用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法
阅读说明：本技术 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法 (Composition for preparing tagatose and method for preparing tagatose using the same ) 是由 梁成才 赵显国 李英美 金成俌 于 2018-03-30 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种包含果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的用于制备塔格糖的组合物,以及利用其制备塔格糖的方法。(The present invention provides a composition for manufacturing tagatose comprising fructose-6-phosphate-4-epimerase, and a method for manufacturing tagatose using the same.)
技术领域
本发明涉及一种包含果糖-6-磷酸4-差向异构酶的用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物，以及利用其制备塔格糖的方法。
背景技术
常规的塔格糖制备方法包括使用半乳糖作为主要原料的化学方法(催化反应)和生物方法(异构化酶反应)(参见韩国专利号10-0964091)。然而，在已知的制备方法中，作为主要原料的半乳糖的基础原料为乳糖，而乳糖的价格不稳定，其取决于全球市场上生乳和乳糖的产量、供应和需求量等。因此，其稳定供应受到限制。为了克服常规的塔格糖制备方法中的此种问题，已有报告利用己糖醛酸C4-差向异构酶(hexuronate C4-epimerase)从低价且供应稳定的果糖(D-fructose)制备塔格糖的方法(2011.Appl BiochemBiotechnol.163:444-451；韩国专利号10-1550796)，但是其存在异构化反应的转化率(conversion ratio)较低的局限。
已知塔格糖-二磷酸醛缩酶(tagatose-bisphosphate aldolase:EC 4.1.2.40)可如下述[反应式1]所示，以D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose1,6-bisphosphate)为底物产生磷酸甘油酮(glycerone phosphate)和D-甘油醛3-二磷酸(D-glyceraldehyde 3-diphosphate)，并参与半乳糖代谢。然而，并无关于所述塔格糖-二磷酸醛缩酶是否具有制备将果糖-6-磷酸转化成塔格糖-6-磷酸的活性的研究。
[反应式1]D-塔格糖1,6-二磷酸<＝>磷酸甘油酮+D-甘油醛3-二磷酸
在此背景下，本发明的发明人进行了广泛的研究以开发可用于制备塔格糖的酶，结果，他们发现塔格糖-二磷酸醛缩酶(EC 4.1.2.40)具有将葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)转化为塔格糖-6-磷酸的功能，从而完成本发明。
因此，可以葡萄糖或淀粉为原料，依次制备葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate)，然后利用本发明的塔格糖-二磷酸醛缩酶将葡萄糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸(tagatose-6-phosphate)，利用进行不可逆的反应路径的塔格糖-6-磷酸磷酸酶(tagatose-6-phosphate phosphatase)制备塔格糖，并且可显著提高自葡萄糖或淀粉向塔格糖的转化率。
发明内容
本发明的一目的在于提供一种用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物；以及塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。
本发明的另一目的在于提供一种制备塔格糖的方法，其包括使果糖-6-磷酸与塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖-6-磷酸转化成塔格糖-6-磷酸，其中所述方法可进一步包括使塔格糖-6-磷酸与塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖-6-磷酸转化为塔格糖。
本发明的其他目的和优势将借由以下详细说明和随附的权利要求与附图进行详细阐明。本说明书中未描述的内容可由本领域或相似领域的技术人员充分认知、推导，因而省略其说明。
附图说明
图1a-1d为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中的塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E和CJ_LP_F6P4E)具有果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的活性。
图2a和2b为HPLC层析结果，显示在本发明一实施方案中，用塔格糖-二磷酸醛缩酶(CJ_KO_F6P4E和CJ_RP_F6P4E)和塔格糖-6-磷酸磷酸酶(CJ_T4)处理塔格糖-6-磷酸，将果糖-6-磷酸转化为塔格糖。
图3为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中的酶T4具有塔格糖-6-磷酸磷酸酶的活性。
图4为蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果，以分析本发明一实施方案中用于自淀粉、蔗糖或葡萄糖制备塔格糖的反应路径中的酶的分子量，其中M代表蛋白大小标准品(sizemarker，Bio-RAD，美国)。
图5为HPLC层析结果，显示本发明一实施方案中制备的酶TD1(CJ_TD1_F6P4E)具有果糖-6-磷酸4-差向异构酶的活性。
图6为HPLC层析结果，显示当同时添加参与自麦芽糊精制备塔格糖的反应路径的所有酶时，由复合酶反应生成塔格糖，其中将TD1(CJ_TD1_F6P4E)用作塔格糖-二磷酸醛缩酶。
具体实施方式
以下具体地对本发明的内容进行说明。此外，本发明中公开的各项说明和实施方式中的共通事项均可应用到其他说明和实施方式。另外，本发明中公开的各种元素的组合均落入本发明的范围。而且，本发明的范围不限制于以下具体的描述。
为达到本发明的一目的，本发明在一方面提供一种用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物。
已知塔格糖-二磷酸醛缩酶(tagatose-bisphosphate aldolase:EC 4.1.2.40)可以D-塔格糖1,6-二磷酸(D-tagatose 1,6-bisphosphate)为底物产生磷酸甘油酮(glycerone phosphate)和D-甘油醛3-二磷酸(D-glyceraldehyde3-diphosphate)，并参与半乳糖代谢。例如，所述塔格糖-二磷酸醛缩酶没有任何限制，只要其能够以果糖-6-磷酸为底物而产生塔格糖-6-磷酸。
具体而言，塔格糖-二磷酸醛缩酶可为由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的多肽，或者包含与SEQ ID NO：1、3、5、7和9的氨基酸序列具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性的多肽。同样很显然，具有所述同源性且表现出与SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的蛋白相应的功效(即，将果糖-6-磷酸中的果糖的第4碳位置差向异构化而将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸的果糖-6-磷酸C4-差向异构化的活性)的氨基酸序列的多肽，即便具有一部分序列缺失、修饰、取代或添加的氨基酸序列，都包括在本发明的范围内。此外，根据已知核苷酸序列制备的探针，例如，可以在严格条件下与编码所述多肽的核苷酸序列的全部或部分的互补序列杂交的多核苷酸编码的多肽，亦可无限制地包括在内，只要其具有果糖-6-磷酸C4-差向异构化活性即可。因此，用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物可进一步包含果糖-6-磷酸。另外，所述组合物可包含一或多种由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的塔格糖-二磷酸醛缩酶。
本发明揭示了“塔格糖-二磷酸醛缩酶”表现出果糖-6-磷酸4-差向异构化活性，通过将果糖-6-磷酸的第4碳位置差向异构化而将果糖-6-磷酸转化成塔格糖-6-磷酸。因此，在本发明中，“塔格糖-二磷酸醛缩酶”可以与“果糖-6-磷酸C4-差向异构酶(fructose-6-phosphate C4-epimerase)”互换使用。
如本文所用，术语“严格条件”是指可实现多核苷酸之间特异性杂交的条件。这些条件取决于多核苷酸的长度和互补程度，这些参数是本领域众所周知的，并且在文献中有具体描述(例如，下文的J.Sambrooket et al.)。严格条件可以包括，例如，具有高同源性的基因彼此杂交、具有80％或以上、90％或以上、95％或以上、97％或以上、或99％或以上的同源性的基因彼此杂交，同源性低于上述的基因彼此不杂交的条件；或于Southern杂交的常规清洗条件，即在60℃、1×SSC、0.1％SDS，具体而言60℃、0.1×SSC、0.1％SDS，并且更具体而言68℃、0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度和温度下，清洗一次，具体而言，清洗两次或三次的条件。杂交中使用的探针可以是核苷酸序列的互补序列的一部分。此种探针可以通过PCR来制备，以基于已知序列的寡核苷酸为引物和包含这些核苷酸序列的DNA片段为模板。此外，本领域技术人员可视需要而根据诸如探针的长度的因素来调节温度和清洗溶液的盐浓度。
如本文所用，术语“同源性”是指两个多肽部分(moiety)之间的相同性的百分比。可以通过本领域中的已知技术来确定自一部分至另一部分的序列间的相同性。例如，可以使用下列方式确定同源性：使用现成的并且能够比对序列信息的计算机程序(例如，BLAST2.0)直接地比对两个多肽分子的序列信息，例如得分(score)、相同性(identity)和相似性(similarity)等参数。另外，多核苷酸的同源性可以通过如下方式确定：在同源区域间形成稳定的双链的条件下杂交多核苷酸，然后用单链特异性核酸酶消化杂交的链来确定消化的片段的大小。
在一具体实施方案中，本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可为源自嗜热微生物的酶或其变体，例如，源自Thermanaerothrix sp.的酶或其变体、源自Kosmotoga sp.的酶或其变体、源自红嗜热盐菌(Rhodothermus sp.)的酶或其变体、源自Limnochorda sp.的酶或其变体，具体而言，源自Thermanaerothrix daxensis、Kosmotoga olearia、海红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、Rhodothermus profundi或Limnochorda pilosa的酶，但不限于此。
本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶或其变体的特征在于，通过将D-果糖-6-磷酸(D-fructose-6-phosphate)的第4碳位置差向异构化，将D-果糖-6-磷酸转化成D-塔格糖-6-磷酸。本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可为已知具有塔格糖-二磷酸醛缩酶活性的酶，塔格糖-二磷酸醛缩酶以D-塔格糖1,6-二磷酸为底物产生磷酸甘油酮和D-甘油醛3-二磷酸，并参与半乳糖代谢。本发明首次揭示了塔格糖-二磷酸醛缩酶具有果糖-6-磷酸-4-差向异构酶活性。因此，本发明一实施方案涉及塔格糖-二磷酸醛缩酶的新用途，包括在自果糖-6-磷酸制备塔格糖-6-磷酸时将塔格糖-二磷酸醛缩酶用作果糖-6-磷酸-4-差向异构酶。此外，本发明另一实施方案涉及一种将塔格糖-二磷酸醛缩酶用作果糖-6-磷酸-4-差向异构酶，自果糖-6-磷酸制备塔格糖-6-磷酸的方法。
在一实施方案中，本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可为具有高耐热性的酶。具体而言，本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可在50℃至70℃下表现出其最大活性的50％至100％、60％至100％、70％至100％或75％至100％。更具体而言，本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可于55℃至65℃、60℃至70℃、55℃、60℃或70℃下表现出其最大活性的80％至100％或85％至100％。
此外，由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可以分别由SEQ ID NO：2、4、6、8或10的核苷酸序列编码，但不限制于此。
本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶或其变体可以通过以下方式获得：用表达本发明的酶或其变体的DNA(例如，SEQ ID NO：2、4、6、8或10)转化微生物(例如大肠杆菌(Escherichia.coli))，培养所述微生物以获得培养物，粉碎培养物，然后使用层析柱进行纯化等。除大肠杆菌外，用于转化的微生物还可包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、米曲霉(Aspergillus oryzae)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。在一具体实施方案中，转化的微生物可为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E或大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1。将大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E以保藏号KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E以保藏号KCCM12096P(保藏日：2017年8月11日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E以保藏号KCCM12097P(保藏日：2017年8月11日)、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E以保藏号KCCM12095P(保藏日：2017年8月11日)以及大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1以保藏号KCCM11995P(保藏日：2017年3月20日)，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)。
本发明所使用的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶可以由编码所述果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的核酸来提供。
如本文所用，术语“核酸”具有涵盖DNA或RNA分子的含义，其中作为核酸的基本组成单元的核苷酸不仅可包括天然核苷酸，还可包括具有糖或碱基修饰的类似物(参见：Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,ChemicalReviews,90:543-584(1990))。
本发明的核酸可为这样的核酸，其编码本发明的由SEQ ID NO：1、3、5、7或9的氨基酸序列组成的多肽，或编码与本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶具有至少80％、90％、95％、97％或99％的同源性且具有果糖-6-磷酸-4-差向异构酶活性的多肽。例如，编码由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的核酸可为这样的核酸，其与SEQ ID NO：2的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性。此外，编码由SEQ ID NO：3、5、7或9的氨基酸序列组成的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的核酸可为这样的核酸，其分别与其相应的SEQ ID NO：4、6、8或10的核苷酸序列具有至少80％、90％、95％、97％、99％或100％的同源性。同样显然地，本发明的核酸可包括由于密码子简并性(codon degeneracy)而翻译成本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的核酸和这样的核酸，其在严格条件下与SEQ ID NO：2、4、6、8或10的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的核酸杂交，且编码具有本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶活性的多肽。
可以在本发明中使用的表达果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的微生物可为包含重组载体的微生物，其中所述重组载体包含所述核酸。
载体可以可操作地连接至本发明的核酸。如本文所用，术语“可操作地连接”是指为了执行一般功能而将核苷酸表达调节序列与编码目标蛋白的核苷酸序列可操作地彼此连接，从而影响编码核苷酸序列的表达。可以利用本领域已知的基因重组技术实现与载体的可操作连接，并且可以利用本领域已知的限制性酶和连接酶实现位点特异性的DNA切割和连接。
如本文所用，术语“载体”是指用于将碱基克隆和/或转移至生物体(例如宿主细胞)中的任何介质。载体可为复制子(replicon)，其能够使组合有不同DNA片段的组合片段进行复制。在此，术语“复制子”是指任意遗传单位(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)，其作为体内DNA复制的自复制单元起作用，即能够通过自调节来实现复制。如本文所用，术语“载体”可以包括用于在体外、离体或体内将碱基引入生物体(例如宿主细胞)中的病毒和非病毒介质，并且还可包括微环DNA、如睡美人(Sleeping Beauty)的转座子(Izsvaket al.,J.MoI.Biol.302:93-102(2000))或人工染色体。常用的载体的实例可以包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。例如，可以使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A和Charon21A等作为噬菌体载体或粘粒载体；可以使用基于pBR、pUC、pBluescriptII、pGEM、pTZ、pCL和pET等的载体作为质粒载体。可以在本发明中使用的载体没有特别限制，可以使用任何已知的表达载体。此外，载体可为重组载体，其特征在于还包含各种抗生素抗性基因。如本文所用，术语“抗生素抗性基因”是指对抗生素具有抗性的基因，并且具有该基因的细胞可在经相应抗生素处理的环境中存活。因此，在大肠杆菌中产生大量质粒的过程中，将抗生素抗性基因用作选择标记。本发明中的抗生素抗性基因并非对本发明的核心技术(由载体的最佳组合实现的表达效率)产生较大影响的因素，因此可以无限制地使用通常用作选择标记的抗生素抗性基因。具体实例可包括针对氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素、链霉素或新霉素等的抗性基因。
