阅读说明：本技术 乌骨藤提取物c21甾体在制备促进胃癌细胞凋亡药物中的应用 (Application of glaucescent fissistigma root extract C21 steroid in preparation of medicine for promoting gastric cancer cell apoptosis ) 是由 张威 王震 应优敏 李凯强 张昱 陈以栗 郝珂 于 2020-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种C21甾体在制备促进癌细胞凋亡药物中的应用,所述C21甾体通过抑制自噬促进细胞凋亡而抑制细胞的增殖。还公开了一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用,所述C21甾体为乌骨藤提取物,所述C21甾体通过抑制自噬促进凋亡而抑制胃癌细胞增殖。本发明公开的C21甾体可显著抑制癌细胞生长和促进细胞凋亡的发生,为揭示C21甾体抗胃癌活性的新机制提供理论基础。(The invention discloses application of a C21 steroid in preparation of a medicine for promoting cancer cell apoptosis, wherein the C21 steroid inhibits cell proliferation by inhibiting autophagy to promote cell apoptosis. The C21 steroid is a glaucescent fissistigma root extract, and the C21 steroid inhibits gastric cancer cell proliferation by inhibiting autophagy and promoting apoptosis. The C21 steroid disclosed by the invention can obviously inhibit the growth of cancer cells and promote the occurrence of apoptosis, and provides a theoretical basis for disclosing a new mechanism of the anti-gastric cancer activity of the C21 steroid.)

乌骨藤提取物C21甾体在制备促进胃癌细胞凋亡药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及乌骨藤提取物C21甾体在制备促进胃癌细胞凋亡药物中的应用。

背景技术

胃癌是全球第三大最常见的癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。缺乏有效的治疗手段导致癌症患者生存周期短和生活质量差。并且目前，主要是通过手术切除和化疗治疗胃癌患者，但其治疗效果有限。因此，迫切需要开发新的治疗方案来改善患者的预后。

自噬是一种保守的真核分解代谢反应，它可以分解代谢细胞质蛋白和细胞器。作为一种细胞保护过程，它有助于维持癌细胞的稳态，并在恶劣环境下作为替代能源。这表明自噬在肿瘤的发展中可能具有保护作用。最近的研究表明，关键的自噬基因，包括自噬相关基因(ATG)，可以通过细胞死亡引起细胞ROS损伤。Cully et.发现调节抑癌基因PTEN和p53的表达可以积极地调节自噬。众所周知，像BCL2抗凋亡蛋白这样的癌基因产物与进化上保守的自噬蛋白相互作用，与Beclin-1结合可能有助于将自噬维持在与细胞生存兼容的水平。关于胃癌，最近有研究表明自噬对疾病有双重影响。许等人研究表明抗癌药物木通皂苷PA通过激活自噬和凋亡来促进AGS细胞的凋亡。相反，另一项研究报告称，自噬抑制剂的使用增强了抗癌药物在胃癌细胞系SGC-7901中的细胞毒性。因此，自噬可能是治疗胃癌的潜在治疗靶点。

乌骨藤(Marsdenia Tenacissima)是一种瓜馥木属植物，在我国广泛生产，其液体提取物(商品名：消癌平)已被批准用于治疗食管癌、肺癌、白血病、肝癌和胃癌。已经发现MTE中富含C21甾体苷，FR5组分处理可以通过PTEN-AKT-mTOR信号通路诱导细胞凋亡。然而，C21甾体对自噬的潜在功效以及自噬抑制是否能促进C21的抗癌作用尚未被研究。

因此，本发明主要检查C21甾体是否可以诱导自噬，以及自噬抑制是否有助于C21提取物的抗癌作用，同时还探索了诱导自噬的潜在分子机制。

发明内容

本发明的目的是提供一种C21甾体在制备增强癌细胞凋亡药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，C21甾体可以明显的抑制癌细胞生长和促进细胞凋亡，以抑制细胞增殖。

本发明的目的还提供一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用，C21甾体具有诱导胃癌细胞凋亡和自噬增加的作用，为揭示C21甾体抗胃癌活性的新机制提供理论基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种C21甾体在制备促进癌细胞凋亡药物中的应用，所述C21甾体通过抑制自噬促进细胞凋亡而抑制癌细胞的增殖。

