阅读说明：本技术 人参皂苷m1用于治疗亨丁顿舞蹈症的用途 (Use of ginsenoside M1 for treating Huntington's chorea ) 是由 理筱龙 花国峰 理昱杰 于 2019-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开人参皂苷M1用于制造供治疗亨丁顿舞蹈症(HD)的药物的用途；以及用于治疗HD的医药组合物,包括人参皂苷M1及医药上可接受的载体。(The invention discloses the use of ginsenoside M1 in the manufacture of a medicament for the treatment of Huntington's Disease (HD); and a pharmaceutical composition for treating HD, comprising ginsenoside M1 and a pharmaceutically acceptable carrier.)

人参皂苷M1用于治疗亨丁顿舞蹈症的用途

相关申请

本申请主张于2018年4月23日提交的美国临时申请号62/661,244的利益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明关于一种关于人参皂苷M1用于治疗亨丁顿舞蹈症(HD)的新用途。

背景技术

丁顿舞蹈症(HD)是由亨丁顿基因中异常的CAG三核苷酸重复扩增所引起的一种体染色体显性遗传神经退化性疾病。该疾病在临床上表现为渐进式不自主运动障碍、痴呆及最终死亡。至今为止，目前尚无有效的HD治疗方法。

已知人参的主要活性成分人参皂苷具有多种药理活性，例如抗肿瘤、抗疲劳、抗过敏及抗氧化活性。人参皂苷具有基本结构，由具有17个碳原子排列成四环的性脂烷(gonane)类固醇核组成。人参皂苷在体内金属化，而最近的一些研究表明，人参皂苷代谢物，而不是天然存在的人参皂苷，很容易被人体吸收并充当活性成分。一些人参皂苷已被报导对某些神经退化性疾病和衰老疾病具有益效用。其中，人参皂苷M1，也称为化合物K(CK)，经由人类肠道细菌的绞股蓝皂苷途径(gypenoside pathway)，人参皂苷M1已知为原人参二醇型(protopanaxadiol-type)人参皂苷的一种代谢产物。迄今为止，并无先前技术参考文献报导了人参皂苷M1在HD治疗中的效用

发明内容

在本发明中，不可预期地发现人参皂苷M1能有效减轻亨丁顿舞蹈症(HD)的一或多种症状。因此，本发明提供了一种治疗个体HD的新方法。

因此，本发明提供一种于有需要的个体治疗亨丁顿舞蹈症(HD)的方法，包含向个体投予有效量的人参皂苷M1。

在一些具体实施例中，该个体表现突变HTT蛋白，特别是突变HTT蛋白在个体的神经元中累积。

在一些具体实施例中，人参皂苷M1以一含量投予使有效于(i)降低活性含氧物(ROS)的形成及/或(ii)降低细胞毒性，特别是在个体的神经元中，及/或(iii)改善运动协调性，(iv)延长寿命，及/或(v)降低个体的纹状体中mHtt聚集体的形成。

在一些具体实施例中，人参皂苷M1通过肠胃外或肠内途径投予。

下面的描述中阐述了本发明的一或多个具体实施例的细节。由以下对若干具体实施例的详细描述以及由所附申请专利范围，本发明的其他特征或优点将显而易见。

附图说明

为了说明本发明的目的，在图式中显示出具体实施例。然而应理解，本发明不限于所示的较佳具体实施例。在图式中：

图1A-1B显示人参皂苷M1显著降低mHtt表现细胞中的细胞毒性。(图1A)用30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdhQ7和STHdhQ109细胞24小时。通过MTT还原测定法定量STHdhQ7和STHdhQ109细胞的存活率。(图1B)用1-30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdhQ109细胞24小时。通过MTT还原测定法定量STHdhQ109细胞的存活率。结果表示为一式三份样品的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdhQ7和STHdhQ109细胞之间(图1A)，或与未处理(载体处理的)STHdhQ7细胞比较(图1B)。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdhQ109细胞相比。