可使用将包含编码所述酶的核酸的载体导入宿主细胞的方法获得用于本发明的表达果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的微生物，转化所述载体的方法可为任何能将核酸导入细胞的方法。可以选择并执行本领域已知的适当标准技术。可以包括电穿孔、磷酸钙共沉淀、逆转录病毒感染、显微注射、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法和热激法，但不限于此。
只要转化的基因能在宿主细胞中表达即可，其可以***宿主细胞的染色体中，也可以存在于染色体外。此外，所述基因包括DNA和RNA作为编码多肽的多核苷酸，并且可无限制地使用任何形式，只要能将其导入宿主细胞并在其中表达即可。例如，可以以表达盒的形式将基因导入宿主细胞，所述表达盒为包含自主表达所需的所有元件的多核苷酸构建体。通常，表达盒可包含与基因可操作地连接的启动子、转录终止信号、核糖体结合位点和翻译终止信号。表达盒可为能够自我复制的表达载体的形式。另外，可以将基因本身或多核苷酸构建体形式的基因引入宿主细胞中，并与在宿主细胞中表达所需的序列可操作地连接。
本发明的微生物可以包括原核微生物或真核微生物，只要是通过包含本发明的核酸或重组载体而可产生本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的微生物即可。例如，所述微生物可以包括属于埃希氏菌(Escherichia)属，欧文氏菌(Erwinia)属，沙雷氏菌(Serratia)属，普罗威登斯菌(Providencia)属，棒状杆菌(Corynebacterium)属和短杆菌(Brevibacterium)属的微生物菌株，具体地，可为但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。所述微生物的具体实例可包括大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1等。
除导入所述核酸或载体以外，本发明的微生物可包括经由各种已知方法而能够表达本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶或相关酶的任何微生物。
本发明的微生物的培养物可通过在培养基中培养能够表达本发明的塔格糖-二磷酸醛缩酶或相关酶的微生物来制备。
如本文所用，术语“培养”指使微生物在控制得当的环境条件下生长。本发明的培养过程可根据本领域已知的适当的培养基和培养条件进行。本领域技术人员可根据选择的菌株容易地调整培养过程。培养微生物的步骤可以但不特别限定于通过分批培养、连续培养或补料分批培养等进行。至于培养条件，可使用碱性化合物(例如，氢氧化钠，氢氧化钾或氨)或酸性化合物(例如，磷酸或硫酸)来调节恰当的pH(例如，pH5至9，具体而言，pH7至9)，但不特别限定于此。另外，可以在培养过程中加入如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂来抑制泡沫的产生。此外，可向培养物中注入氧气或含氧气体以保持培养物的有氧状态；也可不注入气体或注入氮气、氢气或二氧化碳气体，以维持培养物的厌氧或微氧状态。培养温度可维持在25℃至40℃，具体地，30℃至37℃，但不限于此。可持续培养直至获得所需量的有用材料为止，具体地，可持续约0.5小时至约60小时，但不限于此。此外，使用的培养基可包括作为碳源的糖和碳水化合物(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)、油脂(例如，大豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)、脂肪酸(例如，棕榈酸、硬脂酸和亚油酸)、醇(例如，甘油和乙醇)和有机酸(例如，乙酸)等。这些物质可单独或混合使用，但不限于此。氮源可包括含氮有机化合物(例如，蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、豆粕和尿素)或无机化合物(例如，硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)等。这些氮源也可单独或混合使用，但不限于此。磷源可包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或其相应的含钠盐等。这些磷源也可单独或混合使用，但不限于此。培养基可包含必需的生长刺激剂，例如金属盐(例如，硫酸镁或硫酸铁)、氨基酸和维生素。
本发明的另一方面提供一种用于制备塔格糖的组合物，其包含塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物；以及塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物。
用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物的描述，也可适用于用于制备塔格糖的组合物。本发明的塔格糖-6-磷酸可以无限制地为任何蛋白，只要其具有去除塔格糖-6-磷酸的磷酸基而将塔格糖-6-磷酸转化成塔格糖的活性即可。本发明的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可以为任何源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌(Thermotoga sp.)的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的酶或其变体。
根据本发明的一实施方案，本发明的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：11的氨基酸序列组成的塔格糖-6-磷酸磷酸酶可由SEQ ID NO：12的核苷酸序列编码。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)、表达所述葡萄糖-6-磷酸异构酶的微生物或所述微生物的培养物。在所述酶的存在下，葡萄糖-6-磷酸可被异构化而生成果糖-6-磷酸。本发明的葡萄糖-6-磷酸异构酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖-6-磷酸异构化成果糖-6-磷酸的活性即可。本发明的葡萄糖-6-磷酸异构酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖-6-磷酸-异构酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：13的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：13的氨基酸序列组成的葡萄糖-6-磷酸异构酶可由SEQ ID NO：14的核苷酸序列编码。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase)、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或所述微生物的培养物。所述酶催化将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸或将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸的可逆反应。本发明的葡萄糖磷酸变位酶可无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸或将葡萄糖-6-磷酸转化为葡萄糖-1-磷酸的活性即可。本发明的葡萄糖磷酸变位酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖磷酸变位酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：15的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：15的氨基酸序列组成的葡萄糖磷酸变位酶可由SEQ ID NO：16的核苷酸序列编码。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含葡萄糖激酶(glucokinase)、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物。本发明的葡萄糖激酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有磷酸化葡萄糖的活性即可。本发明的葡萄糖激酶可以为源自耐热微生物的酶，例如，源自异常球菌(Deinococcus sp.)、厌氧绳菌(Anaerolinea sp.)的酶或其变体，具体而言，可为源自中度嗜热菌(Deinococcus geothermalis)或嗜热厌氧绳菌(Anaerolinea thermophila)的酶或其变体。本发明的葡萄糖激酶可以无限制地为任何蛋白，只要其具有将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸的活性即可。具体而言，本发明的葡萄糖激酶可为磷酸依赖型的葡萄糖激酶。根据本发明的一实施方案，本发明的葡萄糖激酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：17或19的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：17或19的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：17的氨基酸序列组成的葡萄糖激酶可由SEQ ID NO：18的核苷酸序列编码，且本发明的由SEQ ID NO：19的氨基酸序列组成的葡萄糖激酶可由SEQ ID NO：20的核苷酸序列编码。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucanphosphorylase)、淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase)、麦芽糊精磷酸化酶(maltodextrin phosphorylase)或蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)、表达所述α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶的微生物或所述微生物的培养物。所述磷酸化酶可以无限制地包括任何蛋白，只要其具有将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖-1-磷酸的活性即可。所述磷酸化酶可为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自新阿波罗栖热袍菌的酶或其变体。本发明的磷酸化酶可以为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：21的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：21的氨基酸序列组成的磷酸化酶可由SEQ ID NO：22的核苷酸序列编码。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含α-淀粉酶(α-amylase)、支链淀粉酶(pullulanase)、葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)、蔗糖酶(sucrase)或异淀粉酶(isoamylase)；表达所述淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物；或表达所述淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可单独包含上述可用于产生塔格糖的酶中的两种或更多种酶，或其转化子，或者经编码所述两种或更多种酶的核苷酸转化的转化子。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含4-α-葡聚糖转移酶(4-α-glucanotransferase)、表达所述4-α-葡聚糖转移酶的微生物或表达所述4-α-葡聚糖转移酶的微生物的培养物。本发明的4-α-葡聚糖转移酶可无限制地包括任何蛋白，只要其具有将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糊精或蔗糖的活性即可。本发明的4-α-葡聚糖转移酶可为源自耐热微生物的酶，例如，源自栖热袍菌的酶或其变体，具体而言，可为源自海栖热袍菌的酶或其变体。根据本发明的一实施方案，本发明的4-α-葡聚糖转移酶可为这样的蛋白，其由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成，或由与SEQ ID NO：23的氨基酸序列具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的遗传同源性，或由所述任意两个数值限定的范围内的遗传同源性的序列组成。根据本发明的一实施方案，本发明的由SEQ ID NO：23的氨基酸序列组成的4-α-葡聚糖转移酶可由SEQ ID NO：24的核苷酸序列编码。
可用于上述实施方案的微生物的实例可包括大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2和大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4等。将重组微生物于2017年3月20日保藏于韩国微生物保藏中心，保藏号分别为KCCM11990P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1)、KCCM11991P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2)、KCCM11992P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1)、KCCM11993P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)和KCCM11994P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4)。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含与上述酶的各底物对应的物质、成分或组合物。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含通常用于相应的用于制备塔格糖的组合物的任何合适的赋形剂。赋形剂可包括，例如，防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂或等渗剂等，但不限于此。
本发明的用于制备塔格糖的组合物可进一步包含金属。在一实施方案中，本发明的金属可为包含二价阳离子的金属。具体而言，本发明的金属可为镍、钴、铝、镁(Mg)或锰(Mn)。更具体地，本发明的金属可为金属离子或金属盐，更具体而言，所述金属盐可为NiSO4、MgSO4、MgCl2、NiCl2、CoCl2、CoSO4、MnCl2或MnSO4。
本发明的又一方面涉及一种制备塔格糖-6-磷酸的方法，其包括使果糖-6-磷酸与塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸。
用于制备塔格糖-6-磷酸的组合物的描述也可适用于制备塔格糖的组合物。
本发明的另一方面涉及一种制备塔格糖的方法，其包括使果糖-6-磷酸与塔格糖-二磷酸醛缩酶、表达所述塔格糖-二磷酸醛缩酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸。所述制备塔格糖的方法可进一步包括使塔格糖-6-磷酸与塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖-6-磷酸转化为塔格糖。
本发明的方法可进一步包括使葡萄糖-6-磷酸与本发明的葡萄糖-6-磷酸-异构酶、表达所述葡萄糖-6-磷酸-异构酶的微生物或表达所述葡萄糖-6-磷酸异构酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸。
本发明的方法可进一步包括使葡萄糖-1-磷酸与本发明的葡萄糖磷酸变位酶、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸。
本发明的方法可进一步包括使葡萄糖与本发明的葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物或表达所述葡萄糖激酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸。
本发明的方法可进一步包括使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖-1-磷酸。
本发明的方法可进一步包括使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶，表达所述α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物，或表达所述α-淀粉酶、支链淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶或异淀粉酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。
本发明的方法可进一步包括使葡萄糖与本发明的4-α-葡聚糖转移酶、表达所述4-α-葡聚糖转移酶的微生物或表达所述4-α-葡聚糖转移酶的微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为淀粉、麦芽糊精或蔗糖。
本发明方法的各种接触可以在pH 5.0至pH 9.0、30℃至80℃的条件下进行和/或进行0.5小时至48小时。具体而言，本发明的接触可在pH 6.0至pH 9.0或pH 7.0至pH 9.0的条件下进行。此外，本发明的接触可在35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的温度条件下进行。此外，本发明的接触可进行0.5小时至36小时、0.5小时至24小时、0.5小时至12小时、0.5小时至6小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至12小时、1小时至6小时、3小时至36小时、3小时至24小时、3小时至12小时、3小时至6小时、12小时至36小时或18小时至30小时。
在一实施方案中，本发明的接触可在金属、金属离子或金属盐的存在下进行。
本发明的另一方面涉及一种制备塔格糖的方法，其包括使本文所述的用于制备塔格糖的组合物与淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合及多磷酸盐(polyphosphate)接触。
在本发明一具体实施方案中，提供一种制备塔格糖的方法，其包括：
使葡萄糖与本发明的葡萄糖激酶、表达所述葡萄糖激酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸；
