阅读说明：本技术 亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法 (Hydrophilic interaction chromatography-reversed phase chromatography combined two-dimensional liquid phase system and analysis method thereof ) 是由 邝江濛 钟启升 刘佳琪 黄海宏 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法,该系统包括亲水作用色谱柱、反相色谱柱、检测器、自动进样器、第一泵组件、第二色谱泵、第三色谱泵、混合器、样品环和切换阀；所述第一泵组件与所述亲水作用色谱柱接通,所述第二色谱泵和第三色谱泵分别与所述混合器接通,所述混合器与所述反相色谱柱接通；所述切换阀至少具备以下2种连接状态：连接状态1：将检测器的入口与亲水作用色谱柱的出口接通,并将样品环的两个端口分别与第二色谱泵、混合器接通；连接状态2：将检测器与反相色谱柱接通,并将样品环的两个端口分别与亲水作用色谱柱和系统外接通。该系统可实现对极性差异较大的多组分目标物的一次性分析。(The invention relates to a hydrophilic interaction chromatography-reversed phase chromatography combined two-dimensional liquid phase system and an analysis method thereof, wherein the system comprises a hydrophilic interaction chromatography column, a reversed phase chromatography column, a detector, an automatic sample injector, a first pump assembly, a second chromatography pump, a third chromatography pump, a mixer, a sample ring and a switching valve; the first pump assembly is communicated with the hydrophilic interaction chromatographic column, the second chromatographic pump and the third chromatographic pump are respectively communicated with the mixer, and the mixer is communicated with the reverse phase chromatographic column; the switching valve has at least the following 2 connection states: connection state 1: connecting the inlet of the detector with the outlet of the hydrophilic interaction chromatographic column, and connecting two ports of the sample ring with the second chromatographic pump and the mixer respectively; connection state 2: the detector was connected to the reverse phase column and the two ports of the sample loop were connected to the hydrophilic interaction column and outside the system, respectively. The system can realize one-time analysis of multi-component targets with large polarity differences.)

亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法

技术领域

本发明涉及仪器分析领域，特别是涉及亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法。

背景技术

在代谢组学、环境、农兽残分析等领域，通常需要分析多种目标物质，当各目标物极性差异过大时，则难以用一个方法完成对所有物质的分析。面对这一问题，通常是采用两种分析方法、两种色谱柱(如亲水作用色谱柱和反相色谱柱)分别完成强极性物质和弱极性物质的分析。这样的处理方式耗时耗力，且会产生多一倍的冗余数据，不利于提高分析效率。

在线二维液相色谱系统，是通过管路的连接、阀的切换将不同的特性的色谱柱连接在一起，从而将第一维无法分离的物质导入第二维进一步分析，提高分离度与峰容量。基于原理及连接方式的区别，二维液相色谱系统种类多样。随着技术的不断成熟，二维液相色谱系统已越来越多地用于复杂样品的分析。

发明内容

本发明提供一种亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，该系统以切换阀作为连接中枢，将亲水作用色谱与反相色谱连接起来，实现对极性差异较大的多组分目标物的一次性分析。

本发明采取的技术方案如下：

一种亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，包括亲水作用色谱柱、反相色谱柱、检测器、自动进样器、第一泵组件、第二色谱泵、第三色谱泵、混合器、样品环和切换阀；

所述第一泵组件用于推送载样溶液以及对亲水作用色谱柱梯度洗脱，所述第一泵组件的出口与所述亲水作用色谱柱的入口接通，所述自动进样器设于所述第一泵组件与亲水作用色谱柱之间的连接管路上；

所述第二色谱泵和第三色谱泵用于对反相色谱柱梯度洗脱，所述第二色谱泵的出口通过所述切换阀与所述混合器的入口接通，所述第三色谱泵的出口与所述混合器的入口接通，所述混合器的出口与所述反相色谱柱的入口接通；

所述亲水作用色谱柱的出口、所述反相色谱柱的出口、所述检测器的入口以及所述样品环的两个端口，分别与所述切换阀连接；

所述切换阀通过其位置切换至少具备以下2种连接状态：

连接状态1：所述切换阀将所述检测器的入口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，并将所述样品环的一个端口与所述第二色谱泵的出口接通，另一个端口与所述混合器的入口接通；

连接状态2：所述切换阀将所述检测器的入口与所述反相色谱柱的出口接通，并将所述样品环的一个端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，另一个端口连接至系统外。

通过该切换阀的切换，能够先后实现亲水作用色谱模式(第一维)和反相色谱模式(第二维)；所述切换阀切换至该连接状态1时，系统的流路可完成亲水作用色谱柱上样或强极性物质分离检测的过程，所述切换阀切换至该连接状态2时，系统的流路可完成弱极性物质收集或弱极性物质分离检测的过程。

