阅读说明：本技术 一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备及其抗肿瘤应用 (Preparation method and anti-tumor application of curcumin and fluorouracil co-loaded nano oral milk ) 是由 魏郁梦 皮超 赵领 赵仕杰 郭璞 傅少志 杨红茹 于 2020-07-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳,并提供了其制备方法和应用。在姜黄素、氟尿嘧啶联合水性辅料及油性辅料构建一种共载纳米口服乳,有效综合组合给药及纳米乳给药系统的双重优势,对比单独使用姜黄素与氟尿嘧啶对肿瘤细胞作用效果,前者可以在协同增效的基础上,发挥纳米乳剂的作用,显著提高药物的抗肿瘤效果,浓集药物在细胞内的浓度,显著提高两种药物的口服生物利用。(The invention discloses curcumin and fluorouracil co-loaded nano oral milk, and provides a preparation method and application thereof. Compared with the effect of the curcumin and the fluorouracil on tumor cells which are independently used, the effect of the nanoemulsion can be played on the basis of synergy, the anti-tumor effect of the drug is remarkably improved, the concentration of the drug in the cells is concentrated, and the oral bioavailability of the two drugs is remarkably improved.)

一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备及其抗肿瘤 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备及其抗肿瘤应用。

背景技术

肿瘤，是一种严重威胁人类的生存与健康的恶性疾病。全球肿瘤发病率现已高达20％以上，肿瘤死亡率更是居高不下；当前对肿瘤的治疗主要集中于：手术、化疗、放疗和免疫疗法等方案。其中，化疗因其靶向性相对较强、治疗费用相对低廉而成为术后治疗的主流方案。

联合用药(Concomitant drugs)是指为了达到更好的治疗目的采用两种或两种以上药物同时或先后应用，主要是为了增加药物的疗效或为了减轻药物的毒副作用。在肿瘤化疗方案里，联合用药方案应用日趋广泛。目前临床常用的联合用药包括西药联合西药、西药联合中药，且所用西药大多为细胞周期的特异性、非特异性阻滞药物或小分子靶点药物，利用肿瘤细胞的异常增殖特性或不同肿瘤的发生发展特点对之进行个性化治疗。目前已有一些关于姜黄素与传统化疗药物氟尿嘧啶联合应用的相关文献报道，在这些报道中，姜黄素可以与氟尿嘧啶协同作用于结肠癌，胃癌，皮肤鳞状细胞癌等，更有研究指出，姜黄素可通过一系列细胞内分子信号通路的调节逆转FU化疗的细胞耐药性，通过姜黄素与FU联合应用可以起到协同增效，逆转耐药，降低FU的用量，从而降低其毒副作用。

纳米乳同时具有纳米粒子和乳剂的性质，据文献报道其能够克服血脑屏障，降低口服首过效应。在CU联合FU的基础上建立纳米乳给药系统，有效综合组合给药及纳米乳给药系统的双重优势，解决药物口服生物利用度不高，增加肿瘤细胞毒性，降低毒副作用，是建立新型共载给药系统的基础。

发明内容

针对姜黄素与氟尿嘧啶组合物配方的上述不足，本发明严格的按照细胞毒性筛选，细胞作用机制探究，药代动力学试验的顺序确定了姜黄素与氟尿嘧啶的不同比例联合，提供了一种科学有效的新型联合配方的姜黄素和氟尿嘧啶共载口服纳米乳，经研究得到的口服纳米乳的确能够在肿瘤细胞中起到协同抗癌作用，显著增加癌细胞对传统化疗药物氟尿嘧啶的敏感性，降低毒副作用。

本发明的第一目的是提供一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳。

本发明的第二目的是提供一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备方法。

本发明的第三目的是探讨姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)提高肿瘤细胞毒性的作用机制，包括细胞凋亡、激光共聚焦成像或胞内药物定量摄取。本发明还涉及姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)在动物模型中的药代动力学行为考察。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳，所述一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳按照质量份数包括如下组分：姜黄素0.96-2.53份、5-氟尿嘧啶0.24-1.58份、聚乙二醇-40037.49-37.95份、中链甘油三酯26.17-27.08份、卵磷脂10.13-12.28份、吐温-8015.98-17.06份、乙醇0.002-0.009份、纯净水0.012-0.020份；

所述姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳，平均粒径为106.20±3.93nm，Zeta电位为-9.71±0.22mV，姜黄素包封率不低于95.0％，氟尿嘧啶包封率不低于30.0％。