使葡萄糖-6-磷酸与本发明的葡萄糖-6-磷酸-异构酶、表达所述葡萄糖-6-磷酸-异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；
使果糖-6-磷酸与本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶、表达所述果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸；以及
使塔格糖-6-磷酸与本发明的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖-6-磷酸转化为塔格糖。
各转化反应可以顺次进行或在同一反应体系中于原位(in situ)进行。在所述方法中，经由磷酸酶自塔格糖-6-磷酸上释放的磷酸，可用作葡萄糖激酶的底物用于产生葡萄糖-6-磷酸。因此磷酸并不堆积，因而可获得高转化率。
在所述方法中，葡萄糖可以经如下方式产生：例如，使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶或蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。因此，根据一具体实施方案的方法可进一步包括将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖。
在本发明另一具体实施方案中，提供一种制备塔格糖的方法，其包括：
使葡萄糖-1-磷酸与本发明的葡萄糖磷酸变位酶、表达所述葡萄糖磷酸变位酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；
使葡萄糖-6-磷酸与本发明的葡萄糖-6-磷酸-异构酶、表达所述葡萄糖-6-磷酸-异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将葡萄糖-6-磷酸转化为果糖-6-磷酸；
使果糖-6-磷酸与本发明的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶、表达所述果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸；以及
使塔格糖-6-磷酸与本发明的塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表达所述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或所述微生物的培养物接触，来将塔格糖-6-磷酸转化为塔格糖。
各转化反应可顺次进行或在同一反应体系中于原位进行。
在所述方法中，葡萄糖-1-磷酸可以如下方式产生：例如，使淀粉、麦芽糊精、蔗糖或其组合与本发明的α-葡聚糖磷酸化酶、淀粉磷酸化酶、麦芽糊精磷酸化酶、蔗糖磷酸化酶、表达所述磷酸化酶的微生物或表达所述磷酸化酶的微生物的培养物接触，来将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖-1-磷酸。因此，根据一具体实施方案的方法可进一步包括将淀粉、麦芽糊精或蔗糖转化为葡萄糖-1-磷酸。对此，经由磷酸酶自塔格糖-6-磷酸释放的磷酸可用作磷酸化酶的底物而用于产生葡萄糖-1-磷酸。因此，磷酸不会堆积，因而可获得高转化率。
所述方法可进一步包括对制备的塔格糖进行纯化。所述方法中的纯化可以是本发明所属领域通常使用的方法，而无特别限制。非限制性实例可包括层析法、分级结晶法和离子纯化法等。可仅使用一种方法，也可使用两种或更多种方法进行纯化。例如，可通过层析法纯化产物塔格糖，通过层析法分离糖可利用欲分离的糖与附着于离子树脂的金属离子之间的弱结合力的差异来进行。
另外，本发明的方法可进一步包括在本发明的纯化步骤之前或之后进行脱色、脱盐或既脱色又脱盐的步骤。通过进行脱色和/或脱盐，可获得无杂质的更纯的塔格糖。
以下，参照下列实施例更详细地对本发明进行说明。然而，这些实施例仅为有助于理解本发明，并且本发明不受限于这些实施例。
实施例
实施例1：各酶的重组表达载体及转化子的制备
为了提供本发明中塔格糖制备路径中所需的耐热性酶：α-葡聚糖磷酸化酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖-6-磷酸-异构酶、4-α-葡聚糖转移酶，从登记于基因库(GenBank)的嗜热微生物新阿波罗栖热袍菌或海栖热袍菌的核苷酸序列选取了预期为所述酶的核苷酸序列(上述酶分别为SEQ ID NO：22(CT1)、SEQ ID NO：16(CT2)、SEQ ID NO：14(TN1)和SEQID NO：24(TN2))。
基于所选核苷酸序列，设计并合成了正向引物(SEQ ID NO：21：CT1-Fp、SEQ IDNO：27：CT2-Fp、SEQ ID NO：29:TN1-Fp和SEQ ID NO：31：TN2-Fp)和反向引物(SEQ ID NO：26：CT1-Rp、SEQ ID NO：28：CT2-Rp、SEQ ID NO：30：TN1-Rp和SEQ ID NO：32：TN2-Rp)，并利用所述引物和新阿波罗栖热袍菌的基因组DNA作为模板通过PCR扩增了各酶的基因。使用限制性酶NdeI和XhoI或SalI将扩增的酶的各基因***到用于大肠杆菌表达的质粒载体pET21a(Novagen)，从而制备分别命名为pET21a-CJ_ct1、pET21a-CJ_ct2、pET21a-CJ_tn1及pET21a-CJ_tn2的重组表达载体。
利用常用的转化方法(参见Sambrook et al.,1989)将各表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)来制备转化子(转化微生物)，分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1和大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2。于2017年3月20日，按照《布达佩斯条约》将所述转化子分别以保藏号KCCM11990P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1)、KCCM11991P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2)、KCCM11992P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1)和KCCM11993P(大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2)保藏于韩国微生物保藏中心。
实施例2：重组酶的制备
将实施例1中制备的表达各酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct1、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_ct2、大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn1及大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_tn2接种到装有5ml LB的液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。
将通过种菌培养获得的每种培养物接种在含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG诱导重组酶的表达和产生。培养期间，震荡速度保持在180rpm，培养温度保持在37℃。将各培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次并用相同的缓冲液悬浮，随后用超声仪粉碎细胞。将细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅取上清液。通过多聚组氨酸标签亲和层析法纯化各种酶。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液对纯化的重组酶溶液进行透析后用于反应。
用SDS-PAGE检测各纯化的酶的分子量，结果证实CT1(α-葡聚糖磷酸化酶)的分子量为约96kDa，CT2(葡萄糖磷酸变位酶)的分子量为约53kDa，TN1(葡萄糖-6-磷酸-异构酶)的分子量为约51kDa。
实施例3：检测塔格糖-二磷酸醛缩酶的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶的活性3-1.包含塔格糖-二磷酸醛缩酶基因的重组表达载体和重组微生物的制备
为了鉴定本发明的新型耐热性的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶，获得了来自嗜热微生物Kosmotoga olearia、海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)、Rhodothermusprofundi和Limnochorda pilosa的塔格糖-二磷酸醛缩酶的基因信息，并制备了可在大肠杆菌中表达的重组载体和重组微生物。
具体而言，从登记于基因库和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，京都基因和基因组百科全书)中的Kosmotoga olearia或海洋红嗜热盐菌ATCC43812、Rhodothermus profundi DSM 22212和Limnochorda pilosa DSM 28787的核苷酸序列中，选取塔格糖-二磷酸醛缩酶的核苷酸序列，并且基于四种微生物的氨基酸序列信息(SEQ ID NO：1、3、5和7)和核苷酸序列(SEQ ID NO：2、4、6和8)，制备了包含所述酶的核苷酸序列且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His-CJ_KO_F6P4E、pBT7-C-His-CJ_RM_F6P4E、pBT7-C-His-CJ_RP_F6P4E和pBT7-C-His-CJ_LP_F6P4E(Bioneer Corp.，韩国)。
通过热激转化(Sambrook and Russell:Molecular cloning,2001)将制备的各表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中制备重组微生物，并冷冻保存在50％甘油后使用。将转化微生物分别命名为大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_KO_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RM_F6P4E、大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_RP_F6P4E和大肠杆菌BL21(DE3)/CJ_LP_F6P4E，并分别以保藏号KCCM11999P(保藏日：2017年3月24日)、KCCM12096P(保藏日：2017年8月11日)、KCCM12097P(保藏日：2017年8月11日)及KCCM12095P(保藏日：2017年8月11日)，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
为了鉴定新型耐热性的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶，从登记在基因库中的嗜热微生物Thermanaerothrix daxensis的核苷酸序列选取了预期为所述酶的核苷酸序列，基于微生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)和核苷酸序列(SEQ ID NO：10)的信息，将基因***到包含所述酶的核苷酸序列且可在大肠杆菌中表达的重组载体pBT7-C-His(Bioneer Corp.，韩国)，从而制备命名为pBT7-C-His-CJ_td1的重组表达载体。利用常用的转化方法(参见Sambrook et al.1989)将所述表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株，制备命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1的转化子(转化微生物)。于2017年3月20日，按照《布达佩斯条约》的规定，将所述转化子以保藏号KCCM11995P(大肠杆菌BL21(DE3)/pBT7-C-His-CJ_td1)保藏于韩国微生物保藏中心(KCCM)。
3-2.重组塔格糖-二磷酸醛缩酶的制备
为了从制备的重组微生物中制备重组酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E，将各重组微生物接种至装有5ml含有氨苄青霉素抗生素的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的振荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将种菌培养中获得的培养物接种至含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG(异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)诱导重组酶的表达和产生。在180rpm和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将各主培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用25mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，然后于相同的缓冲液中悬浮，用超声仪粉碎悬浮的细胞。将各细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅提取上清液。使用多聚组氨酸亲和层析法纯化上清液，并应用10倍柱体积的含有20mM咪唑和300mM NaCl的50mM NaH2PO4(pH 8.0)缓冲液以除去非特异性结合的蛋白。接下来，进一步用含有250mM咪唑和300mM NaCl的50mMNaH2PO4(pH 8.0)缓冲液进行洗脱和纯化。使用25mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液进行透析，获得纯化的酶CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E用以进行酶表征。
3-3.重组塔格糖-二磷酸醛缩酶的果糖-6-磷酸-4-差向异构酶活性分析
对实施例3-2中获得的重组塔格糖-二磷酸醛缩酶的果糖-6-磷酸-4-差向异构化活性进行分析。具体而言，将1重量％的底物果糖-6-磷酸悬浮于25mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液，并加入各1单位/ml的纯化的CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E、CJ_LP_F6P4E和CJ_TD1_F6P4E，并于60℃反应1小时。为了去除磷酸，添加1单位/ml的磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶，NEB)并于37℃反应1小时。利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速1ml/min。利用折射率检测器对产物进行分析。
结果，证实了CJ_KO_F6P4E、CJ_RM_F6P4E、CJ_RP_F6P4E和CJ_LP_F6P4E均具有将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸的活性(图1a-1d)。
也证实了CJ_TD1_F6P4E具有将果糖-6-磷酸转化为塔格糖-6-磷酸的活性(图5)。
实施例4：塔格糖-6-磷酸磷酸酶(D-tagatose-6-phosphate phosphatase)的鉴定
为了于本发明的塔格糖制备路径中利用同步复合酶反应自果糖-6-磷酸制备塔格糖，鉴定了可与塔格糖-二磷酸醛缩酶同时进行酶反应的塔格糖-6-磷酸磷酸酶。
4-1.包含塔格糖-6-磷酸磷酸酶基因的重组表达载体及重组微生物的制备
从登记在基因库中的海栖热袍菌的核苷酸序列选取预期为塔格糖-6-磷酸磷酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO：12，以下称为t4)和氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，并且根据所述所选核苷酸序列设计并合成了正向引物(SEQ ID NO：33)和反向引物(SEQ ID NO：34)。用所述引物和海栖热袍菌的基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应(PCR)扩增t4基因。使用限制性酶NdeI和XhoI将扩增的基因***到可在大肠杆菌中表达的质粒载体pET21a(Novagen)，从而制备命名为pET21a-CJ_t4的重组表达载体。通过热激转化(Sambrook andRussell:Molecular cloning,2001)将制备的表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以制备重组微生物，然后将其冷冻保存在50％甘油中待用。将所述重组微生物命名为大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4，，并于2017年3月20以保藏号KCCM11994P日，根据《布达佩斯条约》的规定，保藏于国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM)。
4-2.重组塔格糖-6-磷酸磷酸酶的制备
将大肠杆菌BL21(DE3)/pET21a-CJ_t4接种到装有5ml的LB液体培养基的培养管中，然后在37℃的震荡培养箱中进行种菌培养，直至在600nm的吸光度达到2.0。将通过种菌培养获得的培养物接种到含有LB液体培养基的培养瓶中，然后进行主培养。当600nm的吸光度达到2.0时，加入1mM的IPTG诱导重组酶的表达和产生。在180rpm震荡速度和37℃的条件下进行种菌培养和主培养。然后，将主培养的培养物在8,000×g和4℃下离心20分钟以回收细胞。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液将回收的细胞清洗两次，并悬浮于相同的缓冲液，随后用超声仪粉碎细胞。将细胞裂解液在13,000×g和4℃下离心20分钟，仅取出上清液。使用多聚组氨酸标签亲和层析法自上清液中纯化酶。使用50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液对纯化的酶进行透析，将纯化的重组酶命名为CJ_T4。
4-3.CJ_T4的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性的分析
为了分析CJ_T4的活性，将塔格糖-6-磷酸悬浮于50mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，向其中加入0.1单位/ml纯化的CJ_T4和10mM MgCl2，并于70℃下反应10分钟。然后，利用HPLC对反应产物进行分析。HPLC分析在如下条件下进行：HPX-87H(Bio-Rad)柱、流动相(水)60℃、流速0.6ml/min。利用折射率检测器对塔格糖和塔格糖-6-磷酸进行分析。
结果，于反应产物中生成了塔格糖。在磷酸和塔格糖反应物中添加所述CJ_T4后进行相同的反应，结果未形成塔格糖，表明CJ_T4具有不可逆的塔格糖-6-磷酸磷酸酶活性(图3)。
实施例5：利用同步复合酶反应制备塔格糖