本发明所述的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，以切换阀作为连接中枢，将亲水作用色谱柱与反相色谱柱连接起来，所述亲水作用色谱柱具有保留、分离强极性物质的特性，而所述反相色谱柱具有保留、分离弱极性物质的特性。本发明使用简单的硬件设备和连接流路设计得到的所述系统，实现了一针进样完成对弱极性到强极性物质的分离，并可以与紫外检测器或质谱检测技术联用进行分析。

具体地，所述切换阀由两个六通阀连接组成。

具体地，所述切换阀为一个十通阀，系统的搭建更加简单。

具体地，所述样品环的两个端口分别为第一端口和第二端口；在所述连接状态1中，所述切换阀将所述样品环的第一端口与所述第二色谱泵的出口接通，将所述样品环的第二端口与所述混合器的入口接通；在所述连接状态2中，所述切换阀将所述样品环的第二端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，将所述样品环的第一端口连接至系统外。

通过该配置，亲水作用色谱模式中第一色谱泵输送溶剂将亲水作用色谱柱中的待测组分洗脱至样品环的方向，与后续反相色谱模式中第二色谱泵输送的有机溶剂进入样品环将待测组分推入混合器的流动方向相反，有利于待测组分快速进入反相色谱柱聚焦。

具体地，所述混合器为三通混合器，具有三个端口，其中的两个端口为所述混合器的入口，分别通过管路与所述第三色谱泵的出口以及所述切换阀接通，其余的一个端口为所述混合器的出口，通过管路与所述反相色谱柱的入口接通。

具体地，所述第一泵组件包括第一色谱泵和内置于该第一色谱泵中的低压梯度比例阀；或者等效地，所述第一泵组件为包括两个色谱泵的二元高压梯度系统。所述第一泵组件具有至少输送两种极性相异的溶剂的能力，可以完成第一维液相的梯度洗脱。

所述系统中，在第一维，第一泵组件可以自由选择“一个泵+梯度比例阀”或者“两个泵”的组合，这两种配置都可以达到先混合再进样，以实现第一维的梯度分离；

在第二维，采用第二色谱泵和第三色谱泵组成二元高压梯度系统，通过前述特定的流路设计，达到先进样再混合，以解决第二维中溶剂效应的问题。具体地，在第二维液相中，“切换阀+样品环”组成了等效的进样系统，假设样品环体积为500μL，溶剂为高比例ACN(乙腈)，它对于反相色谱柱来说是强溶剂，如果采用普通的“先混合再进样”进样方式，则是流动相推着一段500μL ACN液段进入反相色谱柱，从而引起很强的溶剂效应。本发明的解决办法是，先由第二色谱泵输送小流速ACN将储存于样品环中的溶液带出(先进样)，然后在混合器处与第三色谱泵输送大流速的水混合(后混合)，从而500μL ACN被大量的水稀释成高比例水相的溶液，此时再进入反相色谱柱，则不会产生溶剂效应。

本发明还提供上述系统的分析方法，包括如下步骤：

1)亲水作用色谱柱上样，反相色谱柱平衡：

切换阀调整至将检测器的入口与亲水作用色谱柱的出口接通的状态，然后自动进样器将样品导入系统中，第一泵组件输出高比例有机溶剂推送样品进入亲水作用色谱柱，使样品保留在亲水作用色谱柱柱头，该高比例有机溶剂经过切换阀进入检测器；同时，第二色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合器中混合，形成高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱；

2)弱极性物质收集：

第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例提升，将样品中的弱极性物质从亲水作用色谱柱中洗脱，切换阀切换至连接状态2，使洗脱出的弱极性物质经过切换阀导入样品环中；同时，第二色谱泵和第三色谱泵保持步骤1)的状态；

3)强极性物质分离，弱极性物质聚焦：

切换阀切换至连接状态1，第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例继续提升，将保留在亲水作用色谱柱上的强极性物质梯度洗脱，强极性物质经切换阀进入检测器中检测；同时，第二色谱泵输出有机相溶剂经切换阀将样品环内的弱极性物质推送至混合器，第三色谱泵输送水相溶剂进入混合器，混合器中形成携带弱极性物质的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱，该弱极性物质在反相色谱柱柱头聚焦，该高比例水相混合溶剂经切换阀排出系统外；