图2显示人参皂苷M1显著降低STHdhQ109细胞中的ROS的产生。在10μM细胞内ROS指示剂H₂DCFDA存在下，用1-30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdh^Q109细胞1小时。通过使用荧光板读数器侦测荧光强度来测量细胞ROS含量。结果表示为一式三份样品的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

图3显示人参皂苷M1显著降低STHdhQ109细胞中AMPK的磷酸化程度。用10或30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过西方墨点法测量AMPK的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三个不同的实验，直方图显示定量表示为这三个实验的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

图4显示人参皂苷M1显著降低STHdhQ109细胞中ATM的磷酸化程度。用10或30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过西方墨点法测量ATM的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三个不同的实验，直方图显示定量表示为这三个实验的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

图5显示人参皂苷M1显著降低STHdhQ109细胞中γH2AX的表现量。用10或30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过西方墨点法测量γH2AX的表现量。西方墨点法结果表示三个不同的实验，直方图显示定量表示为这三个实验的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

图6显示人参皂苷M1显著降低STHdhQ109细胞中p53的磷酸化程度。用10或30μM人参皂苷M1或载体(0.1％DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过西方墨点法测量p53的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三个不同的实验，直方图显示定量表示为这三个实验的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

图7显示口服投予人参皂苷M1显著增加HD疾病小鼠的运动协调性。R6/2HD疾病小鼠从7周龄开始每天口服投予人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg)或载体持续4周。野生型健康对照小鼠每日口服投予载体。使用旋转棒装置测定来评估运动协调性。结果表示为平均值±SEM。多组通过单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。^ap<0.05：在WT和R6/2-载体小鼠之间。^bp<0.05：与R6/2-载体小鼠相比。

图8显示口服投予人参皂苷M1显著延长HD疾病小鼠的寿命。R6/2HD疾病小鼠从7周龄开始每天口服投予人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg)或载体持续4周。野生型健康对照小鼠每日口服投予载体。测定小鼠的寿命。结果表示为平均值±SEM。多组通过单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。^ap<0.05：在WT和R6/2-载体小鼠之间。^bp<0.05：与R6/2-载体小鼠相比。

图9显示口服投予人参皂苷M1减少HD疾病小鼠的纹状体中mHtt聚集体的形成。野生型健康对照小鼠和R6/2HD疾病小鼠从7周龄开始每天口服投予人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg)或载体持续4周。通过滤器延迟测定法(filter retardation assay)分析在纹状体裂解物中mHtt聚集物的量。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有归属于它们的含义。

本文使用的冠词“一”和“一个”指的是冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一元素”表示一个元素或多于一个元素。

“包含(comprise)”或“包含(comprising)”等词通常以包括(include/including)的含义使用，其意味着允许存在一种或多种特征、成分或要素。“包含(comprise)”或“包含(comprising)”等词包括“组成了”或“由......组成”等词。

亨丁顿舞蹈症(HD)是一种体染色体显性遗传神经退化性疾病，临床表现为渐进式不自主运动障碍、痴呆及最终死亡[1]。其是由亨丁顿(Htt)基因的外显子1中的CAG三核苷酸扩增所引起，该基因位于人类染色体4的短臂(4p63)上。当CAG重复数超过36时，含有Htt蛋白[突变体Htt(mHtt)]的转译聚麸酰胺酸(polyQ)会干扰许多细胞蛋白的正常功能，从而危及重要的细胞机制[2]。polyQ扩增突变体Htt的异常累积也导致累积形成于神经元、星形胶质细胞、耳蜗神经元和许多不同类型外周细胞的细胞核中[3]。已知突变体Htt会促进蛋白质错误折叠，从而抑制蛋白酶体活性的活性、使转录失调、损害突触功能、升高氧化压力、使轴突退化，最终导致神经退化及神经元损失[3]。麸胺酸从皮质-纹状体末端的广泛释放及神经元存活的损伤被认为是纹状体神经退化的原因，其引发HD的初始症状。黑质纹状体(nigro-striatal)路径的功能障碍也有助于纹状体的神经兴奋性毒性。同时，由突变Htt所诱导的神经元退化主要发生在非纹状体大脑区域(例如皮质和黑质)[4,5]，并引起运动障碍、痴呆及最终死亡[1,6]。除神经元失调外，代谢异常是HD的另一个重要标志[7]。在HD的几种老鼠模型和HD患者中观察到高血糖和异常的葡萄糖代谢[8]。其他几种代谢途径(如胆固醇生物合成和尿素循环代谢)中的缺陷也被充分记载[9,10]。已经提出能量代谢不足是许多神经障碍的重要致病因素。最近，能量不足成为HD的重要致病因素[7]。高血糖和降低的胰岛素已被报导在在几种转基因小鼠模型中[8]。在几种HD老鼠模型以及HD患者中也已观察到与葡萄糖代谢相关的蛋白质的异常表现[8]。