进一步，所述一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳按照质量份数包括的如下组分：姜黄素1.14份、5-氟尿嘧啶0.33份、聚乙二醇-40037.80份、中链甘油三酯26.51份、卵磷脂11.36份、吐温-8016.27份、乙醇0.005份、纯净水0.016份。

进一步，所述的一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备方法，具体步骤如下：

1)配置水相：将水溶性辅料与5-氟尿嘧啶溶解于纯净水中；

2)配置油相：将姜黄素粉末溶解于油溶性辅料；

3)配置乳剂：将步骤1)和步骤2)所得油相和水相，混合均匀，恒温密封或加压条件条件下充搅拌、乳化，即得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳。

进一步，所述的一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备方法，所述恒温条件为40-80℃，搅拌转速为500r/min-1500r/min，乳化时间为5-40min。

进一步，所述的一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳的制备方法，所述水溶性辅料为15.98-17.06份吐温-80、0.002-0.009份乙醇，所述油溶性辅料为26.17-27.08份链甘油三酯、37.49-37.95份聚乙二醇-400、10.13-12.28份卵磷脂，所述纯净水0.012-0.020份。

进一步，所述的一种姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳在抗肿瘤方面的应用。

本发明具有如下优点：

1、本发明提供了一种简单可重复的姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳剂，可以在协同增效的基础上，发挥纳米乳剂的作用，显著提高药物的抗肿瘤效果，在肝癌细胞中，以HepG2为例，CU和FU以2∶1摩尔比构建的CU-FU-LN干预HepG2细胞24h后，CU的半数抑制浓度是单用时的78.12％，FU的半数抑制浓度是单用时的25.01％，对姜黄素和氟尿嘧啶联合抗肿瘤的应用具有显著的意义。

2、本发明公开了姜黄素在提高传统化疗药物氟尿嘧啶的相关制剂及其细胞毒性方面的作用，CU-FU-LN与单用时相比，药物荧光向细胞核聚集的状态，CU-FU-LN组药物的绿色荧光在细胞核中心位置呈现高强度的聚集状，说明了CU-FU-LN能够浓集药物在细胞内的浓度。

3、本发明研究说明了CU-FU-LN纳米乳改善两种药物口服生物利用度的特点，即CU-FU-LN与CU或FU单独口服给药相比，CU+FU(CU∶FU＝2∶1，mol/mol)一定程度上增加了药时曲线下面积(AUC)，而CU-FU-LN(CU∶FU＝2∶1，mol/mol)则在CU+FU联用的基础上进一步延缓了药物在血浆中滞留时间，延长半衰期(t1/2)，提高了AUC，显著提高两种药物的口服生物利用度。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。

附图说明

图1是激光扫描共聚焦显微镜检测药物作用24h结肠癌Caco2细胞内分布状态

图2是激光扫描共聚焦显微镜检测药物作用24h肝癌HepG2细胞内分布状态

图3是口服CU-FU原料药组合及CU-FU-LN组大鼠血浆中CU的浓度-时间曲线

图4是口服CU-FU原料药组合及CU-FU-LN组大鼠血浆中FU的浓度-时间曲线

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的进行详细的描述，但实施例并不对本发明作任何形式的限定，除非特别说明，本发明所涉及的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实验1：姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)的制备：

产品1：

(1)实验材料：

姜黄素、5-氟尿嘧啶、聚乙二醇-400、中链甘油三酯、卵磷脂、吐温-80、乙醇、纯净水

(2)试验方法：

1)配置水相：将0.901mmol吐温-80、0.002mmol乙醇与0.034mmol5-氟尿嘧啶溶解于0.012mmol纯净水中；

2)配置油相：取0.091mmol姜黄素粉末与0.159mmol中链甘油三酯、2.893mmol聚乙二醇-400、0.586mmol卵磷脂一起溶解，作为油相；

3)配置乳剂：将上述步骤1)和步骤2)所制得的油相和水相混合均匀，置于70℃下搅拌乳化，乳化时间为10min，搅拌条件为密封或加压条件，搅拌转速为850r/min，即得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)；

4)取上述步骤3)制备所得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)，加水稀释至1-3倍，采用HPLC测量包封率及载药量，采用Marlven激光粒度仪分析粒径及分散系数。

(3)结果：

姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)平均粒径为106.20±3.93nm，Zeta电位为-9.71±0.22mV，CU包封率不低于95.0％，FU包封率不低于30.0％。