4)亲水作用色谱柱平衡，弱极性物质分离：

亲水作用色谱柱上的强极性物质分离、检测完成后，切换阀切换至连接状态2，第一色谱泵输送高比例有机相溶剂进入亲水作用色谱柱，从亲水作用色谱柱出去的溶剂经过样品环和切换阀排出系统外；同时，第二色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合器中混合，形成的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱，随时间推移提升该混合溶剂中有机相溶剂的比例，将聚焦于反相色谱柱柱头的弱极性物质逐个洗脱，弱极性物质经切换阀进入检测器中检测；

5)返回初始状态：

反相色谱柱上的所有物质被洗脱至检测器后，系统恢复至步骤1)的状态，等待下一针样品进样。

具体地，步骤2)中，切换阀在第一个组分从亲水作用色谱柱流出之前切换至连接状态2，使洗脱出的弱极性物质及时导入样品环中；步骤3)中，切换阀在样品环被亲水作用色谱柱的流出物充满之前切换至连接状态1，以免最初流出的组分排入废液。

具体地，步骤1)和步骤4)中，第一泵组件输送的高比例有机溶剂中有机相溶剂的体积比例大于95％；步骤1)至3)中，混合器中形成的高比例水相混合溶剂中的水相溶剂的体积比例始终大于90％，步骤4)中，混合器内形成的混合溶剂中，有机相溶剂的体积比例梯度提升至大于95％。

通过上述配置，调整各步骤中各泵装置输送溶剂的极性和洗脱能力，从而达到推送待测物质或梯度洗脱色谱柱上待测物质的效果。此外，在步骤3)中，先由第二色谱泵输送少量有机相溶剂将储存于样品环中的溶液带出(先进样)，然后在混合器处与第三色谱泵输送的大量水相溶剂混合(后混合)，从而形成高比例水相混合溶剂再进入反相色谱柱，消除了溶剂效应。

具体地，步骤2)与步骤3)中样品环内的液相流动方向相反，并通过设定合适的切阀时间，步骤3)中切换阀在待测物质恰好完全进入样品环时就开始反冲，如果此时样品环仍未被亲水作用色谱柱的流出物充满，则可以节省样品环的空白尾段被不含样品的流出物所填充的时间，从而有利于目标组分快速进入反相色谱柱聚焦。

相对于现有技术，所述亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法具有以下优点：

(1)一次性分析弱极性与强极性物质，同一样品无需分别用不同的方法分析弱极性与强极性物质，且只需一个检测器，亲水作用色谱与反相色谱分析所获谱图保存在一个数据文件中，节省时间，减少冗余数据。

(2)亲水作用色谱与反相色谱两种分析方法在线连接，自动切换，无需手动操作，提高工作效率；亲水作用色谱柱分离的同时反相色谱柱平衡，反之亦然，宏观上省去了色谱柱平衡的时间。

(3)本系统的核心连接装置仅为切换阀和样品环，无需捕集柱，最大限度地降低搭建难度和成本。

(4)除可用于分析弱极性与强极性物质，还可以利用该系统对这两类物质进行分离，起到在线前处理的作用，即去除极性基质的干扰以分析其中的弱极性物质，或去除非极性基质的干扰以分析其中的强极性物质。

(5)可依据具体分析项目选择不同的亲水作用色谱柱和反相色谱柱，可拓展性强。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1本发明提供的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的联接示意图；

图2为实施例1的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的流路联接图；

图3为实施例1的两个六通阀位于连接状态1时系统的流路联接图；

图4为实施例1的两个六通阀位于连接状态2时系统的流路联接图；

图5为实施例1的两个六通阀位于连接状态3时系统的流路联接图；

图6为实施例2的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统的流路联接图；

图7为实施例2的十通阀位于连接状态1时系统的流路联接图；

图8为实施例2的十通阀位于连接状态2时系统的流路联接图；

图9为使用实施例2的系统分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图；

图10为使用HILIC色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图；

图11为使用普通反相C18色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图；

图12为使用宽极性T3色谱柱分析8种小分子代谢物和9种脂肪酸得到的色谱图；

图中的箭头表示流动方向，附图标记的对应关系为：

1-第一色谱泵；2-第二色谱泵；3-第三色谱泵；4-自动进样器；5-亲水作用色谱柱；6-第一六通阀；7-第二六通阀；8-混合器；9-样品环；10-反相色谱柱；11-检测器；12-十通阀。

具体实施方式

请参阅图1，本发明的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统，包括亲水作用色谱柱、反相色谱柱、检测器、自动进样器、第一泵组件、第二色谱泵、第三色谱泵、混合器、样品环和切换阀。

其中，所述第一泵组件用于推送载样溶液以及对亲水作用色谱柱梯度洗脱，所述第一泵组件的出口与所述亲水作用色谱柱的入口接通，所述自动进样器设于所述第一泵组件与亲水作用色谱柱之间的连接管路上；