将悬浮于25mM Tris-HCl(pH 7.0)缓冲液的1％(w/v)的果糖-6-磷酸添加至1单位/ml的CJ_KO_F6P4E或CJ_RP_F6P4E和1单位/ml的CJ_t4(保藏号KCCM11994P)的混合酶溶液中，并于60℃下反应1小时，然后利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速1ml/min。利用折射率检测器检测到塔格糖。
结果，观察到了塔格糖的生成，表明可利用塔格糖-二磷酸醛缩酶和塔格糖-6-磷酸磷酸酶的同步复合酶反应由果糖-6-磷酸制备塔格糖(图2a和2b)。
实施例6：利用同步复合酶反应自麦芽糊精制备塔格糖
为了分析利用复合酶自麦芽糊精制备塔格糖的活性，将5％(w/v)的麦芽糊精添加至含有1单位/ml的CT1、1单位/ml的CT2、1单位/ml的TN1、1单位/ml的T4、1单位/ml的TD1、20mM至50mM磷酸钠(pH 7.0)的反应溶液中，并于60℃下反应1小时，然后利用HPLC分析反应产物。HPLC分析在如下条件下进行：SP0810(Shodex)柱、流动相(水)80℃、流速0.6ml/min，并利用折射率检测器检测塔格糖。
结果证实，可以利用添加CT1、CT2、TN1、T4和TD1的复合酶反应自麦芽糊精制备塔格糖(图6)。
有益效果
根据本发明的制备塔格糖的方法由于使用葡萄糖或淀粉为原料而具有经济性，不堆积磷酸而达到较高的转化率，且因包含为不可逆反应路径的塔格糖-6-磷酸磷酸酶反应，因此显著提高向塔格糖的转化率。
此外，可以利用复合酶反应以葡萄糖或淀粉为原料制备塔格糖，因此本发明的方法具有简单、经济且改善产率的优点。
申请人或代理人档案号P18-6041
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关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
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序列表
<110> CJ第一制糖株式会社
<120> 用于制备塔格糖的组合物和利用其制备塔格糖的方法
<150> KR 10-2017-0042165
<151> 2017-03-31
<160> 34
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 435
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequences of CJ_KO_F6P4E
<400> 1
Met Lys Lys His Pro Leu Gln Asp Ile Val Ser Leu Gln Lys Gln Gly
1 5 10 15
Ile Pro Lys Gly Val Phe Ser Val Cys Ser Ala Asn Arg Phe Val Ile
20 25 30
Glu Thr Thr Leu Glu Tyr Ala Lys Met Lys Gly Thr Thr Val Leu Ile
35 40 45
Glu Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly Met
50 55 60
Thr Pro Ala Asp Phe Arg Glu Met Val Phe Ser Ile Ala Glu Asp Ile
65 70 75 80
Gly Leu Pro Lys Asn Lys Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro
85 90 95
Asn Pro Trp Lys Gly Gln Pro Ser Asp Gln Ala Met Arg Asn Ala Ile
100 105 110
Glu Met Ile Arg Glu Tyr Ala Lys Ala Gly Phe Thr Lys Leu His Leu
115 120 125
Asp Ala Ser Met Arg Leu Ala Asp Asp Pro Gly Asn Glu Asn Glu Pro
130 135 140
Leu Asn Pro Glu Val Ile Ala Glu Arg Thr Ala Leu Leu Cys Leu Glu
145 150 155 160
Ala Glu Arg Ala Phe Lys Glu Ser Ala Gly Ser Leu Arg Pro Val Tyr
165 170 175
Val Ile Gly Thr Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Asn Glu Gly
180 185 190
Lys Ser Ile His Val Thr Ser Val Gln Asp Phe Glu Arg Thr Val Glu
195 200 205
Leu Thr Lys Lys Ala Phe Phe Asp His Gly Leu Tyr Glu Ala Trp Gly
210 215 220
Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asn Glu
225 230 235 240
His Ile Phe Glu Tyr Asp Arg Asn Arg Ala Arg Glu Leu Thr Glu Ala
245 250 255
Ile Lys Lys His Pro Asn Ile Val Phe Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr
260 265 270
Gln Thr Ala Lys Ala Leu Lys Glu Met Val Glu Asp Gly Val Ala Ile
275 280 285
Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Leu Arg Glu Ala Phe Phe
290 295 300
Ala Leu Ser Ser Ile Glu Lys Glu Leu Phe Tyr Asp Thr Pro Gly Leu
305 310 315 320
Cys Ser Asn Phe Val Glu Val Val Glu Arg Ala Met Leu Asp Asn Pro
325 330 335
Lys His Trp Glu Lys Tyr Tyr Gln Gly Glu Glu Arg Glu Asn Arg Leu
340 345 350
Ala Arg Lys Tyr Ser Phe Leu Asp Arg Leu Arg Tyr Tyr Trp Asn Leu
355 360 365
Pro Glu Val Arg Thr Ala Val Asn Lys Leu Ile Thr Asn Leu Glu Thr
370 375 380
Lys Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Phe Met Pro Met Gln Tyr
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Gln Lys Ile Arg Asn Gly Leu Leu Arg Lys Asp Pro Ile Ser Leu Ile
405 410 415
Lys Asp Arg Ile Thr Leu Val Leu Asp Asp Tyr Tyr Phe Ala Thr His
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Pro Glu Cys
435
<210> 2
<211> 1308
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence of CJ_KO_F6P4E
<400> 2
atgaaaaaac atcctcttca ggacattgtt tcattgcaaa aacagggaat acccaaaggg 60
gttttctctg tatgtagtgc caatagattt gttattgaaa ccactctgga atatgcgaag 120
atgaaaggga caacggttct tatagaggcc acctgcaatc aggtaaacca gttcggtggc 180
tacaccggta tgactcctgc tgatttcaga gaaatggttt tttctatcgc tgaggatatt 240
ggacttccca aaaataaaat catccttggt ggcgaccatc ttggcccaaa tccctggaag 300
ggtcagccgt cagatcaggc tatgcgtaac gccattgaaa tgattcgaga atacgctaaa 360
gctgggttta ccaagcttca tctggatgcc agcatgcgtc ttgcagacga tccggggaac 420
gaaaacgagc cgctgaaccc ggaagttata gcggaaagaa cagctcttct ctgtcttgaa 480
gccgagaggg cttttaaaga atccgccggt tctctccggc ctgtttacgt tattggtacg 540
gatgttccgc caccgggtgg agcgcaaaac gaaggtaaat cgattcatgt aaccagtgtt 600
caggattttg agcgtaccgt tgagttgacc aaaaaggcat ttttcgacca tggtttgtat 660
gaagcctggg gaagggtgat tgcggttgtt gtgcaaccgg gagtagaatt cgggaatgaa 720
catatattcg aatatgatag aaatcgagcg agagaactta ctgaggcgat aaaaaagcat 780
ccaaatatag tttttgaagg tcactcgaca gattatcaaa cggcaaaagc attgaaagaa 840
atggtagaag acggtgtagc catactcaag gttgggccag ctctaacatt tgcgctcaga 900
gaggcttttt ttgcgttgag cagcattgaa aaagagttat tttatgatac acccgggctt 960
tgttcaaact ttgttgaagt tgtcgagaga gcgatgcttg acaatccaaa acattgggaa 1020
aaatattacc agggagaaga gagagaaaat agattagccc gtaaatacag ctttctcgat 1080
cgcttgaggt attactggaa tcttcctgag gttagaacag cggtgaataa gctgataacc 1140
aaccttgaaa caaaagaaat cccgttaacg cttataagcc agttcatgcc gatgcagtac 1200
caaaaaatca gaaacggttt gctaagaaag gatccaataa gccttataaa agatcgaatt 1260
acccttgttc ttgatgacta ctatttcgca actcaccctg aatgttga 1308
<210> 3
<211> 420
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequences of CJ_RM_F6P4E
<400> 3
Met Gln Ala Gln Ala Leu Leu Thr Val Pro Phe Asp Arg Val Ala Thr
1 5 10 15
His Ala Arg Gly Phe Val Gly Trp Val Ala Glu Leu Leu Gln Gly Pro
20 25 30
Leu Ala Tyr Gln His Thr Leu Leu Ala Val Cys Pro Asn Ser Glu Ala
35 40 45
Val Thr Arg Ala Ala Leu Glu Ala Ala Ala Glu Ala Asn Ala Pro Leu
50 55 60
Leu Phe Ala Ala Thr Leu Asn Gln Val Asp Leu Asp Gly Gly Tyr Thr
65 70 75 80
Gly Trp Thr Pro Ala Thr Leu Ala Arg Phe Val Ala Asp Glu Leu Ala
85 90 95
Arg Leu Asp Leu His Ile Pro Val Val Leu Gly Leu Asp His Gly Gly
100 105 110
Pro Trp Lys Lys Asp Leu His Ala Arg Asn Arg Leu Ser Phe Glu Glu
115 120 125
Thr Phe Gln Ala Val Leu Arg Ala Ile Glu Ala Cys Leu Asp Ala Gly
130 135 140
Tyr Gly Leu Leu His Leu Asp Pro Thr Val Asp Leu Glu Leu Ser Pro
145 150 155 160
Gly Thr Pro Val Pro Ile Pro Arg Ile Val Glu Arg Ser Val Ala Leu
165 170 175
Leu Arg His Ala Glu Thr Tyr Arg Leu Arg Arg Asn Leu Pro Pro Val
180 185 190
Ala Tyr Glu Val Gly Thr Glu Glu Val Gly Gly Gly Leu Gln Ala Glu
195 200 205
Ala Arg Met Ala Glu Phe Leu Asp Arg Leu Trp Thr Ala Leu Asp Arg
210 215 220
Glu Gly Leu Pro His Pro Val Phe Val Val Gly Asp Ile Gly Thr Arg
225 230 235 240
Leu Asp Thr Arg Thr Phe Asp Phe Glu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Ala
245 250 255
Leu Val Arg Arg Tyr Gly Ala Leu Ile Lys Gly His Tyr Thr Asp Asp
260 265 270
Val Asp Arg Leu Asp Leu Tyr Pro Lys Ala Gly Ile Gly Gly Ala Asn
275 280 285
Val Gly Pro Gly Leu Ala Ala Ile Glu Phe Glu Ala Leu Glu Ala Leu
290 295 300
Val Glu Glu Ala Arg Arg Arg Gly Leu Ser Val Thr Phe Asp Gln Ala
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Ile Arg Arg Ala Val Val Glu Ser Gly Arg Trp Thr Lys Trp Leu Gln
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Pro Glu Glu Lys Gly Gln Pro Phe Asp Ala Leu Asp Pro Glu Arg Gln
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Arg Trp Leu Val Ala Thr Gly Ser Arg Tyr Val Trp Thr His Pro Ala
355 360 365
Val Leu Gln Ala Arg Arg Glu Leu Tyr Glu Ala Leu Ala Pro Trp Leu
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Asp Ala Asp Ala Phe Val Arg Thr Arg Ile Lys Ala Arg Leu Met Asp
385 390 395 400
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405 410 415
Phe Leu Pro Glu
420
<210> 4
<211> 1263
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence of CJ_RM_F6P4E
<400> 4
atgcaggcgc aggccctgct gaccgttcca tttgatcggg tggcgaccca cgcacgcggg 60
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cgcaaccgat tgtcctttga ggaaaccttc caggccgtgc tgcgggccat cgaggcctgt 420
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Thr Arg Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Ser Val Cys Thr Ala Asp Pro Leu
20 25 30
Val Leu Arg Ala Ala Leu Lys Gln Ala Val Glu Asp Gly Ser Pro Ala
35 40 45
Leu Ile Glu Ala Thr Ser Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr
50 55 60
Gly Met Glu Pro Pro Ala Phe Val Glu Phe Val Leu Gly Leu Ala Arg
65 70 75 80
Glu Met Gly Leu Pro Pro Glu Arg Leu Ile Leu Gly Gly Asp His Leu
85 90 95
Gly Pro Asn Pro Trp Gln Arg Leu Ala Ala Glu Glu Ala Met Arg His
100 105 110
Ala Cys Asp Leu Val Glu Ala Phe Val Ala Cys Gly Phe Thr Lys Ile
115 120 125
His Leu Asp Ala Ser Met Pro Leu Gly Glu Glu Arg Ala Gly Gly Ala
130 135 140
Leu Ser Lys Arg Val Val Ala Glu Arg Thr Ala Gln Leu Cys Glu Ala
145 150 155 160
Ala Glu Ala Ala Phe Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Gly Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Pro Leu Tyr Val Ile Gly Ser Asp Val Pro Pro Pro Gly Gly Glu
180 185 190
Thr Ser Gly Ser Gln Gly Pro Lys Val Thr Thr Pro Glu Glu Phe Glu
195 200 205
Glu Thr Val Ala Leu Thr Arg Ala Thr Phe His Asp Arg Gly Leu Asp
210 215 220
Asp Ala Trp Gly Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Asp
225 230 235 240