AMP活化蛋白酶(AMPK)是主要的能量传感器，其调节下游靶基因数组，并通过活化能量产生和抑制许多不同组织中的能量消耗来维持细胞能量稳态[11]。AMPK是由α、β和γ次单位组成的异源三聚体错合物。α和β次单位各自由两个不同的基因(α1和α2或β1和β2)编码，而γ次单位由3个基因(γ1、γ2和γ3)编码[12]。并且AMPK可被几种上游酶[钙调蛋白依赖性蛋白酶(CaMKK)和LKB1]活化，经由α次单位的催化结构域内的苏胺酸残基172的磷酸化[13]。其他酶[包括cAMP依赖性酶(PKA)和Ca²⁺/钙调蛋白依赖性蛋白酶II(CaMKII)]也显示出调节AMPK的活性[14,15]。LKB1对AMPK的活化主要是由AMP/ATP细胞比的增加所引发[16]。相反，CaMKK和CaMK II在刺激过程中活化AMPK，从而提高细胞内钙的水平[17]。AMPK的α次单位是催化次单位，并且具有至少两种不同的同种型(isoform)(α1和α2)。AMPK-α1在整个身体中广泛表现，α2次单位主要在肝脏、心脏和骨骼肌中表现[18]。AMPK的基质包括能量代谢中的许多蛋白质和参与许多不同机器中的蛋白质[19]。例如，发现AMPK活化以提高ROS的形成，并随后引起粒线体损伤和凋亡[20,21]。AMPK亦磷酸化了多种涉及其他细胞功能的蛋白质，如转录和分泌[19,22]。AMPK活化在各种细胞中的促细胞凋亡作用包括诱导压力传讯(stress signalling)(包括p53、JNK、凋亡蛋白酶-3、p38和mTOR)及抑制脂肪酸合成酶和蛋白质合成[23-26]。此外，已发现AMPK经由PI3K(磷脂酸肌醇3-酶)路径抑制轴突起始和神经元极化。AMPK对运动蛋白(Kif5)的磷酸化破坏了Kif5与PI3K的结合，阻止了PI3向轴突的靶向，从而抑制了轴突生长和神经元极化[27]。