所述第二色谱泵和第三色谱泵用于对反相色谱柱梯度洗脱，所述第二色谱泵的出口通过所述切换阀与所述混合器的入口接通，所述第三色谱泵的出口与所述混合器的入口接通，所述混合器的出口与所述反相色谱柱的入口接通；

所述亲水作用色谱柱的出口、所述反相色谱柱的出口、所述检测器的入口以及所述样品环的两个端口，分别与所述切换阀连接；

所述切换阀通过其位置切换至少具备以下2种连接状态：

连接状态1：所述切换阀将所述检测器的入口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，并将所述样品环的一个端口与所述第二色谱泵的出口接通，另一个端口与所述混合器的入口接通；

连接状态2：所述切换阀将所述检测器的入口与所述反相色谱柱的出口接通，并将所述样品环的一个端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，另一个端口连接至系统外。

具体地，所述切换阀由两个六通阀连接组成，或者为一个十通阀。

所述混合器为三通混合器，具有三个端口，其中的两个端口为所述混合器的入口，分别通过管路与所述第三色谱泵的出口以及所述切换阀接通，其余的一个端口为所述混合器的出口，通过管路与所述反相色谱柱的入口接通。

所述第一泵组件包括第一色谱泵和内置于该第一色谱泵中的低压梯度比例阀；或者，所述第一泵组件为包括两个色谱泵的二元高压梯度系统。

所述检测器为质谱检测器或紫外检测器。

进一步优选实施方式中，所述样品环的两个端口分别为第一端口和第二端口；在所述连接状态1中，所述切换阀将所述样品环的第一端口与所述第二色谱泵的出口接通，将所述样品环的第二端口与所述混合器的入口接通；在所述连接状态2中，所述切换阀将所述样品环的第二端口与所述亲水作用色谱柱的出口接通，将所述样品环的第一端口连接至系统外。

所述系统的分析方法包括如下步骤：

1)亲水作用色谱柱上样，反相色谱柱平衡：

切换阀调整至将检测器的入口与亲水作用色谱柱的出口接通的状态(例如，切换阀切换至连接状态1)，然后自动进样器将样品导入系统中，第一泵组件输出高比例有机溶剂推送样品进入亲水作用色谱柱，使样品保留在亲水作用色谱柱柱头，该高比例有机溶剂经过切换阀进入检测器；同时，第二色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合器中混合，形成高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱；

2)弱极性物质收集：

第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例提升，将样品中的弱极性物质从亲水作用色谱柱中洗脱，切换阀切换至连接状态2，使洗脱出的弱极性物质经过切换阀导入样品环中；同时，第二色谱泵和第三色谱泵保持步骤1)的状态；

3)强极性物质分离，弱极性物质聚焦：

切换阀切换至连接状态1，第一泵组件输送溶剂中水相溶剂的比例继续提升，将保留在亲水作用色谱柱上的强极性物质梯度洗脱，强极性物质经切换阀进入检测器中检测；同时，第二色谱泵输出有机相溶剂经切换阀将样品环内的弱极性物质推送至混合器，第三色谱泵输送水相溶剂进入混合器，混合器中形成携带弱极性物质的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱，该弱极性物质在反相色谱柱柱头聚焦，该高比例水相混合溶剂经切换阀排出系统外；

4)亲水作用色谱柱平衡，弱极性物质分离：

亲水作用色谱柱上的强极性物质分离、检测完成后，切换阀切换至连接状态2，第一色谱泵输送高比例有机相溶剂进入亲水作用色谱柱，从亲水作用色谱柱出去的溶剂经过样品环和切换阀排出系统外；同时，第二色谱泵和第三色谱泵分别输送水相溶剂进入混合器中混合，形成的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱，随时间推移提升该混合溶剂中有机相溶剂的比例，将聚焦于反相色谱柱柱头的弱极性物质逐个洗脱，弱极性物质经切换阀进入检测器中检测；

5)返回初始状态：

反相色谱柱上的所有物质被洗脱至检测器后，系统恢复至步骤1)的状态，等待下一针样品进样。

具体地，步骤2)中，切换阀在第一个组分从亲水作用色谱柱流出之前切换至连接状态2；步骤3)中，切换阀在样品环被亲水作用色谱柱的流出物充满之前切换至连接状态1。

具体地，步骤1)和步骤4)中，第一泵组件输送的高比例有机溶剂中有机相溶剂的体积比例大于95％；步骤1)至3)中，混合器中形成的高比例水相混合溶剂中的水相溶剂的体积占比始终大于90％，步骤4)中，混合器内形成的混合溶剂中，有机相溶剂的体积比例梯度提升至大于95％。。