Phe Gly Glu Trp Gln Val His Pro Tyr Asp Arg Ala Ala Ala Ala Ser
245 250 255
Leu Thr Arg Ala Leu Thr Gln His Pro Gly Leu Ala Phe Glu Gly His
260 265 270
Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Pro Gly Arg Leu Arg Gln Met Ala Glu Asp
275 280 285
Gly Ile Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Lys Arg
290 295 300
Glu Ala Leu Phe Ala Leu Asn Ala Leu Glu Ser Glu Val Leu Gly Thr
305 310 315 320
Asp Gly Arg Ala Arg Arg Ser Asn Val Glu Ala Ala Leu Glu Glu Ala
325 330 335
Met Leu Ala Asp Pro Arg His Trp Ser Ala Tyr Tyr Ser Gly Asp Glu
340 345 350
His Glu Leu Arg Leu Lys Arg Lys Tyr Gly Leu Ser Asp Arg Cys Arg
355 360 365
Tyr Tyr Trp Pro Val Pro Ser Val Gln Glu Ala Val Gln Arg Leu Leu
370 375 380
Gly Asn Leu Arg Glu Ala Gly Ile Pro Leu Pro Leu Leu Ser Gln Phe
385 390 395 400
Leu Pro Arg Gln Tyr Glu Arg Val Arg Glu Gly Val Leu Arg Asn Asp
405 410 415
Pro Glu Glu Leu Val Leu Asp Arg Ile Arg Asp Val Leu Arg Gly Tyr
420 425 430
Ala Ala Ala Val Gly Thr Gly Ala Arg Arg Ala Glu Pro Ser Pro Ala
435 440 445
<210> 8
<211> 1347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid sequence of CJ_LP_F6P4E
<400> 8
atgcaaacct cgacggcgta cgtgaggcag gtcatttggg gtcaagggac gagggacccc 60
cgcggcatct actcggtctg taccgcagac cccctcgtcc ttcgggccgc cctcaagcag 120
gcggtggagg atggctcccc cgcgctgatc gaggcgacgt ccaaccaggt gaaccagttc 180
ggcgggtata cggggatgga gcccccggcg ttcgtggagt tcgtgctggg acttgcccgc 240
gagatgggac tcccgcccga gcggctgatc ctcgggggcg atcacctcgg ccccaaccca 300
tggcagcggc tggcggccga agaggccatg cggcatgcct gcgacctcgt cgaggccttc 360
gtggcctgcg gcttcaccaa gattcacctg gacgccagca tgcccctggg ggaggaacgg 420
gcaggcggtg cgctttcgaa acgggtggtg gccgaacgga ccgcccagct ctgcgaggcg 480
gccgaggcgg ccttcaggaa gcggtcccag gcggaggggg cgtcggcgcc tccgctctac 540
gtcatcggct ccgacgtgcc tccgcccggc ggcgagacct ccgggagcca ggggcccaag 600
gtgaccacgc cggaggagtt cgaggagacg gtcgcgctga cgcgggcgac ctttcacgat 660
cggggcctgg acgacgcctg gggacgggtg atcgccgtgg tggtccagcc gggggtggac 720
ttcggcgagt ggcaggttca cccctacgat cgggccgccg cggcgagcct tacccgagcc 780
ttgacgcagc atccggggct ggccttcgaa gggcactcca ccgactacca gacgccgggg 840
cggcttcgcc agatggcgga agacggcatc gccatcctga aggtggggcc ggccctcacc 900
ttcgccaagc gggaagcgct cttcgccctg aacgccctgg agtccgaagt gctggggacg 960
gacggccgag cacggcgctc caacgtcgaa gccgccctcg aagaggcgat gctcgccgat 1020
ccccgtcact ggagcgccta ctacagcggg gacgagcacg agctccgtct caagcggaag 1080
tacggcctct ccgaccggtg tcgctactac tggcccgtcc cttcggtgca ggaggccgtc 1140
cagcgcctcc ttggcaacct gcgcgaggcg gggatcccct tgcccctgct gagccagttc 1200
ctgccgcgcc agtacgagcg ggtgcgggag ggcgtcctgc gcaacgaccc ggaggagctg 1260
gtcctggacc ggattcgtga cgtgttgcgg ggatatgcgg cggccgtggg gacgggcgct 1320
aggcgggcgg agccatcacc cgcgtga 1347
<210> 9
<211> 426
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fructose-6-phosphate C4 epimerase derived from Thermanaerothrix
daxensis (TD1)
<400> 9
Met Val Thr Tyr Leu Asp Phe Val Val Leu Ser His Arg Phe Arg Arg
1 5 10 15
Pro Leu Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Tyr Val Ile Glu
20 25 30
Ala Ala Leu Arg Asn Gly Met Met Thr His Thr Pro Val Leu Ile Glu
35 40 45
Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr
50 55 60
Pro Ala Asp Phe Val Arg Tyr Val Glu Asn Ile Ala Ala Arg Val Gly
65 70 75 80
Ser Pro Arg Glu Asn Leu Leu Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu
85 90 95
Val Trp Ala His Glu Pro Ala Glu Ser Ala Met Glu Lys Ala Arg Ala
100 105 110
Leu Val Lys Ala Tyr Val Glu Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp
115 120 125
Cys Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Arg Asp Phe Ser Pro Lys Val Ile
130 135 140
Ala Glu Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala Glu Ser Thr Cys Asp
145 150 155 160
Val Met Gly Leu Pro Leu Pro Asn Tyr Val Ile Gly Thr Glu Val Pro
165 170 175
Pro Ala Gly Gly Ala Lys Ala Glu Ala Glu Thr Leu Arg Val Thr Arg
180 185 190
Pro Glu Asp Ala Ala Glu Thr Ile Ala Leu Thr Arg Ala Ala Phe Phe
195 200 205
Lys Arg Gly Leu Glu Ser Ala Trp Glu Arg Val Val Ala Leu Val Val
210 215 220
Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Asp His Gln Ile His Val Tyr Arg Arg
225 230 235 240
Glu Glu Ala Gln Ala Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ser Gln Pro Gly Leu
245 250 255
Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Arg Asp Ala Leu Arg
260 265 270
Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu
275 280 285
Thr Phe Ala Phe Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Ala Ser Ile Glu Asp
290 295 300
Trp Val Cys Asp Ser Pro Ser Arg Ile Leu Glu Val Leu Glu Thr Thr
305 310 315 320
Met Leu Ala Asn Pro Val Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Leu Gly Asp Glu
325 330 335
Arg Ala Arg Arg Ile Ala Arg Gly Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg
340 345 350
Tyr Tyr Trp Ser Ala Pro Ala Val Glu Gln Ala Phe Glu Arg Leu Arg
355 360 365
Ala Asn Leu Asn Arg Val Ser Ile Pro Leu Val Leu Leu Ser Gln Tyr
370 375 380
Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Val Arg Asp Gly Arg Leu Pro Asn Gln
385 390 395 400
Phe Asp Ala Leu Ile Leu Asp Lys Ile Gln Ala Val Leu Glu Asp Tyr
405 410 415
Asn Val Ala Cys Gly Val Arg Ile Gly Glu
420 425
<210> 10
<211> 1281
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of fructose-6-phosphate C4 epimerase derived
fromThermanaerothrix daxensis (TD1)
<400> 10
atggttacct atttggattt tgtggtgctt tctcatcgtt ttaggcgccc cctgggcatt 60
acctcagtgt gttcggcgca tccgtatgtc attgaggcgg cgctgcgtaa tgggatgatg 120
acccatacac cggtcctaat cgaggccact tgcaatcaag tcaatcagta tgggggatat 180
acggggatga ccccggcaga tttcgtgcgg tatgtggaga atattgctgc acgggtaggc 240
tctccacgtg aaaacctcct tttgggtggc gatcatttgg gacccctggt ctgggctcat 300
gaacctgctg agagtgccat ggaaaaagct cgagctctgg tcaaagccta tgtagaggct 360
ggttttcgca aaattcatct ggattgctca atgccctgtg cggatgatcg cgatttttct 420
ccaaaggtca ttgctgagcg ggcagccgaa ttggctcagg tggcagagtc aacttgtgat 480
gttatgggct tgcccttgcc caactacgtc attggaaccg aggtgccccc agcaggtggc 540
gccaaggctg aagccgaaac tttgagggta acccgtccgg aggatgcagc ggagaccatt 600
gcactgacca gagcggcttt tttcaagcga ggtttagagt ctgcctggga acgtgtagtg 660
gcgttagtag tgcaacccgg tgttgaattc ggagatcatc agattcatgt ttaccgccgt 720
gaggaagcgc aggctctttc ccgcttcatt gaaagccagc ccggcttagt ctatgaggct 780
cactccaccg actatcagcc ccgtgatgcg ctgcgggctt tggttgagga tcatttcgca 840
atcctgaagg tgggtccggc gctaaccttt gcttttcgtg aggcagtttt tgccctggcc 900
agtatcgagg attgggtatg cgattcaccc agtcgcatcc tggaagtttt ggaaacaacc 960
atgctggcca acccggtcta ctggcaaaag tattacttgg gcgatgagcg agcgcgtcgg 1020
attgccagag ggtatagttt cagcgatcgc attcgttatt attggagtgc accagcggtt 1080
gaacaggcct ttgaacgctt gcgggcaaat ctgaatcgtg tttcgatccc ccttgtcctt 1140
ctcagtcagt atttgccgga tcaatatcgc aaagtgcggg atggacggct gcctaaccag 1200
tttgatgctt tgattctgga taaaatccaa gccgtactgg aagactacaa tgtggcgtgt 1260
ggtgtgagga taggggagtg a 1281
<210> 11
<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tagatose-6-phosphate phosphatase derived from Thermotoga
maritima(T4)
<400> 11
Met Glu Gly Gly Ile Glu Leu Asp Arg Leu Asp Phe Ser Ile Lys Leu
1 5 10 15
Leu Arg Arg Val Gly His Phe Leu Met Leu His Trp Gly Lys Val Asp
20 25 30
Ser Val Glu Lys Lys Thr Gly Phe Lys Asp Ile Val Thr Glu Ile Asp
35 40 45
Lys Lys Ala Gln Glu Met Ile Val Glu Glu Ile Arg Lys Val Phe Pro
50 55 60
Asp Glu Asn Ile Ile Ala Glu Glu Gly Ile Ser Glu Asn Gly Lys Lys
65 70 75 80
Leu Trp Ile Ile Asp Pro Ile Asp Gly Thr Ile Asn Phe Val His Gly
85 90 95
Leu Pro Asn Phe Ser Ile Ser Ile Ala Tyr Val Glu Asn Gly Glu Val
100 105 110
Lys Met Gly Val Val His Ala Pro Ala Leu Asn Glu Thr Leu Tyr Ala
115 120 125
Glu Glu Asn Gly Gly Ala Phe Leu Asn Gly Glu Arg Ile Arg Val Ser
130 135 140
Gly Asn Thr Ser Leu Glu Glu Cys Val Gly Ser Thr Gly Ser Tyr Val
145 150 155 160
Asp Phe Thr Gly Lys Phe Ile Glu Lys Met Glu Lys Lys Thr Arg Arg
165 170 175
Val Arg Ile Leu Gly Ser Ala Ala Leu Asn Ala Cys Tyr Val Gly Ala
180 185 190
Gly Arg Val Asp Phe Phe Val Thr Trp Arg Ile Asn Pro Trp Asp Ile
195 200 205
Ala Ala Gly Leu Ile Val Val Lys Glu Ala Gly Gly Thr Val Thr Asp
210 215 220
Phe Ala Gly Lys Glu Ala Asn Val Phe Ser Lys Asn Phe Val Phe Ser
225 230 235 240
Asn Gly Leu Val His Glu Glu Val Leu Glu Val Val Asn Glu Val Leu
245 250 255
Lys Glu Ile Gly Glu Gly Lys
260
<210> 12
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of tagatose-6-phosphate phosphatase derived from
Thermotoga maritima (T4)
<400> 12
atggagggag ggatcgaatt ggacagactg gacttttcga taaaactcct gagaagggtt 60
gggcactttc tcatgcttca ctggggaaag gtggacagtg tggagaaaaa gaccggtttc 120
aaagacatcg tgacggaaat agacaaaaag gcccaggaga tgatagtgga ggagatcaga 180
aaggtttttc cggatgagaa cataatagcg gaggagggaa tctcggagaa cggaaaaaaa 240
ctctggataa tagatcccat agacgggacg ataaacttcg ttcatggact tcccaacttt 300
tccatctcca tcgcttacgt ggagaatgga gaggtgaaga tgggagttgt gcacgctcct 360
gcactcaacg aaacactcta cgccgaagaa aacgggggtg cttttttgaa cggtgaaagg 420