在脑中，AMPK存在于下视丘神经元中并且在食物摄入的调节中起关键作用[28]。有趣的是，AMPK的功能和调节及其在神经退化性疾病中的作用引起了很多关注。例如，在有缺血、HD和阿兹海默症(AD)的神经元中发现了较高的AMPK活性。在中风患者的大脑中，AMPK在皮质和海马神经元中被活化。AMPK的抑制减少了现有损伤[29-31]。缺少AMPK-α2在缺血时脑中具有神经保护作用[32]。在AD患者的神经元中也发现了较高的AMPK活性。陈等人最近的一项研究报告证明，二甲双胍(metformin)(AMPK的活化剂)经由上调AMPK依赖性路径中的β-分泌酶(BACE1)来增强类淀粉胜肽的生物合成，这潜在可能恶化AD的进展[33]。AMPK的抑制显著压制二甲双胍对Aβ生成和BACE1转录的影响。桑顿等人已证明AMPK是tau激酶，AMPK在微管结合结构域中诱导tau磷酸化。此外，AMPK诱导的tau磷酸化抑制了tau与微管的结合[34]。这些作者还发现，对应于Aβ1-42，AMPK-α1而非AMPK-α2被显著活化[34]。Vingtdeux等人证明磷酸化的AMPK与tau共定位，tau在AD脑中在Ser²⁰²或Ser³⁹⁶磷酸化[35]。此外，暴露于类淀粉蛋白β肽(Aβs，AD中老年斑的关键成分)导致AMPK的活化，其在Thr²³¹和Ser^396/404处磷酸化tau，且可能促成AD tau病变[34,35]。这些观察表明AMPK活化在AD中的病理角色，因为tau的过度磷酸化是AD的标志。一致地，AMPK的抑制会压制Aβ和tau磷酸化的产生[33,36]。这些研究表明，AD中AMPK的活化可能有助于AD中的神经退化。

AMPK在HD发病机制中的作用和调节被积极研究。我们以前曾报导AMPK(AMPK-α1)的α1同种型的活化发生在患有HD的人类和老鼠的纹状体神经元中[31,37]。纹状体中AMPK的过度活化导致脑萎缩、促进神经元损失、并在HD的转基因老鼠模型(R6/2)中增加Htt聚集体的形成[37]。AMPK-α1的这种核累积是活性依赖性的。预防核转位或AMPK-α1的去活化改善了由突变体Htt引起的细胞死亡。在纹状体细胞核中异常活化AMPK-α1代表由突变体Htt诱导的新毒性路径。使用腺苷2A受体(A_2AR)选择性促效剂(CGS21680)经由cAMP/PKA依赖性路径阻断AMPK-α1的活化和核富集与脑萎缩的挽救有关[31,37]，进一步加强AMPK-α1参与纹状体HD发病机制。

ATM是大的(～370-kDa)丝胺酸/苏胺酸蛋白酶。ATM以MRN(Mre11-Rad50-Nbs1)依赖性方式被DNA损伤所活化。尽管这些蛋白质的功能已被充分记录，但控制细胞能量稳态和详细分子机制的功能在很大程度上未被描述，这极大地阻碍了针对脑能量缺乏的治疗发展。在过去几年中，已证明了氧化压力和DNA损伤的相关性。经由半胱胺酸残基的氧化，ATM被氧化压力所诱导[38]。此外，氧化压力通过HD中DNA-PK错合物的损伤而诱导DNA修复功能障碍。43Q-GFP融合蛋白的过度表现被发现会增加ROS产生和ATM活性，并随后引起PC12细胞中ATM依赖性DNA损伤[39]。ATM已被发现涉及AMPK的磷酸化，表明AMPK可能在对于DNA损伤或DNA修复中起关键作用。IGF-1经由ATM依赖性和LKB1非依赖性方式而诱导人纤维母细胞和老鼠胚胎纤维母细胞中的AMPK磷酸化[40]。AICAR或IR诱导AMPK的活化经由HeLa细胞和癌细胞中的ATM依赖性路径[41,42]。傅等人进一步报导，灭必治(etoposide)对ATM的活化通过磷酸化/活化AMPK而诱导ROS产生和粒线体生物合成。ROS可能经由DNA损伤/ATM/AMPK路径促进粒线体生物合成[43]。

在本发明中，不可预期地发现人参皂苷M1有效缓解HD的一或多种症状。特别是，证明了人参皂苷M1可降低mHtt表现细胞中的细胞毒性、STHdh^Q109细胞中的活性含氧物(ROS)的形成、STHdh^Q109细胞中AMPK的磷酸化程度、STHdh^Q109细胞中ATM的磷酸化程度、STHdh^Q109细胞中γH2AX的表现量、以及STHdh^Q109细胞中p53的磷酸化程度。还证明在HD(R6/2小鼠)的转基因老鼠模型中，口服投予人参皂苷M1可减少疾病进展、改善运动协调性，延长寿命并减少患病动物的纹状体中mHtt聚集体的形成。