进一步优选实施方式中，对应于样品环的第一端口和第二端口各自在连接状态1、连接状态2的连接方式，步骤2)与步骤3)中样品环内的液相流动方向相反。

实施例1

如图2所示，本实施例的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统中，所述切换阀由耐压均在50MPa以上的第一六通阀6和第二六通阀7连接组成。

所述第一六通阀6呈六通结构，按顺时针顺序依次设置有a、b、c、d、e、f六个接口，这些接口是可连接聚醚醚酮接头或不锈钢接头的标准螺口。所述第二六通阀7呈六通结构，按顺时针顺序依次设置有a’、b’、c’、d’、e’、f’六个接口，这些接口是可连接聚醚醚酮接头或不锈钢接头的标准螺口。

所述混合器8为耐压在50MPa以上的三通混合器，其三端为适用于连接标准聚醚醚酮接头或不锈钢接头的标准螺口，分别为m、n、o接口，其中接口m和接口n为入口，接口o为出口。

所述第一泵组件为内置有低压梯度比例阀的第一色谱泵1。所述检测器11为质谱检测器。

所述系统的连接配置具体如下：

第一色谱泵1的出口通过管路接到亲水作用色谱柱5的入口，自动进样器4设于所述第一色谱泵1与亲水作用色谱柱5之间的连接管路上，亲水作用色谱柱5的出口通过管路接到第一六通阀6的接口e；

第二色谱泵2的出口通过管路接到第二六通阀7的接口c’，第二六通阀7的接口f’通过管路接到混合器8的接口n，第三色谱泵3的出口通过管路接到混合器8的接口m，混合器8的接口o通过管路接到反相色谱柱10的入口，反相色谱柱10的出口通过管路接到第一六通阀6的接口a；

质谱检测器11的入口接到第一六通阀6的接口f，样品环9的第一端口接到第一六通阀6的接口d，其第二端口接到第二六通阀7的接口d’，第一六通阀6的接口b作为废液口连通至系统外，具体连接至废液瓶，第一六通阀6的接口c接到第二六通阀7的接口e'，第二六通阀7中的接口a’始终与接口b’接通。

第一六通阀6和第二六通阀7通过其位置切换的配合，可以实现以下3种连接状态：

连接状态1：如图3所示，第一六通阀6的接口e接到接口f，接口d接到接口c，接口a接到接口b，第二六通阀7的接口c’接到接口d’，接口e’接到接口f’，则质谱检测器11的入口与亲水作用色谱柱5的出口接通，样品环9的第一端口与第二色谱泵2的出口接通，第二端口与混合器8的入口n接通，第二色谱泵2的出口通过样品环9与混合器8的入口n接通。

连接状态2：如图4所示，第一六通阀6的接口e接到接口d，接口c接到接口d，接口a接到接口f，第二六通阀7的接口c’接到接口b’，接口a’接到接口f’，接口d’接到接口e’，则质谱检测器11的入口与反相色谱柱10的出口接通，样品环9的第二端口与亲水作用色谱柱5的出口接通，第一端口连接至废液口b。

连接状态3：如图5所示，第一六通阀6的接口e接到接口f，接口d接到接口c，接口a接到接口b，第二六通阀7的接口c’接到接口b’，其接口a’接到接口f’，接口d’接到接口e’，则质谱检测器11的入口与亲水作用色谱柱5的出口接通，样品环9的第一端口与第二端口接通，第二色谱泵2的出口不通过样品环9与混合器8的入口n接通。

本实施例所述系统的分析方法包括如下步骤：

1)亲水作用色谱柱5上样，反相色谱柱10平衡：

如图5所示，第一六通阀6和第二六通阀7切换至连接状态3(或者可切换至图3的连接状态1)，然后自动进样器4将样品导入系统中，第一色谱泵1输出高比例有机溶剂推送样品进入亲水作用色谱柱5，使样品保留在亲水作用色谱柱5柱头，该高比例有机溶剂经过第一六通阀6进入质谱检测器11；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3分别输送水相溶剂进入混合器8中混合，形成高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10。

该步骤中，第一色谱泵1输送的是高比例弱溶剂(其中有机相溶剂的体积比例>95％)，所有待测物质均保留在亲水作用色谱柱5中，不得流出；

第二色谱泵2与第三色谱泵3分别输送的溶剂在混合器8中混合后，应保持混合溶剂中水相溶剂的体积比例>90％，以保证反相色谱柱10中的高比例弱溶剂环境。

2)弱极性物质收集：

第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的比例提升，将样品中的弱极性物质从亲水作用色谱柱5中洗脱，然后，第一六通阀6切换至图4的连接状态2(由于连接状态2和3中第二六通阀7内的连接方式相同，第二六通阀7在该步骤无需切换，操作简洁；若步骤1)是切换至连接状态1，则第二六通阀7在该步骤也要切换至连接状态2)，使洗脱出的弱极性物质经过第一六通阀6导入样品环9中；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3保持步骤1)的状态，且流速不变。