atcagggtgt ctggaaacac aagtcttgaa gagtgcgtgg gatcaacggg aagctatgtg 480
gatttcaccg gaaagtttat cgagaagatg gaaaagaaaa caaggagagt gagaattctg 540
gggagtgcgg cgctgaacgc ctgctacgtg ggagcaggga gggtggattt cttcgtcact 600
tggaggatca atccgtggga catcgcagca ggcctgatag ttgtgaaaga ggcgggagga 660
acggtgacag attttgccgg aaaagaggca aacgttttct cgaagaattt tgtcttctcc 720
aacggactcg ttcacgaaga agttctcgaa gtggtgaacg aggttctgaa agagatagga 780
gaggggaagt ga 792
<210> 13
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> glucose-6-phosphate isomerase derived from Thermotoga
maritima(TN1)
<400> 13
Met Lys Lys Met Ala Leu Lys Phe Asp Phe Ser Asn Leu Phe Glu Pro
1 5 10 15
Asn Ile Ser Gly Gly Leu Arg Glu Glu Asp Leu Glu Ser Thr Lys Glu
20 25 30
Lys Val Ile Glu Ala Ile Lys Asn Phe Thr Glu Asn Thr Pro Asp Phe
35 40 45
Ala Arg Leu Asp Arg Lys Trp Ile Asp Ser Val Lys Glu Leu Glu Glu
50 55 60
Trp Val Val Asn Phe Asp Thr Val Val Val Leu Gly Ile Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Leu Gly Asn Leu Ala Leu His Tyr Ser Leu Arg Pro Leu Asn Trp
85 90 95
Asn Glu Met Ser Arg Glu Glu Arg Asn Gly Tyr Ala Arg Val Phe Val
100 105 110
Val Asp Asn Val Asp Pro Asp Leu Met Ala Ser Val Leu Asp Arg Ile
115 120 125
Asp Leu Lys Thr Thr Leu Phe Asn Val Ile Ser Lys Ser Gly Ser Thr
130 135 140
Ala Glu Val Met Ala Asn Tyr Ser Ile Ala Arg Gly Ile Leu Glu Ala
145 150 155 160
Asn Gly Leu Asp Pro Lys Glu His Ile Leu Ile Thr Thr Asp Pro Glu
165 170 175
Lys Gly Phe Leu Arg Lys Val Val Lys Glu Glu Gly Phe Arg Ser Leu
180 185 190
Glu Val Pro Pro Gly Val Gly Gly Arg Phe Ser Val Leu Thr Pro Val
195 200 205
Gly Leu Phe Ser Ala Met Ala Glu Gly Ile Asp Ile Glu Glu Leu His
210 215 220
Asp Gly Ala Arg Asp Ala Phe Glu Arg Cys Lys Lys Glu Asp Leu Phe
225 230 235 240
Glu Asn Pro Ala Ala Met Ile Ala Leu Thr His Tyr Leu Tyr Leu Lys
245 250 255
Arg Gly Lys Ser Ile Ser Val Met Met Ala Tyr Ser Asn Arg Met Thr
260 265 270
Tyr Leu Val Asp Trp Tyr Arg Gln Leu Trp Ala Glu Ser Leu Gly Lys
275 280 285
Arg Tyr Asn Leu Lys Gly Glu Glu Val Phe Thr Gly Gln Thr Pro Val
290 295 300
Lys Ala Ile Gly Ala Thr Asp Gln His Ser Gln Ile Gln Leu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Gly Pro Asn Asp Lys Val Ile Thr Phe Leu Arg Leu Glu Asn Phe
325 330 335
Asp Arg Glu Ile Ile Ile Pro Asp Thr Gly Arg Glu Glu Leu Lys Tyr
340 345 350
Leu Ala Arg Lys Arg Leu Ser Glu Leu Leu Leu Ala Glu Gln Thr Gly
355 360 365
Thr Glu Glu Ala Leu Arg Lys Asn Asp Arg Pro Asn Met Lys Val Ile
370 375 380
Phe Asp Arg Leu Thr Ser Tyr Asn Val Gly Gln Phe Phe Ala Tyr Tyr
385 390 395 400
Glu Ala Ala Thr Ala Phe Met Gly Tyr Leu Leu Glu Ile Asn Pro Phe
405 410 415
Asp Gln Pro Gly Val Glu Leu Gly Lys Lys Ile Thr Phe Ala Leu Met
420 425 430
Gly Arg Glu Gly Tyr Glu Tyr Glu Ile Lys Asp Arg Thr Lys Lys Val
435 440 445
Ile Ile Glu
450
<210> 14
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of glucose-6-phosphate isomerase derived from
Thermotoga maritima (TN1)
<400> 14
atgaaaaaga tggctttgaa atttgatttt tcaaatcttt ttgaaccgaa catctccggt 60
ggactgagag aggaagatct ggaaagcaca aaagaaaagg tgatagaggc gataaagaat 120
ttcactgaga acacaccgga ttttgccaga ctggacagaa aatggatcga ttcggtgaag 180
gaactcgagg agtgggtggt gaacttcgac acggtggtcg ttctgggaat tgggggatcc 240
ggtcttggaa accttgccct tcattattcg ttgagaccac tgaactggaa cgagatgtcg 300
agagaggaaa gaaacggtta tgcgagagtc ttcgtggtgg acaacgtaga tcccgatctc 360
atggcctccg tccttgatag gatagatctg aagacaacgc tgttcaacgt gatctcaaaa 420
tctggatcca cggctgaggt tatggcgaat tactcgatcg caaggggaat cctggaggct 480
aatggtctgg acccgaaaga acacatcctc atcacaacag atccagagaa gggctttttg 540
agaaaagtag tgaaagaaga gggcttcaga agtcttgagg tccctcccgg cgttggagga 600
aggttcagcg tgctgacgcc cgttggcctc ttctctgcca tggcggaggg tatcgacata 660
gaagaactcc acgacggtgc ccgggatgcg ttcgagagat gcaagaagga agacctgttc 720
gaaaatccag cggcgatgat cgccctcaca cactatctct atctgaagag aggaaagagc 780
atctccgtca tgatggccta ctccaacagg atgacctacc tcgtggactg gtacagacag 840
ctgtgggcag aaagtctggg aaagagatac aacctgaaag gagaggaggt cttcacgggt 900
cagaccccgg tgaaggcaat aggagccacc gatcagcact ctcagataca gctttacaac 960
gagggcccaa acgacaaagt gataacgttt ttgcggttgg aaaacttcga tagagagatc 1020
ataataccgg acaccggaag agaagagctc aaataccttg caagaaaaag actctctgaa 1080
cttctccttg cagaacagac aggaacagag gaagccctaa ggaaaaacga cagaccgaac 1140
atgaaggtga tcttcgacag actcacctct tacaatgtgg gccagttctt cgcttattat 1200
gaagccgcaa ctgctttcat ggggtatctc ctcgagatca acccgtttga tcagccgggt 1260
gtggaacttg gaaagaagat cacgtttgcc ctcatgggaa gggaaggtta cgaatacgaa 1320
ataaaagatc gcaccaagaa ggtgatcata gaatga 1356
<210> 15
<211> 471
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Phosphoglucomutase derived from Thermotoga neapolitana (CT2)
<400> 15
Met Ile Leu Phe Gly Thr Gly Gly Ile Arg Gly Val Met Arg Lys Gly
1 5 10 15
Glu Phe Asp Glu Asp Thr Val Lys Arg Ala Ser Leu Ser Val Ala Phe
20 25 30
Trp Met Lys Gln Arg Lys Leu Lys Ser Val Val Ile Ala Tyr Asp Thr
35 40 45
Arg Lys Asn Ser Arg Glu Phe Ala Glu Leu Ala Gly Arg Val Phe Ala
50 55 60
Gly Glu Gly Ile Glu Ala Tyr Val Phe Pro Glu Pro Thr Pro Thr Pro
65 70 75 80
Val Leu Ser Phe Ala Val Arg His Met Lys Ala Gly Ala Gly Val Val
85 90 95
Ile Thr Ala Ser His Asn Pro Pro Glu Tyr Asn Gly Tyr Lys Val Tyr
100 105 110
Thr Trp Asp Gly Val Gln Ala Ile Pro Glu Tyr Thr Asp Glu Ile Thr
115 120 125
Glu Ile Tyr Lys Lys Val Asp Ile Ser Gly Val Arg Glu Gly Gly Phe
130 135 140
Lys His Val Pro Ser Glu Val Lys Glu Ser Tyr Ile Glu Lys Val Val
145 150 155 160
Glu Ile Val Ser Asn Leu Pro Arg Arg Thr Asp Leu Asp Val Ala Tyr
165 170 175
Ser Pro Leu His Gly Thr Gly Ala Asn Tyr Val Pro Glu Val Leu Arg
180 185 190
Arg Leu Gly Phe Lys Val Arg Pro Val Glu Glu Gln Met Lys Pro Asp
195 200 205
Pro Asn Phe Ser Thr Val Pro Thr Pro Asn Pro Glu Glu Asp Glu Ala
210 215 220
Leu Val Leu Leu Asn Lys Lys Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ala Thr Asp
225 230 235 240
Pro Asp Cys Asp Arg Val Gly Val Val Tyr Arg Gly Arg Arg Leu Thr
245 250 255
Gly Asn Gln Val Gly Val Leu Leu Thr Asp Phe Leu Leu Glu His Val
260 265 270
Lys Val Glu Asn Pro Leu Val Ile Lys Thr Ile Val Thr Thr Asp Met
275 280 285
Val Arg Pro Ile Cys Glu Glu Arg Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Thr Pro
290 295 300
Thr Gly Phe Lys Phe Ile Gly His Leu Ile Glu Glu His Thr Lys Lys
305 310 315 320
Gly Asp Arg Asn Phe Val Phe Gly Phe Glu Glu Ser Cys Gly Tyr Leu
325 330 335
Ala Gly Asp His Ala Arg Asp Lys Asp Gly Val Val Gly Ser Val Leu
340 345 350
Ser Ala Ile Ala Phe Ser Asn Tyr Asp Pro Tyr Glu Lys Leu Glu Glu
355 360 365
Leu Tyr Arg Lys Tyr Gly Tyr Tyr Met Glu Lys Leu Ile Asn Phe Lys
370 375 380
Phe Glu Asp Val Ser Lys Ala Ile Glu Ile Tyr Asn Ser Leu Lys Glu
385 390 395 400
Tyr Asp Gly Ile Ile Asp Tyr Ser Arg Gly Tyr Lys Gly Ile Ile Pro
405 410 415
Asn Glu Thr Ile Ala Phe Val Phe Glu Lys Ser Arg Ile Phe Val Arg
420 425 430
Pro Ser Gly Thr Glu Pro Lys Leu Lys Val Tyr Ile His Val Arg Gly
435 440 445
Asp Thr Arg Glu Glu Ser Glu Asn Leu Met Lys Glu Ser Glu Arg Lys
450 455 460
Ile Arg Glu Ile Leu Lys Leu
465 470
<210> 16
<211> 1416
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of phosphoglucomutase derived from Thermotoga
neapolitana (CT2)
<400> 16
atgatcctgt ttggaacggg tggaattcga ggtgtgatga gaaagggaga gttcgatgag 60
gacacggtga agagggcttc actgagcgtc gccttctgga tgaaacagag aaaactgaaa 120
agcgttgtga tcgcctacga cacgagaaaa aactccagag agttcgcaga gcttgccgga 180
agggtcttcg caggtgaagg aatagaagcc tacgtgtttc cagaaccaac gccaacaccg 240
gttctctctt tcgcagtgag gcacatgaag gccggtgccg gtgttgtcat aacagcgagt 300
cacaatcctc cagaatacaa cggatacaag gtttacacct gggatggcgt tcaggcaata 360
ccagagtaca cggacgagat caccgaaata tacaaaaagg tcgatatctc cggagtgagg 420
gagggaggtt tcaaacacgt accttccgag gtgaaggaga gttacataga gaaagtggtt 480
gagatagtct cgaaccttcc aagaagaacg gaccttgacg ttgcctactc tccactccat 540
ggaacgggag caaactatgt tccggaggtt ttgagaagac tcggtttcaa agtgagacct 600
gtggaagaac agatgaaacc cgatccaaac ttctccacag tcccaactcc aaatcccgaa 660
gaagatgaag cgctcgtttt gctgaacaaa aaggaagcga cccttggact tgcaaccgac 720
ccggactgcg acagggtggg agtggtgtac agaggaagaa ggctcacagg aaaccaggtt 780
ggagtgctcc ttacggactt tctcctcgaa cacgtgaagg tagaaaaccc tctcgtgata 840
aaaacgatcg tcaccacgga catggtgagg cccatctgtg aggaaagggg tgcctatctc 900
gaagaaacac caacaggttt caaattcatc ggtcatttga tagaagaaca cacaaagaaa 960
ggtgacagaa acttcgtctt tggtttcgag gaaagctgtg gatacctcgc aggagaccac 1020
gcaagggaca aagatggtgt tgtgggaagt gtcctctctg cgatagcctt cagcaactac 1080
gacccgtacg aaaaactcga agaactctac agaaagtacg gttactacat ggaaaaactc 1140
atcaacttca agttcgaaga cgtcagcaaa gcgatagaaa tatacaactc cctgaaagag 1200
tacgatggaa taatcgatta ctccagaggt tacaaaggaa taattccaaa cgaaaccata 1260
gccttcgtgt tcgaaaaatc cagaatcttc gtcagaccat ctggaacaga accgaagctc 1320
aaggtgtaca tccacgtgag aggggacaca agggaagagt cagagaatct gatgaaggaa 1380
agtgaaagaa agatcaggga gatcctgaaa ctgtga 1416
<210> 17
<211> 270