因此，本发明提供了一种于有需要的个体治疗或预防亨丁顿舞蹈症(HD)的方法，包含向个体投予有效量的人参皂苷M1。

人参皂苷M1，也称为化合物K(CK)、20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇，为本领域已知的皂苷代谢物之一。人参皂苷M1的化学结构如下：

经由人类肠道细菌的绞股蓝皂苷途径，人参皂苷M1已知为原人参二醇型人参皂苷的一种代谢产物。摄入后可在血液或尿液中发现人参皂苷M1。人参皂苷M1可通过本领域已知的方法通过真菌发酵从人参植物制备，例如中国台湾专利申请号094116005(I280982)和美国专利号7,932,057，其全部内容通过引用并入本文。在某些具体实施例中，用于制备人参皂苷M1的人参植物包括五加科(Araliaceae)，人参(Panax)属，例如，人参属(P.ginseng)及假人参属(P.pseudo-ginseng)(也称为三七)。通常，制备人参皂苷M1的方法包括以下步骤：(a)提供人参植物材料(例如叶子或茎)的粉末；(b)提供用于发酵人参植物材料的真菌，其中发酵温度范围为20-50℃，发酵湿度范围为70-100％，pH值范围为4.0-6.0，发酵周期范围为5-15天；(c)萃取并收集发酵产物；以及(d)从发酵产物中分离20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇。

当在本发明中将人参皂苷M1描述为“分离的”或“纯化的”时，应理解为不是绝对地分离或纯化，而是相对地分离或纯化。例如，纯化的人参皂苷M1是指与其天然存在的形式相比更纯化的人参皂苷。在一具体实施例中，包含纯化的人参皂苷M1的制剂可包含总制剂的大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％或100％(w/w)的量的的人参皂苷M1。应理解，当在本文中使用一定数量以显示比率或剂量时，该数量通常包括正负10％的范围，或更特定而言，该数量的正负5％的范围。

如本文所用，“亨丁顿蛋白(huntingtin)”、“亨丁顿蛋白(huntingtin protein)”或“HTT”等词是指由亨丁顿基因，也称为HTT基因或HD基因，所编码的亨丁顿蛋白。由于在第一外显子中编码麸酰胺酸的可变量目的CAG密码子重复，此基因存在多型性。在其野生型中，这种蛋白质含有6至35个麸酰胺酸残基，不会引起亨丁顿舞蹈症。在受HD影响的个体中，这种蛋白质含有超过35个麸酰胺酸残基，并被命名为polyQ-htt，这是一种导致亨丁顿舞蹈症的突变形式。野生型htt的质量约为350kD，大小约为3144个胺基酸。除非另有说明，否则本文所用的”htt”一词是指htt蛋白的野生型，亦即，是含有少于36个麸酰胺酸残基的聚麸酰胺酸束的htt。与非突变的野生型HTT蛋白相比，突变HTT蛋白具有异常的功能及/或活性或额外的活性或功能(例如，聚集、与转录因子的聚集等)。

本文使用的“个体”或“受试者”等词包括人与非人动物，例如宠物(例如狗、猫等)、农畜(如牛、羊、猪，马等)、或实验动物(如大鼠，小鼠，天竺鼠等)。

本文所用的“治疗”一词是指施用或投予包括一或多种活性剂的组合物给患有失调、失调的症状或病症、失调的进展的个体，目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、增进或影响失调、失调的症状或病症、由失调引起的残疾、或失调或其症状或病症的进展。如本文所用的“预防”或“防止”等词是指向易患有或易感染失调或其症状或病症的个体，施用或投予包括一或多种活性剂的组合物，因此涉及预防失调或其症状或病症或其根本原因的发生。