产品2：

(1)实验材料：

姜黄素、5-氟尿嘧啶、聚乙二醇-400、中链甘油三酯、卵磷脂、吐温-80、乙醇、纯净水

(2)试验方法：

1)配置水相：将1.504mmol吐温-80、0.009mmol乙醇与0.125mmol5-氟尿嘧啶溶解于0.020mmol纯净水中；

2)配置油相：取0.244mmol姜黄素粉末与0.198mmol中链甘油三酯、4.023mmol聚乙二醇-400、0.804mmol卵磷脂一起溶解，作为油相；

3)配置乳剂：将上述步骤1)和步骤2)所制得的油相和水相混合均匀，置于70℃下搅拌乳化，乳化时间为10min，搅拌条件为密封或加压条件，搅拌转速为850r/min，即得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)；

4)取上述步骤3)制备所得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)，加水稀释至1-3倍，采用HPLC测量包封率及载药量，采用Marlven激光粒度仪分析粒径及分散系数。

(3)结果：

姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)平均粒径为106.20±3.93nm，Zeta电位为-9.71±0.22mV，CU包封率不低于95.0％，FU包封率不低于30.0％。

产品3：

(1)实验材料：

姜黄素、5-氟尿嘧啶、聚乙二醇-400、中链甘油三酯、卵磷脂、吐温-80、乙醇、纯净水

(2)试验方法：

1)配置水相：将0.979mmol吐温-80、0.005mmol乙醇与0.061mmol5-氟尿嘧啶溶解于0.016mmol纯净水中；

2)配置油相：取0.122mmol姜黄素粉末与0.175mmol中链甘油三酯、3.750mmol聚乙二醇-400、0.699mmol卵磷脂一起溶解，作为油相；

3)配置乳剂：将上述步骤1)和步骤2)所制得的油相和水相混合均匀，置于70℃下搅拌乳化，乳化时间为10min，搅拌条件为密封或加压条件，搅拌转速为850r/min，即得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)；

4)取上述步骤3)制备所得姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)，加水稀释至1-3倍，采用HPLC测量包封率及载药量，采用Marlven激光粒度仪分析粒径及分散系数。

(3)结果：

姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)平均粒径为106.20±3.93nm，Zeta电位为-9.71±0.22mV，CU包封率不低于95.0％，FU包封率不低于30.0％。

实验2：姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)对肝癌细胞增殖的影响：

(1)实验材料：

1)试验药物：姜黄素(CU)、氟尿嘧啶(FU)、实验1中产品3所得产品姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)：组成成分包括有0.979mmol吐温-80、0.005mmol乙醇、0.061mmol5-氟尿嘧啶、0.016mmol纯净水、0.122mmol姜黄素粉末、0.175mmol中链甘油三酯、3.750mmol聚乙二醇-400、0.699mmol卵磷脂

2)受试对象：肝癌细胞(人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2)

(2)实验方法：

取处于对数生长期的HepG2肝癌细胞，以5×10⁴个/ml的浓度接种于96孔细胞培养板。实验设调零组(不加药物)、对照组：6.25μmol CU+3.125μmol FU原料药联用组(CU∶FU＝2∶1)、3.125μmol CU+3.125μmol FU原料药联用组(CU∶FU＝1∶1)、3.125μmol CU+6.25μmolFU原料药联用组(CU∶FU＝1∶2)、3.125μmol CU+12.5μmol FU原料药联用组(CU∶FU＝1∶4)、3.125μmol CU+18.75μmol FU原料药联用组(CU∶FU＝1∶6)和6.25μmol CU+3.125μmol FU的CU-FU-LN纳米乳组(CU∶FU＝2∶1)、3.125μmol CU+3.125μmol FU的CU-FU-LN纳米乳组(CU∶FU＝1∶1)、3.125μmol CU+6.25μmol FU的CU-FU-LN纳米乳组(CU∶FU＝1∶2)、3.125μmol CU+12.5μmol FU的CU-FU-LN纳米乳组(CU∶FU＝1∶4)、3.125μmol CU+18.75μmol FU的CU-FU-LN纳米乳组(CU∶FU＝1∶6)，每组5个复孔。按各分组分别干预后于37℃、5％C02和饱和湿度条件下孵育24小时后(以作用时间分组)，弃去上清液加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光值(OD值)；计算抑制率并计算半数抑制浓度(IC₅₀)。

(3)结果：

表1 CU-FU-LN作用于肝癌细胞HepG2的IC₅₀(24h)

*与CU及FU比较，P＜0.05有显著性差异

由表1可知，在肝癌细胞中，CU-FU-LN能显著增加药物的抗增殖效果，以HepG2为例，CU和FU以2∶1摩尔比构建的CU-FU-LN干预HepG2细胞24h后，CU的半数抑制浓度是单用时的78.12％，FU的半数抑制浓度是单用时的25.01％。