优选的是，所述C21甾体通过激活AKT促进自噬途径发生。

优选的是，所述C21甾体为乌骨藤提取物。

优选的是，所述癌细胞为胃癌细胞。

本发明还提供一种C21甾体在制备治疗胃癌药物中的应用，所述C21甾体为乌骨藤提取物，所述C21甾体通过抑制自噬促进凋亡而抑制胃癌细胞的增殖。

本发明公开了以下技术效果：

由于PI3K/Akt通路的激活已被证明在许多类型的肿瘤中，它有助于肿瘤细胞的增殖和存活。在本发明中，通过实验验证经C21甾体处理的BGC-823和AGS细胞中p-AKT的显著减少，表明C21甾体可能通过PTEN-AKT信号通路诱导细胞凋亡。并且发明人在先前的研究中证实，乌骨藤提取物C21甾体可以通过PTEN/AKT/mTOR信号通路诱导肝癌细胞凋亡。PI3K/Akt/mTOR途径已被证明在调节自噬中起到负面作用，它的下降实际上会激活自噬；还发现自噬相关蛋白(ATG)在调节自噬相关基因编码的自噬小体的形成中起着特殊的作用。在本发明中，自噬相关蛋白ATG5和Beclin-1在C21甾体诱导自噬时增加，当自噬抑制发生时降低，进一步表明C21甾体可以激活胃癌细胞中的自噬，说明C21甾体可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路在胃癌细胞中诱导保护性自噬。本发明表明C21甾体可抑制胃癌细胞增殖，诱导胃癌细胞凋亡和自噬；具体的，C21甾体通过抑制自噬而增强胃癌细胞凋亡，部分归因于AKT的激活，因此，C21甾体将成为是从天然化合物中提取的用于治疗胃癌的一种新的候选药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为C21甾体抑制胃癌细胞增殖作用；a-c分别为不同浓度C21甾体抑制BGC-823、SGC-7901和AGS细胞增殖结果：用C21甾体(0，40，80，160μg/mL处理胃癌细胞，用GraphPad的Prism软件分析实时细胞检测仪结果；用C21甾体(0，20，40，80，160，320μg/ml)处理胃癌细胞，用GraphPad的Prism软件分析MTS结果，P<0.05，vs NC；

图2为用0，80μg/mL和160μg/mL C21甾体处理24h，诱导胃细胞BGC823和AGS细胞周期阻滞和凋亡；a：用染色缓冲液A和试剂B染色后，用流式细胞仪测定细胞计数(％)；b:细胞周期统计图；c：用Annexin-V-异硫氰酸荧光素(FITC)和PI染色后，用流式细胞仪测定细胞凋亡率；左下角显示正常比率，右下角显示早期凋亡，右上角显示晚期凋亡；d：细胞凋亡率统计图；e：蛋白质印迹分析测定cleaved-PARP蛋白水平，以β-肌动蛋白为对照；f：Cleaved-PARP的表达率统计；*P<0.05，vs NC；

图3为C21甾体处理促进胃癌自噬的发生；a：在没有或存在CQ(20μM)的情况下用C21甾体(100μg/mL)处理24h后，共聚焦显微镜观察到绿色荧光蛋白-LC3(绿色)的共定位；b：将细胞暴露于C21甾体(120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，采用western blot分析测定LC3蛋白水平，以GAPDH作为对照；c：定量LC3-II的表达率统计；*P<0.05，vs NC；

图4为C21甾体联合CQ促进细胞凋亡；a：用Annexin-V-FITC和PI染色后，用流式细胞仪测定细胞凋亡率；左下角为正常比率，右下角为早期凋亡，右上角为晚期凋亡；b：分别定量细胞凋亡百分率；C：DCFH-DA染色后，定量测定ROS水平；a-b：将细胞暴露于C21甾体(120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，用western blot分析自噬相关蛋白，以GAPDH作为对照；c：量化Beclin-1的表达率；d：定量ATG-5的表达率；e：定量BCL-2的表达率；*P<0.05，vs NC；

图5为C21甾体通过AKT信号通路干扰自噬；a-b：分别为BGC-823和AGS细胞暴露于C21甾体(120μg/mL)和CQ(20μM)作用24h后，通过Western blot分析确定与凋亡相关的蛋白，并以GAPDH作为对照；c：量化Beclin-1的表达率；d：定量ATG-5的表达率；e：量化p-AKT的表达率；*P<0.05，vs NC。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