本文使用的“有效量”一词是指对受治疗的个体赋予所需治疗效果的活性成分的量。例如，用于治疗或预防HD的有效量可为能够禁止、改善、缓解，减轻或预防一或多种症状或病症或其进展的量。在一些具体实施例中，如本文所用的有效量可为有效降低HD个体的神经元细胞(尤其是突变的神经元)中的活性含氧物(ROS)形成及细胞毒性的量。在一些具体实施例中，本文使用的有效量可为有效改善运动协调性、延长寿命和减少HD个体的纹状体中mHtt聚集体形成的量。

治疗有效量可根据各种原因而改变，例如投予途径和频率、接受该药物的个体的体重和种类、以及投予目的。本领域技术人员可基于本文的揭示、已建立的方法、及其自身经验确定每种情况下的剂量。例如，在某些具体实施例中，用于本发明的人参皂苷M1的口服剂量为每天10至1000mg/kg。在一些实例中，本发明中使用的人参皂苷M1的口服剂量为每日100至300mg/kg、每日50至150mg/kg、每日25至100mg/kg、每日10至50mg/kg，或每日5至30mg/kg。此外，在本发明的一些具体实施例中，定期地投予人参皂苷M1一段时间，例如，每日投予至少15天、一个月或两个月或更长时间。

根据本发明，人参皂苷M1可用作治疗或预防亨丁顿舞蹈症(HD)的活性成分。在一具体实施例中，治疗有效量的活性成分可与医药上可接受的载体一起配制成适当形式的医药组合物，以达递送和吸收的目的。取决于投予模式，本发明的医药组合物较佳包含约0.1％重量至约100％重量的活性成分，其中重量百分比是基于整个组合物的重量而计算。

如本文所用，“医药上可接受的”意指载体与组合物中的活性成分兼容，并且较佳地可稳定该活性成分并且对接受治疗的个体来说是安全的。该载体可为活性成分的稀释剂、载体、赋形剂或基质。合适的赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶(tragacanth gum)、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。该组合物可另外包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂，如甲基和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；及调味剂。本发明的组合物可在投予患者后提供活性成分快速、持续或延迟释放的效果。

根据本发明，该组合物的形式可为片剂、丸剂、粉末、锭剂、小包、药片、酏剂、悬浮液、洗剂、溶液、糖浆、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射液和包装粉末。

本发明的组合物可经由任何生理学上可接受的途径递送，例如口服、肠胃外(例如肌肉内、静脉内、皮下和腹膜内)、透皮、栓剂和鼻内方法。关于肠胃外投予，较佳以无菌水溶液的形式使用，其可包含足以使溶液与血液等渗透压的其他物质，例如盐或葡萄糖。根据需要，水溶液可适当地缓冲(较佳pH值为3至9)。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可用本领域技术人员熟知的标准药理学技术完成，并且不需要额外的创造性劳动。

根据本发明，人参皂苷M1或包含人参皂苷M1作为活性成分的组合物可用于治疗患有亨丁顿舞蹈症(HD)或有亨丁顿舞蹈症(HD)风险的个体。特定而言，人参皂苷M1或包含人参皂苷M1作为活性成分的组合物可投予患有HD的个体或有得到HD风险的个体，以防止疾病的发生或改善症状或推迟症状的恶化。

通过以下实施例进一步说明本发明，提供这些实施例是为了说明的目的而非限制。根据本揭示，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范畴的情况下，可对所揭示的具体实施例进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。

实施例

通过本领域已知的方法制备人参皂苷M1，也称为化合物K(CK)、20-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参二醇(以下称为LCHK168)，例如在中国台湾专利申请号094116005(I280982)及美国专利号7,932,057中描述的。

在本研究中，我们已研究人参皂苷M1在体外和体内的功效和相关机制。我们证明人参皂苷M1降低mHtt表现细胞的细胞毒性、降低STHdh^Q109细胞中活性含氧物(ROS)的形成、降低STHdh^Q109细胞中AMPK的磷酸化程度、降低STHdh^Q109细胞中ATM的磷酸化程度、降低STHdh^Q109细胞中γH2AX的表现量，以及降低STHdh^Q109细胞中p53的磷酸化程度。此外，我们证明口服投予人参皂苷M1减少了HD(R6/2小鼠)的转基因老鼠模型的疾病进展、延长了HD(R6/2小鼠)的转基因老鼠模型的寿命、并减少了在HD疾病小鼠(R6/2小鼠)的纹状体中mHtt聚集体形成。