该步骤中，随着第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂比例提升，洗脱能力变强，弱极性组分首先从亲水作用色谱柱5中被洗脱；

第一六通阀6应在第一个组分从亲水作用色谱柱5流出之前，从步骤1)的连接状态3切换至连接状态2，将第一个组分导入样品环9，具体切换时间依分析条件和目标物质而调整，应由预实验确定；

第二色谱泵2与第三色谱泵3分别输送的溶剂在混合器8中混合后，应保持混合溶剂中水相溶剂的体积比例>90％，以保证反相色谱柱10中的高比例弱溶剂环境。

3)强极性物质分离，弱极性物质聚焦：

如图3所示，第一六通阀6和第二六通阀7切换至连接状态1，第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的比例继续提升，将保留在亲水作用色谱柱5上的强极性物质梯度洗脱，强极性物质经第一六通阀6进入质谱检测器11中检测；同时，第二色谱泵2输出有机相溶剂经第一六通阀6和第二六通阀7将样品环9内的弱极性物质推送至混合器8，第三色谱泵3输送水相溶剂进入混合器8，混合器8中形成携带弱极性物质的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10，该弱极性物质在反相色谱柱10柱头聚焦，该高比例水相混合溶剂经第一六通阀6排出系统外。

该步骤中，根据第一色谱泵1输送溶剂的体积流速与样品环9的体积，第一六通阀6和第二六通阀7应在样品环9被亲水作用色谱柱5流出物充满之前，从步骤2)的连接状态2切换至连接状态1，以免最初流出的组分排入废液，具体地，从步骤2)的连接状态2切换至该步骤的连接状态1所经历的总时间应不大于样品环9体积/第一色谱泵1总体积流速；

第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的体积比例逐渐升高至50％～60％，洗脱能力变强，保留在亲水作用色谱柱5上的强极性物质被依次洗脱，然后维持这一比例，保证亲水作用色谱柱5中强保留杂质被洗脱，以免干扰下一针样品的分析；

第三色谱泵3输送水相溶剂的流速远大于第二色谱泵2输送有机相溶剂的流速(体积流速比>9:1)，以保证步骤2)中存储于样品环9内的待测组分被第二色谱泵2输送的有机相溶剂推入混合器8后，溶解于第三色谱泵3输送的水相溶剂中，形成携带待测组分的高比例水相混合溶剂(其中水相溶剂的体积比例>90％)再推入反相色谱柱10中，保证为高比例弱溶剂环境，以使待测组分在反相色谱柱10柱头聚焦；

此外，第二色谱泵2输送的有机溶剂流入样品环9将待测组分推入混合器8的流动方向，与步骤2)中第一色谱泵1输送溶剂将亲水作用色谱柱5中的待测组分洗脱至样品环9的方向相反，有利于待测组分快速进入反相色谱柱10聚焦。

4)亲水作用色谱柱5平衡，弱极性物质分离：

亲水作用色谱柱5上的强极性物质分离、检测完成后，第一六通阀6和第二六通阀7切换至图4的连接状态2，第一色谱泵1输送高比例有机相溶剂进入亲水作用色谱柱5，从亲水作用色谱柱5出去的溶剂经过样品环9排出系统外；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3分别输送水相溶剂进入混合器8中混合，形成的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10，随时间推移提升该混合溶剂中有机相溶剂的比例，将聚焦于反相色谱柱10柱头的弱极性物质逐个洗脱，弱极性物质经第一六通阀6进入质谱检测器11中检测。

该步骤中，第一色谱泵1输送的是高比例弱溶剂(其中有机相溶剂的体积比例>95％)，平衡亲水作用色谱柱5，为下一针样品的分析作准备；

第二色谱泵2和第三色谱泵3的总流速保持不变，其中第二色谱泵2输送有机相溶剂的流速逐渐加快，洗脱能力变强，将步骤3)中聚焦在反相色谱柱10头的弱极性组分依次洗脱，然后维持有机相溶剂为高比例(体积比例>95％)，保证反相色谱柱10中的强保留杂质被洗脱，以免干扰下一针样品的分析。