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polyphosphate-dependent glucokinase CJ dg ppgk
<400> 17
Met Leu Ala Ala Ser Asp Ser Ser Gln His Gly Gly Lys Ala Val Thr
1 5 10 15
Leu Ser Pro Met Ser Val Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser Gly
20 25 30
Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Thr Ala Thr Gly Lys Leu Val Ala Glu
35 40 45
Arg His Arg Ile Pro Thr Pro Glu Gly Ala His Pro Asp Ala Val Lys
50 55 60
Asp Val Val Val Glu Leu Val Arg His Phe Gly His Ala Gly Pro Val
65 70 75 80
Gly Ile Thr Phe Pro Gly Ile Val Gln His Gly His Thr Leu Ser Ala
85 90 95
Ala Asn Val Asp Lys Ala Trp Ile Gly Leu Asp Ala Asp Thr Leu Phe
100 105 110
Thr Glu Ala Thr Gly Arg Asp Val Thr Val Ile Asn Asp Ala Asp Ala
115 120 125
Ala Gly Leu Ala Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gly Ala Gly Val Pro Gly
130 135 140
Glu Val Leu Leu Leu Thr Phe Gly Thr Gly Ile Gly Ser Ala Leu Ile
145 150 155 160
Tyr Asn Gly Val Leu Val Pro Asn Thr Glu Phe Gly His Leu Tyr Leu
165 170 175
Lys Gly Asp Lys His Ala Glu Thr Trp Ala Ser Asp Arg Ala Arg Glu
180 185 190
Gln Gly Asp Leu Asn Trp Lys Gln Trp Ala Lys Arg Val Ser Arg Tyr
195 200 205
Leu Gln Tyr Leu Glu Gly Leu Phe Ser Pro Asp Leu Phe Ile Ile Gly
210 215 220
Gly Gly Val Ser Lys Lys Ala Asp Lys Trp Gln Pro His Val Ala Thr
225 230 235 240
Thr Arg Thr Arg Leu Val Pro Ala Ala Leu Gln Asn Glu Ala Gly Ile
245 250 255
Val Gly Ala Ala Met Val Ala Ala Gln Arg Ser Gln Gly Asp
260 265 270
<210> 18
<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of polyphosphate-dependent glucokinase CJ dg ppgk
<400> 18
atgctggcag ccagtgacag cagccagcat ggcgggaagg ctgttacgct atctcccatg 60
agcgtgatcc tcgggattga cataggtggg agcggcatca agggggcccc tgtggacacg 120
gcaaccggga agctggtggc cgagcgccac cgcatcccca cgcccgaggg cgcgcaccca 180
gacgcggtga aggacgtggt ggttgagctg gtgcggcatt ttgggcatgc ggggccagtc 240
ggcatcactt tccctggcat cgtgcagcac ggccataccc tgagcgcagc caatgtggat 300
aaagcctgga ttggcctgga cgccgacacg ctttttactg aggcgaccgg tcgcgacgtg 360
accgtgatca acgacgcaga tgccgcgggg ctagcggagg cgaggttcgg ggccggggca 420
ggtgtgccgg gcgaggtgtt gctgttgacc tttgggacag gcatcggcag cgcgctgatc 480
tataacggcg tgctggtgcc caacaccgag tttgggcatc tgtatctcaa gggcgacaag 540
cacgccgaga catgggcgtc cgaccgggcc cgtgagcagg gcgacctgaa ctggaagcag 600
tgggccaaac gggtcagccg gtacctccag tatctggaag gtctcttcag tcccgatctc 660
tttatcatcg gtgggggcgt gagcaagaag gccgacaagt ggcagccgca cgtcgcaaca 720
acacgtaccc gcctggtgcc cgctgccctc cagaacgagg ccggaatcgt gggggccgcg 780
atggtggcgg cgcagcggtc acagggggac taa 813
<210> 19
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Polyphosphate-dependent glucokinase CJ at ppgk
<400> 19
Met Gly Arg Gln Gly Met Glu Ile Leu Gly Ile Asp Ile Gly Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ile Lys Gly Ala Pro Val Asp Val Glu Thr Gly Gln Leu Thr Ala
20 25 30
Glu Arg Tyr Arg Leu Pro Thr Pro Glu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Val
35 40 45
Ala Leu Val Val Ala Gln Ile Val Glu His Phe Gln Trp Lys Gly Arg
50 55 60
Val Gly Ala Gly Phe Pro Ala Ala Ile Lys His Gly Val Ala Gln Thr
65 70 75 80
Ala Ala Asn Ile His Pro Thr Trp Ile Gly Leu His Ala Gly Asn Leu
85 90 95
Phe Ser Glu Lys Cys Gly Cys Pro Val Ser Val Leu Asn Asp Ala Asp
100 105 110
Ala Ala Gly Leu Ala Glu Met Ile Phe Gly Ala Gly Lys Gly Gln Lys
115 120 125
Gly Val Val Leu Met Ile Thr Ile Gly Thr Gly Ile Gly Thr Ala Leu
130 135 140
Phe Thr Asp Gly Ile Leu Val Pro Asn Thr Glu Leu Gly His Ile Glu
145 150 155 160
Ile Arg Gly Lys Asp Ala Glu Gln Arg Ser Ser Glu Ala Ala Arg Gln
165 170 175
Arg Lys Asp Trp Thr Trp Gln Gln Trp Ala Lys Arg Leu Asn Glu His
180 185 190
Leu Glu Arg Leu Glu Ala Leu Phe Trp Pro Asp Leu Phe Ile Leu Gly
195 200 205
Gly Gly Ala Val Lys Asn His Glu Lys Phe Phe Pro Tyr Leu Lys Leu
210 215 220
Arg Thr Pro Phe Val Ala Ala Lys Leu Gly Asn Leu Ala Gly Ile Val
225 230 235 240
Gly Ala Ala Trp Tyr Ala His Thr Gln Glu Thr Gln Ala
245 250
<210> 20
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of polyphosphate-dependent glucokinase CJ at ppgk
<400> 20
atggggaggc agggcatgga aattttaggg attgatatcg gaggatccgg catcaaaggg 60
gctccggtgg atgtagaaac cggccagtta accgccgagc gataccgctt acccaccccc 120
gaaaatgcct tacctgaaga agtggctctg gtagttgccc aaattgtcga acactttcag 180
tggaaaggtc gtgtaggggc aggatttcct gctgccatca agcacggcgt ggcacagacg 240
gccgcaaaca tccaccctac atggattgga cttcatgctg gcaacctttt cagcgaaaaa 300
tgcggatgtc ctgtctcagt gttgaatgat gcggatgctg ccggactggc ggaaatgatc 360
tttggggcag gaaaaggcca gaaaggggtg gtgctgatga ttaccattgg cactggcatc 420
gggacagccc tgttcaccga tgggatattg gtccctaata ccgagttggg acatattgaa 480
attcggggca aagatgccga acagcgctct tcggaagccg cccgccagcg gaaggattgg 540
acctggcaac aatgggcaaa gcgtctgaat gagcatttgg agcgcctgga agccctgttc 600
tggcccgatt tattcatcct tggtggaggg gcagtaaaaa atcatgaaaa gttcttccct 660
tatctaaaac tgcgtactcc ctttgttgca gcaaaattgg ggaatctggc tgggattgta 720
ggcgcagcgt ggtatgctca cacccaggaa acgcaagcct ga 762
<210> 21
<211> 823
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> a-glucanphosphorylase derived from Thermotoga neapolitana (CT1)
<400> 21
Met Leu Lys Lys Leu Pro Glu Asn Leu Glu His Leu Glu Glu Leu Ala
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Trp Trp Ser Trp Ser Arg Pro Ala Gln Arg Leu Trp Arg
20 25 30
Lys Ile Asp Pro Glu Gly Trp Glu Glu His Arg Asn Pro Val Lys Ile
35 40 45
Leu Lys Glu Val Ser Asp Glu Arg Leu Glu Glu Leu Ser Lys Asp Asp
50 55 60
Asp Phe Ile Ser Leu Tyr Glu Leu Thr Ile Glu Arg Phe Lys Asp Tyr
65 70 75 80
Met Glu Lys Glu Asp Thr Trp Phe Asn Val Asn Tyr Pro Glu Trp Asp
85 90 95
Glu Lys Ile Val Tyr Met Cys Met Glu Tyr Gly Leu Thr Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ile Tyr Ser Gly Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys
115 120 125
Ser Ala Ser Asp Leu Gly Leu Pro Leu Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr
130 135 140
Lys His Gly Tyr Phe Thr Gln Gln Ile Asp Arg Asp Gly Lys Gln Ile
145 150 155 160
Glu Ile Phe Pro Asp Tyr Asn Pro Glu Asp Leu Pro Met Lys Pro Leu
165 170 175
Lys Asp Glu Lys Gly Asn Gln Val Ile Val Glu Val Pro Leu Asp Ser
180 185 190
Thr Val Val Lys Ala Arg Val Phe Glu Val Lys Val Gly Arg Val Ser
195 200 205
Leu Tyr Leu Leu Asp Pro Asp Ile Glu Glu Asn Glu Glu Arg Tyr Arg
210 215 220
Lys Ile Cys Asn Tyr Leu Tyr Asn Pro Glu Pro Asp Val Arg Val Ser
225 230 235 240
Gln Glu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Gly Met Lys Leu Leu Arg Ala Leu
245 250 255
Asn Leu Lys Pro Gly Val Ile His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe
260 265 270
Ser Ser Leu Glu Arg Ile Lys Asn Tyr Met Glu Glu Gly Tyr Ser Phe
275 280 285
Thr Glu Ala Leu Glu Ile Val Arg Gln Thr Ser Val Phe Thr Thr His
290 295 300
Thr Pro Val Pro Ala Gly His Asp Arg Phe Pro Phe Asp Leu Val Glu
305 310 315 320
Lys Lys Leu Ser Lys Phe Phe Glu Gly Phe Glu Lys Arg Asn Leu Leu
325 330 335
Met Asp Leu Gly Lys Asp Glu Thr Gly Ser Phe Asn Met Thr Tyr Leu
340 345 350
Ala Leu Arg Thr Ser Ser Phe Ile Asn Gly Val Ser Lys Leu His Ala
355 360 365
Glu Val Ser Arg Arg Met Phe Lys Asn Val Trp Gln Gly Val Pro Val
370 375 380
Glu Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr Asn Gly Val His Met Gly Thr
385 390 395 400
Trp Ile Asn Arg Glu Met Arg Lys Leu Tyr Asp Arg Tyr Leu Gly Arg
405 410 415
Val Trp Arg Asp His Thr Asp Leu Glu Gly Ile Trp Tyr Gly Val Asp
420 425 430
Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Gln Ala His Leu Arg Ala Lys Lys
435 440 445
Arg Phe Ile Glu Tyr Ile Lys Glu Ser Val Arg Arg Arg Asn Glu Arg
450 455 460
Leu Gly Ile Asp Glu Asp Val Pro Asn Ile Asp Glu Asn Ser Leu Ile
465 470 475 480
Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr Tyr Lys Arg Ala Val Leu Leu
485 490 495
Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys Ile Leu Asn Asp Pro Glu Arg
500 505 510
Pro Val Tyr Val Val Tyr Ala Gly Lys Ala His Pro Arg Asp Asp Ala
515 520 525
Gly Lys Glu Phe Leu Lys Arg Ile Tyr Glu Val Ser Gln Met Pro Glu
530 535 540
Phe Lys Asn Arg Ile Ile Val Leu Glu Asn Tyr Asp Ile Gly Met Ala
545 550 555 560
Arg Leu Met Val Ser Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg
565 570 575
Pro Met Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ala Ala Asn Gly
580 585 590
Val Leu Asn Ala Ser Val Tyr Asp Gly Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn
595 600 605
Gly Arg Asn Gly Trp Val Ile Gly Asp Glu Ser Val Leu Pro Glu Thr
610 615 620
Glu Val Asp Asp Pro Arg Asp Ala Glu Ala Leu Tyr Asp Leu Leu Glu
625 630 635 640
Asn Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Glu Asn Lys Glu Lys Trp Ile Phe
645 650 655
Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Val Ala Pro Arg Phe Ser Thr Thr
660 665 670
Arg Met Leu Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Phe Tyr Ile Lys Gly Leu Val
675 680 685
Asn Lys Glu Trp Leu Glu Arg Lys Glu Asn Ala Glu Arg Phe Gly Ala
690 695 700
Trp Lys Glu Arg Ile Leu Arg Asn Trp Ser Ser Val Ser Ile Glu Arg