实施例1：人参皂苷M1显著降低mHtt表现细胞中的细胞毒性

条件地永生化的野生型STHdh^Q7纹状体神经元前驱细胞表现内源性正常的htt(称为野生型纹状体细胞)，来自敲入小鼠的同型合子STHdh^Q109的同型合子突变体STHdh^Q109纹状体神经元前驱细胞，其表现出具有109个麸酰胺酸的突变体htt(称为突变体纹状体细胞)。STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞是Elena Cattaneo博士和Marta Valenza(意大利米兰大学药理部门和干细胞研究中心)的慷慨捐赠。将这些细胞维持在33℃的培养室中，在杜尔贝科(Dulbecco)改良的Eagle培养基(DMEM)中补充有10％胎牛血清(FBS)。

用30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过MTT还原测定法定量STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞死亡。对于MTT还原测定，将3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)以50mg/ml溶解在二甲基亚砜(DMSO)中作为100倍储备溶液。在实验结束时，将细胞在含有0.5mg/ml MTT的培养基中于37℃培育2小时。然后用DMSO替换培养基以溶解MTT甲

沉淀，然后使用微板读取仪(OPTImax可调板读取仪，MolecularDevice，Sunnyvale，CA，USA)在570nm处测量吸亮度。将指定细胞的存活率标准化为未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞的存活率。如图1A所示，未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞的存活率低于未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞的存活率。值得注意的是，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，STHdh^Q109细胞与30μM人参皂苷M1的培育显著提高了存活率。为了证实人参皂苷M1的细胞保护作用，用1、10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q109细胞24小时。如图1B所示，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，10和30μM人参皂苷M1显著提高了STHdh^Q109细胞的存活率。结果表示为一式三份样品的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间(图2A)，或与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞比较(图2B)。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例2：人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中的活性含氧物(ROS)产生

氧化压力是触发STHdh^Q109细胞中细胞死亡的重要事件之一。为了研究人参皂苷M1是否通过降低氧化压力来抑制STHdh^Q109细胞的细胞死亡，在10μM细胞内ROS指示剂荧光探针2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H₂DCFDA；Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oregon，USA)存在下，用1、10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q109细胞1小时。通过使用荧光板读取仪(Fluoroskan Ascent；Thermo Electron Corporation，Woburn，MA，USA)侦测荧光强度(激发/发射：488nm/510nm)来测量细胞ROS含量。如图2所示，10和30μM人参皂苷M1显著降低了ROS产生。结果表示为一式三份样品的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例3：人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中AMPK的磷酸化程度

AMPK的活化促进HD的发病机制[37]。为了研究人参皂苷M1是否抑制AMPK活化，用10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。通过西方墨点法而测量AMPK的磷酸化程度。如图3所示，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞中AMPK的磷酸化程度显著增加。值得注意的是，与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比，10和30μM人参皂苷M1显著降低了STHdh^Q109细胞中AMPK的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三个不同的实验，直方图显示定量表示为这三个实验的平均值±SEM。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例4：人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中ATM的磷酸化程度

ATM受DNA损伤所活化，并在AMPK的磷酸化中起重要作用。为了研究人参皂苷M1是否抑制ATM活化，用10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。ATM的磷酸化程度通过西方墨点法而测量。如图4所示，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞中ATM的磷酸化水平显著增加。值得注意的是，与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比，10和30μM人参皂苷M1显著降低了STHdh^Q109细胞中ATM的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三种不同的实验，直方图显示定量表示为这三次实验的平均值±SD。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例5：人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中γH2AX的表现量