材料与方法

胎牛血清(FBS)和Roswell Park Memorial Institute 1640培养基RPMI1640购自HyClone。

来自乌骨藤提取物的C21甾体由浙江工业大学药学院实验室提供。

GFP-LC3质粒由浙江省人民医院临床实验室提供。

3-(45-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium内盐(MTS)购自PROMEGA。

氯喹二磷酸盐购自Sangon Biotech。

BGC-823，SGC-7901和AGS细胞-人胃癌细胞-来自浙江省人民医院临床实验室。所有细胞在Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI1640，HyClone)，添加10％胎牛血清(FBS，HyClone)中培养。所有细胞均培养在37℃、5％CO₂的培养箱。

实施例1

C21甾体对胃癌细胞增殖的抑制作用

将50μL培养基添加到E-plate 96(罗氏)的每个孔中以获得平衡；然后将2000个细胞接种在E-plate 96中。24小时后，分别加入40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL的C21甾体，并将E-plate 96锁定在RTCA-MP装置中，温度为37℃，CO₂浓度为5％，记录电阻抗的测量变化，这些变化直接反映了生物相容微电极涂层表面上的细胞增殖，每两分钟自动读取。

将5000个细胞接种在含200μL RPIM1640培养基的96孔板中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，然后用C21甾体(0、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL)处理，培养24h；每孔再加入40μL MTS溶液，孵育2h，用微板读取器在490nm处测量吸光度。

结果如图1所示：RTCA生长曲线显示，C21甾体以浓度和时间依赖性的方式极大地抑制BGC-823，SGC-7901和AGS细胞(图1a至c)的细胞增殖。如图1d所示，MTS法检测了BGC-823、SGC-7901和AGS细胞中的IC₅₀。结果表明，C21甾体显著抑制胃癌细胞增殖，并呈剂量依赖性。BGC-823细胞的IC₅₀为80.57μg/mL，SGC-7901细胞的IC₅₀为146.3μg/mL，AGS细胞的IC₅₀为102.8μg/mL。

上述结果表明C21甾体刺激对BGC-823，SGC-7901和AGS细胞的增殖有明显的抑制作用。

实施例2

诱导胃癌细胞BGC-823和AGS的细胞周期阻滞和细胞凋亡

将细胞接种到在37℃孵育24h的12孔板中，然后用C21甾体(0、80μg/mL、160μg/mL)处理细胞，并在37℃下培养24h，收集细胞，用500μL染色缓冲液A和5μL试剂B(联科生物技术)处理，再将这些细胞在黑暗中室温培养30min，用流式细胞仪分析细胞周期。

用Annexin-V-FITC和PI(联科生物技术)双染色检测凋亡细胞百分率，然后以与细胞周期分析中使用的细胞培养物相同的方式处理它们。收集细胞，用5μL Annexin V-FITC和10μL PI处理，然后在室温下在黑暗中培养5min，用流式细胞仪分析荧光激活的细胞。

结果如图2a和b所示：本发明采用流式细胞术分析了处理细胞的细胞周期时相分布，结果表明，160μg/mL C21甾体通过降低G0/G1期细胞百分率(160μg/mL C21甾体组分别为55.13％±1.14％和53.12％±3.44％，对照组分别为66.33％±1.37％和66.83％±2.26％)，而使G2/M期细胞比例增加(160μg/mL C21甾体组分别为16.68％±0.93％和15.37％±0.48％，对照组分别为7.74％±0.39％和5.65％±0.30％)，显著抑制了BGC823和AGS细胞的细胞周期进程。

如图2c和d所示，流式细胞术分析确定细胞生长抑制是否通过凋亡。用不同剂量的C21甾体处理24h的胃癌细胞以剂量依赖的方式引起细胞凋亡，特别是晚期凋亡。具体地，C21甾体处理使BGC-823细胞的凋亡率从对照组的3.770％±0.393％增加到5.133％±0.365％(80μg/mL)和12.802％±2.090％(160μg/mL)；在AGS细胞中，细胞凋亡率从对照组的3.773％±0.287％增加到7.465％±0.100％(80μg/mL)和13.075％±0.928％(160μg/mL)。

如图2e和f所示，western blot分析检测与凋亡相关的蛋白。C21甾体处理24h后，BGC-823和AGS两种细胞系中Cleaved-PARP均增加，表明细胞凋亡可能有助于胃癌细胞中C21甾体对细胞生长的抑制。