5)返回初始状态：

保留于反相色谱柱10上的所有物质均被洗脱至质谱检测器11，并用强溶剂充分清洗反相色谱柱10后，系统恢复至步骤1)的状态，等待下一针样品进样。

实施例2

如图6所示，本实施例的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统中，所述切换阀为耐压在50MPa以上的十通阀12。

所述十通阀12呈十通结构，按顺时针顺序依次设置有a、b、c、d、e、f、g、h、i、j十个接口，这些接口是可连接聚醚醚酮接头或不锈钢接头的标准螺口。

所述混合器8为耐压在50MPa以上的三通混合器，其三端为适用于连接标准聚醚醚酮接头或不锈钢接头的标准螺口，分别为m、n、o接口，其中接口m和接口n为入口，接口o为出口。

所述第一色谱泵1为内置有低压梯度比例阀的第一色谱泵1。所述检测器11为质谱检测器。

所述系统的连接配置具体如下：

第一色谱泵1的出口通过管路接到亲水作用色谱柱5的入口，自动进样器4设于所述第一色谱泵1与亲水作用色谱柱5之间的连接管路上，亲水作用色谱柱5的出口通过管路接到十通阀12的接口j；

第二色谱泵2的出口通过管路接到十通阀12的接口f，十通阀12的接口e通过管路接到混合器8的接口n，第三色谱泵3的出口通过管路接到混合器8的接口m，混合器8的接口o通过管路接到反相色谱柱10的入口，反相色谱柱10的出口通过管路接到十通阀12的接口b；

质谱检测器11的入口接到十通阀12的接口a，样品环9的第一端口接到十通阀12的接口g，其第二端口接到十通阀12的接口i，十通阀12的接口c作为废液口连通至系统外，具体连接至废液瓶，十通阀12的接口d始终接与接口h接通。

十通阀12通过其位置切换可以实现以下2种连接状态：

连接状态1：如图7所示，十通阀12的接口j接到接口a，接口f接到接口g，接口i接到接口h，接口d接到接口e，接口b接到接口c，则质谱检测器11的入口与亲水作用色谱柱5的出口接通，样品环9的第一端口与第二色谱泵2的出口接通，第二端口与混合器8的入口n接通，第二色谱泵2的出口通过样品环9与混合器8的入口n接通。

连接状态2：如图8所示，十通阀12的接口j接到接口i，接口g接到接口h，接口d接到接口c，接口f接到接口e，接口b接到接口a，则质谱检测器11的入口与反相色谱柱10的出口接通，样品环9的第二端口与亲水作用色谱柱5的出口接通，第一端口连接至废液口c。

本实施例所述系统的分析方法包括如下步骤：

1)亲水作用色谱柱5上样，反相色谱柱10平衡：

如图7所示，十通阀12切换至连接状态1，然后自动进样器4将样品导入系统中，第一色谱泵1输出高比例有机溶剂推送样品进入亲水作用色谱柱5，使样品保留在亲水作用色谱柱5柱头，该高比例有机溶剂经过十通阀12进入质谱检测器11；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3分别输送水相溶剂进入混合器8中混合，形成高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10；

该步骤中，第一色谱泵1输送的是高比例弱溶剂(其中有机相溶剂的体积比例>95％)，所有待测物质均保留在亲水作用色谱柱5中，不得流出；

第二色谱泵2与第三色谱泵3分别输送的溶剂在混合器8中混合后，应保持混合溶剂中水相溶剂的体积比例>90％，以保证反相色谱柱10中的高比例弱溶剂环境。

2)弱极性物质收集：

第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的比例提升，将样品中的弱极性物质从亲水作用色谱柱5中洗脱，然后，十通阀12切换至图8的连接状态2，使洗脱出的弱极性物质经过十通阀12导入样品环9中；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3保持步骤1)的状态，且流速不变；

该步骤中，随着第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂比例提升，洗脱能力变强，弱极性组分首先从亲水作用色谱柱5中被洗脱；

十通阀12应在第一个组分从亲水作用色谱柱5流出之前从步骤1)的连接状态1切换至连接状态2，将第一个组分导入样品环9，具体切换时间依分析条件和目标物质而调整，应由预实验确定；

第二色谱泵2与第三色谱泵3分别输送的溶剂在混合器8中混合后，应保持混合溶剂中水相溶剂的体积比例>90％，以保证反相色谱柱10中的高比例弱溶剂环境。

3)强极性物质分离，弱极性物质聚焦：

如图7所示，十通阀12切换至连接状态1，第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的比例继续提升，将保留在亲水作用色谱柱5上的强极性物质梯度洗脱，强极性物质经十通阀12进入质谱检测器11中检测；同时，第二色谱泵2输出有机相溶剂经十通阀12将样品环9内的弱极性物质推送至混合器8，第三色谱泵3输送水相溶剂进入混合器8，混合器8中形成携带弱极性物质的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10，该弱极性物质在反相色谱柱10柱头聚焦，该高比例水相混合溶剂经十通阀12排出系统外；