现已知ATM通过活化γH2AX来调节DNA修复。为了研究人参皂苷M1是否抑制γH2AX的表现量，用10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。γH2AX的表现量通过西方墨点法而测量。如图5所示，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞中γH2AX的表现量显著增加。值得注意的是，与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比，10和30μM人参皂苷M1显著降低了STHdh^Q109细胞中γH2AX的表现量。西方墨点法结果表示三种不同的实验，直方图显示定量表示为这三次实验的平均值±SD。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例6：人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中p53的磷酸化程度

p53在细胞周期和细胞凋亡的调节中起作用。p53因DNA损伤和氧化压力而被活化。为了研究人参皂苷M1是否抑制p53的磷酸化程度，用10和30μM人参皂苷M1或载体(DMSO)处理STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞24小时。p53的磷酸化程度通过西方墨点法而测量。如图6所示，与未处理(载体处理的)STHdh^Q7细胞相比，未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞中p53的磷酸化程度显著增加。值得注意的是，与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比，10和30μM人参皂苷M1显著降低STHdh^Q109细胞中p53的磷酸化程度。西方墨点法结果表示三种不同的实验，直方图显示定量表示为这三次实验的平均值±SD。多组将使用单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定(Student-Newman-Keuls test)而进行分析。p值<0.05将被认为是显著的。^ap<0.05：STHdh^Q7和STHdh^Q109细胞之间。^bp<0.05：与未处理(载体处理的)STHdh^Q109细胞相比。

实施例7：口服投予人参皂苷M1显著降低HD的转基因老鼠模型(R6/2小鼠)的疾病进展

从7周龄开始，每天用人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg，口服投予)或载体治疗小鼠4周。使用旋转棒装置测定(UGO BASILE，Comerio，Italy)在2分钟期间的恒定速度(12rpm)下评估运动协调性。如图7所示，与野生型小鼠相比，HD疾病小鼠(R6/2)中的运动协调性显著丧失。口服投予人参皂苷M1显著增加HD疾病小鼠的运动协调性。结果表示为平均值±SEM。多组通过单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。^ap<0.05：在WT和R6/2-载体小鼠之间。^bp<0.05：与R6/2-载体小鼠相比。

实施例8：口服投予人参皂苷M1显著延长HD的转基因老鼠模型(R6/2小鼠)的寿命

从7周龄开始，每天用人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg，口服投予)或载体治疗小鼠4周，并测定小鼠的寿命。如图8所示，M1的口服投予显著延长了HD疾病小鼠(R6/2)的寿命。结果表示为平均值±SEM。多组通过单因子变异数分析(ANOVA)接着是事后的学生-纽曼-科尔斯检定而进行分析。^ap<0.05：在WT和R6/2-载体小鼠之间。^bp<0.05：与R6/2-载体小鼠相比。

实施例9：口服投予人参皂苷M1减少了HD疾病小鼠(R6/2小鼠)的纹状体中mHtt聚集体的形成

从7周龄开始，每天用人参皂苷M1(以体重计的30mg/kg，口服投予)或载体治疗小鼠4周。通过滤器延迟测定法分析纹状体裂解物中mHtt聚集体的量。将脑组织在冰冷的TNE缓冲液中悬浮并均匀化，与2％SDS混合。首先使样品在slot-blot manifold(Bio-Rad，Irvine，CA，USA)中通过OE66膜过滤器(0.2mm孔径；Whatman Schleicher和Schuell，Middlesex，UK)。使用抗Htt抗体而侦测保留在滤膜上的不溶性聚集体。如图9所示，与野生型小鼠相比，HD疾病小鼠(R6/2小鼠)的纹状体中mHtt聚集体形成显著增加。值得注意的是，口服投予人参皂苷M1减少了HD疾病小鼠(R6/2小鼠)的纹状体中mHtt聚集体的形成。

据信，本发明所属领域的普通技术人员可基于本文的描述将本发明利用到其最广泛的范畴，而无需进一步说明。因此，所提供的描述及申请专利范围应被理解为说明性目的而不是以任何方式限制本发明的范畴。

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