实施例3

活性氧(ROS)测量

细胞在单独存在或不存在C21甾体或与自噬抑制剂CQ共同培养24h。采集细胞并在500μL PBS中重新悬浮后，按照制造商的说明(Beyotime)用DCFH-DA(5mm)染色30min，然后用流式细胞术分析DCFH-DA信号。

为探讨C21甾体诱导的自噬在细胞存活或死亡中的生物学作用，用自噬抑制剂CQ阻断胃癌细胞的自噬，用C21甾体单独或联合CQ处理胃癌细胞24h。如图4所示：细胞凋亡实验表明CQ促进C21甾体诱导的胃癌细胞凋亡。如图4a和4b所示，与对照组相比，BGC-823细胞凋亡的百分比增加了11.20％±1.69％(C21甾体)和17.70％±0.39％(C21甾体+CQ)。AGS细胞凋亡百分率分别增加8.79±0.54％(C21甾体)和12.78％±1.23％(C21甾体+CQ)。

在单独或与CQ联合使用C21甾体治疗24h后，测量胃癌细胞内ROS的产生。如图4c所示，与对照细胞相比，处理期间细胞内ROS的产生增加。与对照组相比，BGC-823细胞的ROS水平分别为对照组的1.512±0.103倍(C21甾体)，3.766±0.724倍(CQ组分)，4.915±0.077倍(C21甾体+CQ组)。AGS细胞内ROS水平分别为对照组的1.227±0.088倍(C21甾体)，1.698±0.104倍(CQ组分)，2.848±0.396倍(C21甾体+CQ组分)。

实施例4

共聚焦显微镜用于检测LC3-II斑点

根据制造商的方案，使用转染试剂(YEASEN)将粘附在载玻片上的细胞转染GFP-LC3质粒。转染24h后，用C21甾体单独或用CQ处理细胞，孵育24h，再用DAPI和抗淬灭剂(1：1000，Beyotime)对细胞进行染色，并用共聚焦显微镜(Leica)观察。

结果显示：为了评估LC3-II在C21甾体处理后对自噬小体的募集反应。如图3a所示，在细胞质中C21甾体处理的细胞中观察到点状LC3模式，而未处理的对照细胞显示弥散而弱的LC3点状斑点。

LC3的脂化形式从LC3-I转化为LC3-II是自噬的特征。如图3b和3c所示，LC3-II在暴露于C21甾体后在胃癌细胞系中积累；此外，与自噬抑制剂CQ共处理，阻断了自噬降解的最后一步，增强了C21甾体诱导的LC3-II积累。

实施例5

Western Blot分析自噬通量蛋白

将用C21甾体处理的细胞接种到12孔板中，培养24h。用细胞总蛋白提取试剂盒(RIPA，Beyotime)提取总蛋白。用12％SDS-PAGE电泳来自每个样品的等量蛋白质，并将其转移到PVDF膜上。封闭后，膜与抗PTEN(1：1000；CST)、抗Bax(1：1000；CST)、抗Bcl-2(1：1000；CST)、抗AKT(1：1000；CST)、抗P-ARP(1：1000；CST)孵育；抗LC3(1：1000；CST)，抗Beclin-1(1：1000；CST)，在4℃下过夜，然后用PBS/0.1％Tween-20洗涤三次，每次持续10min，然后将其与相应的二抗(1：2000，华安生物)在室温下孵育1h，然后再次洗涤三次，每次10min。使用化学发光ECL试剂盒(Fude生物技术)检测膜。

采用western blot分析检测胃癌细胞中凋亡相关蛋白的水平。如图4所示，与对照组相比，C21甾体处理促进了两种细胞系中Cleaved-PARP和Bax的蛋白质表达；BCL-2蛋白表达明显降低。用western blot分析检测胃癌细胞中自噬相关蛋白的水平。如图5所示，CQ降低了C21甾体诱导的Beclin-1和A TG-5蛋白的积累；相反，p-AKT的表达明显降低，这种现象在两种胃癌细胞中都是一致的。

上述实施例1-5所有的测定都在至少三个独立的实验中进行。使用image J软件对western blot分析结果进行分析。所有数据使用GraphPad的PRISM软件进行分析，所有值均以平均值±SD表示。统计学差异采用独立t检验和单因素方差分析进行评估。差异的显著性设置为p<0.05。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。