方式研究该小鼠的情境依赖性恐惧记忆时，可知显示出显著的记忆障碍。于是，还研究了活性成分对该小鼠的记忆障碍的效果。通过给予1次洛那法尼(40mg/kg,i.p.)，戊四唑诱发性的记忆障碍也有所改善(图1c)。由以上的结果可知：活性成分不仅对结节性硬化症、而且还对癫痫诱发性的记忆障碍具有改善作用。

(3) 对自闭症的效果

使用显示类自闭症行为异常的模型小鼠，研究了药物的效果(图2a)。为了制作显示社交行为异常的模型，对出生后第1周的小鼠注射红藻氨酸(1.5mg/kg)，之后养育2个月后进行了3室试验。在面对陌生1小鼠和陌生2小鼠时，野生型小鼠与陌生2亲近，但在新生仔期注射了红藻氨酸的小鼠中，在陌生1和陌生2的房间逗留时间上未观察到显著差异(图2b)。即，认为存在社交行为异常。于是，对该小鼠给予1次洛那法尼(40mg/kb, i.p.)，在进行3室试验时，陌生2的室内逗留时间(在室内度过的时间)显著变长，显示出正常的社交行为(图2b)。由以上结果可知：活性成分对结节性硬化症以外的社交行为异常(自闭症)也有改善作用。

(4) 对突触形成异常的效果

研究了活性成分对结节性硬化症模型的突触形成异常的效果。对来自Tsc2^+/-小鼠的海马神经元进行初代培养，将培养21天后的神经元形态与野生型进行了比较。在野生型中形成了典型的蘑菇型棘，相对于此，在Tsc2^+/-小鼠中没有形成树突棘，而是显示出称为丝状伪足的细长的未成熟形态(图3a-c)。另外，在通过对vGlut1的免疫染色研究是否制作了兴奋性突触时，在Tsc2^+/-小鼠的丝状伪足上没有形成突触(图3a, d)。另一方面，在树突上直接形成兴奋性突触，显示出轴突触形态(图3a, e)。于是，在这些Tsc2^+/-神经元的培养液中添加载体或活性成分(2μM)，在两天后进行固定后，并观察了形态。其结果，通过活性成分处理，显示出与野生型没有变化的棘形态，而且与棘一致，形成了vGlut1染色的棘突触(图3a-e)。由以上结果可知：在结节性硬化症中，通过给予活性成分，突触变得正常。

实施例2

1. 动物

为了获得显示社交行为异常的结节性硬化症模型，使星形胶质细胞特异性表达Cre的GFAP-Cr与Tsc1^fl/fl小鼠交配，制作了GFAP-Cre; Tsc1^fl/fl(GFAP-Tsc1 cKO)小鼠。即，首先制作了显示社交性行为异常的结节性硬化症模型小鼠。使各种Cre驱动小鼠与Tsc1^fl/fl小鼠进行了交配，结果可知：与星形胶质细胞特异性表达Cre的GFAP-Cre交配的GFAP-Cre;Tsc1^fl/fl(GFAP-Tsc1 cKO)小鼠显示出社交行为异常。

2. 药物的调制和给予

将洛那法尼和替吡法尼制成4mg/ml的悬浮液(溶剂为1w/v% CMC、0.9w/v% NaCl、5v/v%DMSO)，口服给予使达到40mg/kg。将戊四唑(PTZ)调制成2mg/ml的溶液(溶剂为0.9w/v%NaCl)，进行了腹腔内给予。

3. 结果

按照与实施例1同样的方式进行了3室试验。在3室试验中，若将野生型小鼠放在陌生1小鼠与陌生2小鼠之间，则其更长久地与陌生2亲近，但在GFAP-Tsc1 cKO小鼠中，在陌生1和陌生2的房间逗留时间上未观察到显著差别，观察到了社交行为的异常(图4)。

于是，对该小鼠口服给予1次洛那法尼(40mg/kg, i.p.)，在进行3室试验时，陌生2的房间逗留时间显著地变长，社交行为变得正常(图4)。