实验3：姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)增加药物在癌细胞内的分布：

(1)实验材料：

1)试验药物及试剂：姜黄素(CU)、氟尿嘧啶(FU)、实验1中所得产品3姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)：组成成分包括有0.979mmol吐温-80、0.005mmol乙醇、0.061mmol5-氟尿嘧啶、0.016mmol纯净水、0.122mmol姜黄素粉末、0.175mmol中链甘油三酯、3.750mmol聚乙二醇-400、0.699mmol卵磷脂、DAPI染色液、抗荧光衰减封片剂、4％多聚甲醛溶液

2)受试对象：肝癌细胞(人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2)

(2)实验方法：

将24孔专业玻璃爬片(厚度为0.17mm)放置于24孔板内，向每孔滴加浓度为5×104个/mL的肿瘤细胞液500μL于爬片上，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。贴壁后，向每孔加入500μL配制好的CU(20μmol/L)、FU(10μmol/L)、CU+FU原料药(20μmol/L CU+10μmol/L FU)(CU-FU-crude)和CU-FU-LN纳米乳(20μmol/L CU+10μmol/L FU)药液，根据MTT实验确定给药浓度为FU＝10μmol/L(CU∶FU＝2∶1，mol/mol)，并设置未给药空白对照组。给药后，将细胞板继续放在37℃，5％CO₂培养箱中，药物作用时间为24h。给药24h后，除去每孔含药培养基，用PBS溶液清洗2次；每孔加入4％的多聚甲醛500μL固定15min；吸出固定液，用PBS溶液清洗2次；每孔加入100μL的DAPI液，避光染色5min；弃去染色液，用PBS溶液清洗4次；取出爬片，封片，激光扫描共聚焦显微镜(388/448nm紫外光激发)下观测药物在结肠癌Caco2细胞，肝癌HepG2细胞内分布状态。

(3)结果：

由图1和图2可知，用激光扫描共聚焦显微镜检测药物在肝癌HepG2细胞和结肠癌癌Caco2细胞内分布状态，每组荧光图中，左边为DAPI染色细胞核的蓝色荧光，中间为药物的绿色荧光，右边为DAPI染色与药物的复合荧光。肝癌HepG2细胞和结肠癌Caco2细胞的细胞核被DAPI染料染成蓝色，分别给予CU、FU、CU-FU和CU-FU-LN作用24h，除FU外(FU的荧光激发波长超出仪器最小波长范围)，其余各药物组均出现了药物的绿色荧光，说明药物主要进入到癌细胞内发挥抗癌作用。同时，游离的原料药组，绿色荧光分布呈弥散状，荧光强度散在，而联合用药组可见药物荧光向细胞核聚集的状态，尤其是CU-FU-LN组，药物的绿色荧光在细胞核中心位置呈现高强度的聚集状，说明CU的主要作用部位在细胞核，且纳米给药系统能够提高药物对细胞膜的渗透性，增加胞核内浓度，提高抗癌活性。

实验4：姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)改善口服生物利用度：

(1)实验材料：

1)试验药物：姜黄素(CU)、氟尿嘧啶(FU)、实验1中所得产品3姜黄素和氟尿嘧啶共载纳米口服乳(CU-FU-LN)：组成成分包括有0.979mmol吐温-80、0.005mmol乙醇、0.061mmol5-氟尿嘧啶、0.016mmol纯净水、0.122mmol姜黄素粉末、0.175mmol中链甘油三酯、3.750mmol聚乙二醇-400、0.699mmol卵磷脂

2)受试对象：SD大鼠，180-220g

(2)实验方法：

将20只大鼠随机分为4组，每组5只。经灌胃的方式给药，其中A组为50mg/kg CU；B组为8.9mg/kg FU；C组为50mg/kg CU+8.9mg/kg FU；D组为CU-FU-LN(载有剂量相等的50mg/kg CU+8.9mg/kg FU)。给药后分别于0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h和48h时取血。取出的全血(0.3mL)放于含肝素钠离心管中，离心3min(5000rpm/min)，并取血浆样品经处理后HPLC检测。

(3)结果：

表2 CU和FU各自的药动学统计矩参数

由图3和图4可知，与CU或FU单独口服给药相比，CU+FU(CU∶FU＝2∶1，mol/mol)一定程度上增加了药时曲线下面积(AUC)，而CU-FU-LN(CU∶FU＝2∶1，mol/mol)则在CU+FU联用的基础上进一步延缓了药物在血浆中滞留时间，延长半衰期(t1/2)，提高了AUC，显著提高了药物的口服利用度。由表2所示，经DAS软件分析拟合出的药动学统计矩参数也证明了CU-FU-LN具备的这些优势。

最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。