705 710 715 720
Ile Val Leu Glu Asp Thr Arg Ser Val Glu Val Thr Val Lys Leu Gly
725 730 735
Asp Leu Ser Pro Asp Asp Val Leu Val Glu Leu Leu Ile Gly Arg Gly
740 745 750
Glu Ser Met Glu Asp Leu Glu Ile Trp Lys Val Ile Gln Ile Arg Lys
755 760 765
His Arg Arg Glu Gly Asp Leu Phe Ile Tyr Ser Tyr Val Asn Gly Ala
770 775 780
Leu Gly His Leu Gly Ser Pro Gly Trp Phe Tyr Ala Val Arg Val Leu
785 790 795 800
Pro Tyr His Pro Lys Leu Pro Thr Arg Phe Leu Pro Glu Ile Pro Val
805 810 815
Val Trp Lys Lys Val Leu Gly
820
<210> 22
<211> 2472
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of a-glucanphosphorylase derived from Thermotoga
neapolitana (CT1)
<400> 22
atgctgaaga aactcccgga gaatctggag catctggaag aactcgccta caacctctgg 60
tggagctggt ctaggcccgc tcagagactc tggagaaaga tagatccgga aggctgggag 120
gaacacagaa accccgttaa aatactgaaa gaagtttctg atgaaaggct cgaagaactt 180
tcaaaagatg atgatttcat atccctctac gaactcacca ttgaaaggtt caaggattac 240
atggagaaag aagacacctg gttcaacgtg aactaccccg aatgggacga gaagatcgtc 300
tacatgtgta tggagtacgg tttgaccaaa gcccttccga tctactccgg tggtcttgga 360
atcctcgcgg gagaccatct caaatccgca agcgatcttg gacttcctct catagcgatc 420
ggacttctct acaaacatgg atatttcacc cagcagatcg acagagatgg aaaacagata 480
gagattttcc ctgattacaa cccagaggac ttacccatga agcccctgaa ggatgaaaag 540
ggaaaccagg tgatcgtgga ggttcctctc gacagtaccg tggtgaaggc acgtgttttt 600
gaagtgaagg taggaagggt gagtctgtac ctgctcgatc cggacatcga ggaaaacgag 660
gaacgataca gaaagatctg caactacctt tacaacccgg aacccgatgt gagggtctcc 720
caggagatac tcctcggaat tgggggaatg aagcttctca gggctctgaa cctgaaacca 780
ggagtcatcc atctgaacga aggacatccg gcgttctctt ccctcgaaag gataaagaac 840
tacatggaag aaggatattc cttcacagag gcccttgaga tcgtgagaca gacgagtgtg 900
tttacaaccc acacacccgt tcccgctgga cacgacagat ttccctttga cctcgtggaa 960
aagaaacttt cgaaattctt cgaaggattc gaaaagagaa atcttctcat ggatcttggg 1020
aaagatgaaa caggcagttt caacatgacg tatcttgccc tgagaacgtc ctctttcata 1080
aacggcgtga gcaaactgca tgcggaagtt tccagaagga tgttcaaaaa cgtgtggcag 1140
ggtgttcccg tggaggaaat accgatcgaa gggataacga acggcgttca catgggaacc 1200
tggatcaacc gtgagatgag aaaactgtac gacagatatc tcggaagggt atggagagat 1260
cacaccgacc ttgagggtat ctggtacggt gttgacagga ttccagatga agaactctgg 1320
caggctcacc tgagggcaaa gaagagattc atcgagtaca taaaagaatc ggtaagaaga 1380
agaaacgaga gactgggaat cgacgaagat gtgccgaaca tcgatgaaaa ttcgctcatc 1440
ataggttttg caagaaggtt tgccacttac aagagggcag ttctcctgct cagcgatctg 1500
gagagactca agaagatcct caacgatcca gaaagacccg tttacgtggt ctatgcgggg 1560
aaggcccatc caagggacga tgcggggaag gaatttttga aacgcatcta cgaagtctcg 1620
cagatgcctg agttcaaaaa caggatcatc gtactggaaa actacgacat tggaatggca 1680
cggctcatgg tgtcgggagt ggatgtgtgg ctgaacaacc cgagaagacc catggaagca 1740
agtggaacaa gcggaatgaa ggcagcagcc aacggagttc ttaacgcgag tgtttacgat 1800
ggatggtggg ttgaagggta caacggcaga aacggctggg tcataggcga tgaaagcgtt 1860
cttccagaga cggaagtgga cgatcccagg gacgcagaag cactctacga tctcctcgaa 1920
aacgaaatca tcccaaccta ctacgaaaac aaagaaaagt ggatcttcat gatgaaagag 1980
agcataaaga gtgttgctcc aagattcagc accaccagaa tgctcaaaga atacacggag 2040
aagttctaca taaagggact tgtgaacaaa gaatggcttg aaagaaaaga aaacgccgaa 2100
aggtttggtg catggaagga aaggatcctc agaaactgga gcagcgtttc catagaaaga 2160
atcgtccttg aggacacaag gagtgttgag gtgacggtga aactgggaga cctttcacct 2220
gatgatgtac tggttgaact tttgattgga agaggagaaa gcatggaaga tctggagatc 2280
tggaaggtga tacagataag aaagcacaga agggaagggg atctgttcat ctacagttat 2340
gtcaacggtg ccctcggtca tcttggctct ccgggatggt tctacgcggt gagggtgcta 2400
ccttatcatc cgaaacttcc caccagattc ttgccggaga tacctgtggt gtggaaaaag 2460
gttctcgggt ga 2472
<210> 23
<211> 441
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-a-glucanotransferase derived from Thermotoga maritima(TN2)
<400> 23
Met Ile Gly Tyr Gln Ile Tyr Val Arg Ser Phe Arg Asp Gly Asn Phe
1 5 10 15
Asp Gly Val Gly Asp Phe Lys Gly Leu Lys Gly Ala Ile Ser Tyr Leu
20 25 30
Lys Glu Leu Gly Val Asp Phe Val Trp Leu Met Pro Val Phe Ser Ser
35 40 45
Ile Ser Phe His Gly Tyr Asp Val Val Asp Phe Tyr Ser Phe Lys Ala
50 55 60
Glu Tyr Gly Asp Glu Lys Asp Phe Arg Glu Met Ile Glu Ala Phe His
65 70 75 80
Asp Asn Gly Ile Lys Val Val Leu Asp Leu Pro Ile His His Thr Gly
85 90 95
Phe Leu His Val Trp Phe Gln Lys Ala Leu Lys Gly Asp Pro His Tyr
100 105 110
Arg Asp Tyr Tyr Val Trp Ala Ser Glu Lys Thr Asp Leu Asp Glu Arg
115 120 125
Arg Glu Trp Asp Asn Glu Arg Ile Trp His Pro Leu Glu Asp Gly Arg
130 135 140
Phe Tyr Arg Gly Leu Phe Gly Pro Leu Ser Pro Asp Leu Asn Tyr Asp
145 150 155 160
Asn Pro Gln Val Phe Glu Glu Met Lys Lys Val Val Tyr His Leu Leu
165 170 175
Glu Met Gly Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ala Lys His Met Arg
180 185 190
Asp Thr Leu Glu Gln Asn Val Arg Phe Trp Arg Tyr Phe Leu Ser Asp
195 200 205
Ile Glu Gly Ile Phe Leu Ala Glu Ile Trp Ala Glu Ser Lys Val Val
210 215 220
Asp Glu His Gly Arg Ile Phe Gly Tyr Met Leu Asn Phe Asp Thr Ser
225 230 235 240
His Cys Ile Lys Glu Ala Val Trp Lys Glu Asn Phe Lys Val Leu Ile
245 250 255
Glu Ser Ile Glu Arg Ala Leu Val Gly Lys Asp Tyr Leu Pro Val Asn
260 265 270
Phe Thr Ser Asn His Asp Met Ser Arg Leu Ala Ser Phe Glu Gly Gly
275 280 285
Leu Ser Glu Glu Lys Val Lys Leu Ser Leu Ser Ile Leu Phe Thr Leu
290 295 300
Pro Gly Val Pro Leu Ile Phe Tyr Gly Asp Glu Leu Gly Met Lys Gly
305 310 315 320
Ile Tyr Arg Lys Pro Asn Thr Glu Val Val Leu Asp Pro Phe Pro Trp
325 330 335
Ser Glu Asn Met Cys Val Glu Gly Gln Thr Phe Trp Lys Trp Pro Ala
340 345 350
Tyr Asn Asp Pro Phe Ser Gly Val Ser Val Glu Tyr Gln Arg Arg Asn
355 360 365
Arg Asp Ser Ile Leu Ser His Thr Met Arg Trp Ala Gly Phe Arg Gly
370 375 380
Glu Asn His Trp Leu Asp Arg Ala Asn Ile Glu Phe Leu Cys Lys Glu
385 390 395 400
Glu Lys Leu Leu Val Tyr Arg Leu Val Asp Glu Gly Arg Ser Leu Lys
405 410 415
Val Ile His Asn Leu Ser Asn Gly Glu Met Val Phe Glu Gly Val Arg
420 425 430
Val Gln Pro Tyr Ser Thr Glu Val Val
435 440
<210> 24
<211> 1326
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of 4-a-glucanotransferase derived from Thermotoga
maritima(TN2)
<400> 24
atgataggct accagatcta cgtgagatca ttcagggatg gaaacttcga tggtgtgggg 60
gatttcaaag gattgaaagg tgcgatttcc tacctgaaag aactgggtgt tgattttgtc 120
tggctcatgc ccgtcttttc ctccatttcc ttccacgggt atgacgtggt ggatttttat 180
tctttcaaag ccgagtacgg agacgagaaa gactttagag agatgatcga ggcgttccac 240
gacaacggta taaaagtcgt tctcgatctt cccatccatc atactggttt cctccatgtg 300
tggtttcaga aagccctgaa aggagatcca cactacaggg attattacgt atgggcgagt 360
gaaaaaacgg atctggacga aagaagagag tgggacaacg aaaggatctg gcatcctctg 420
gaggacggaa ggttctacag aggacttttc ggtcccctct cacccgatct gaactacgat 480
aacccgcagg tttttgaaga gatgaagaag gtggtttatc accttcttga aatgggagtg 540
gacggattca gattcgacgc agcaaagcac atgagagata ctctggaaca gaacgttcgc 600
ttttggaggt atttcctctc cgatattgag ggaatattcc ttgcggaaat ctgggcagaa 660
tccaaagttg tggatgaaca cggcaggata ttcggctaca tgctaaattt cgatacctca 720
cactgtatta aggaagcggt gtggaaggaa aacttcaaag tgttgatcga gtcgatcgaa 780
agggccctgg ttggaaaaga ttatctgccg gtgaacttca catcgaacca tgatatgtca 840
aggcttgcga gtttcgaagg agggttgagt gaagagaagg tgaaactctc actttccatt 900
ctgttcacgc ttcccggggt tcctctcata ttctacggag acgaactggg aatgaaagga 960
atctatcgaa aaccgaacac ggaagtcgtg ctggatccgt tcccctggag cgaaaacatg 1020
tgtgttgaag gccagacatt ttggaaatgg cccgcgtata acgatccatt ctccggtgtt 1080
tctgttgagt atcagaggag aaatcgtgat tcgattctct cacacacgat gaggtgggca 1140
ggattcagag gggaaaatca ctggctggac agggcaaaca tcgaatttct gtgcaaagaa 1200
gaaaaactgc tcgtgtacag actggtcgat gaagggcgtt ctctgaaagt gatacacaac 1260
ctgtcgaatg gtgaaatggt gtttgaggga gtgcgcgtac aaccctacag cacggaggtg 1320
gtttga 1326
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer DNA sequence of CT1
<400> 25
aggagaaact catatgctga agaaactccc ggag 34
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer DNA sequence of CT1
<400> 26
agccccctcg agcccgagaa c 21
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer DNA sequence of CT2
<400> 27
aaagggcata tgatcctgtt tggaac 26
<210> 28
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer DNA sequence of CT2
<400> 28
ataccagtct cgagcagttt caggatc 27
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer DNA sequence of TN1
<400> 29
ttactgaggg catatgaaaa agatggcttt gaaa 34
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer DNA sequence of TN1
<400> 30
aagacgcgtc gacttctatg atcaccttct 30
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer DNA sequence of TN2
<400> 31
atagagggca tatgataggc taccagatct a 31
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer DNA sequence of TN2
<400> 32
atcttcatct cgagaaccac ctcc 24
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer DNA sequence of T4
<400> 33
ttttcatatg gagggaggga tcgaattg 28
<210> 34
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer DNA sequence of T4
<400> 34
catactcgag cttcccctct cctatct 27
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