该步骤中，根据第一色谱泵1输送溶剂的体积流速与样品环9的体积，十通阀12应在样品环9被亲水作用色谱柱5流出物充满之前，从步骤2)的连接状态2切换至连接状态1，以免最初流出的组分排入废液，具体地，从步骤2)的连接状态2切换至该步骤的连接状态1所经历的总时间应不大于样品环9体积/第一色谱泵1总体积流速；

第一色谱泵1输送溶剂中水相溶剂的体积比例逐渐升高至50％～60％，洗脱能力变强，保留在亲水作用色谱柱5上的强极性物质被依次洗脱，然后维持这一比例，保证亲水作用色谱柱5中强保留杂质被洗脱，以免干扰下一针样品的分析；

第三色谱泵3输送水相溶剂的流速远大于第二色谱泵2输送有机相溶剂的流速(体积流速比>9:1)，以保证步骤2)中存储于样品环9内的待测组分被第二色谱泵2输送的有机相溶剂推入混合器8后，溶解于第三色谱泵3输送的水相溶剂中，形成携带待测组分的高比例水相混合溶剂(其中水相溶剂的体积比例>90％)再推入反相色谱柱10中，保证为高比例弱溶剂环境，以使待测组分在反相色谱柱10柱头聚焦；

此外，第二色谱泵2输送的有机溶剂流入样品环9将待测组分推入混合器8的流动方向，与步骤2)中第一色谱泵1输送溶剂将亲水作用色谱柱5中的待测组分洗脱至样品环9的方向相反，有利于待测组分快速进入反相色谱柱10聚焦。

4)亲水作用色谱柱5平衡，弱极性物质分离：

亲水作用色谱柱5上的强极性物质分离、检测完成后，十通阀12切换至图8的连接状态2，第一色谱泵1输送高比例有机相溶剂进入亲水作用色谱柱5，从亲水作用色谱柱5出去的溶剂经过样品环和十通阀12排出系统外；同时，第二色谱泵2和第三色谱泵3分别输送水相溶剂进入混合器8中混合，形成的高比例水相混合溶剂进入反相色谱柱10，随时间推移提升该混合溶剂中有机相溶剂的比例，将聚焦于反相色谱柱10柱头的弱极性物质逐个洗脱，弱极性物质经十通阀12进入质谱检测器11中检测。

该步骤中，第一色谱泵输送的是高比例弱溶剂(其中有机相溶剂的体积比例>95％)，平衡亲水作用色谱柱5，为下一针样品的分析作准备；

第二色谱泵2和第三色谱泵3的总流速保持不变，其中第二色谱泵2输送有机相溶剂的流速逐渐加快，洗脱能力变强，将步骤3)中聚焦在反相色谱柱10头的弱极性组分依次洗脱，然后维持有机相溶剂为高比例(体积比例>95％)，保证反相色谱柱10中的强保留杂质被洗脱，以免干扰下一针样品的分析。

5)返回初始状态：

保留于反相色谱柱10上的所有物质均被洗脱至质谱检测器11，并用强溶剂充分清洗反相色谱柱10后，系统恢复至步骤1)的状态，等待下一针样品进样。

使用实施例2的系统分析8种小分子代谢物(强极性)和9种脂肪酸(弱极性)，具体采取实施例2的分析方法。分析结果如图9所示，8种小分子代谢物在6min前经亲水作用色谱(HILIC)得到良好的分离；6min后，系统切换至反相色谱模式(反相色谱柱10采用C18色谱柱)，9种脂肪酸也得到良好的分离。

作为对比实验，分别用HILIC色谱柱、普通反相C18色谱柱和宽极性T3色谱柱分析同一个样品，所得色谱图如图所示，分析结果显示，在HILIC模式下，强极性小分子代谢物分离良好，但弱极性的脂肪酸无法获得良好的峰形和有效的分离(图10)；C18柱能分离弱极性的脂肪酸，但对强极性的小分子代谢物分离效果不佳(图11)；T3柱对小分子代谢物的分离效果较C18柱略好，但仍有数种物质不能得到有效分离(图12)。

通过本发明的亲水作用色谱-反相色谱组合二维液相系统及其分析方法，实现了一次进样分析从弱极性到强极性的目标物质，整个分析过程自动化控制，无需分别在两种色谱柱上进样即可一次性完成分析，色谱性能良好，准确度和精密度高，可有效应用于宽极性跨度目标物的分析检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。