一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法 (Chitosan-modified nano-enzyme mucosal immune adjuvant, influenza mucosal vaccine and preparation method thereof ) 是由 高利增 秦涛 阴银燕 彭大新 陈素娟 马尚 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法,属于疫苗技术领域。壳聚糖修饰的纳米酶可通过酶催化方式激活树突状细胞ROS水平进而增强天然免疫水平,具有显著的黏膜免疫佐剂特性,而且还能增加流感病毒黏附黏膜的数量和延长黏附时间。将壳聚糖修饰的纳米酶交联灭活流感病毒滴鼻免疫后,显著增强针对流感病毒特异性黏膜免疫和全身系统性免疫水平,具有显著的抗原靶向黏膜递送能力和黏膜佐剂特性,所制备的黏膜疫苗,通过两次滴鼻免疫后可完全保护小鼠对流感病毒的致死性攻击,具有广泛的应用前景。(The invention provides a chitosan-modified nano enzyme mucosal immune adjuvant, an influenza mucosal vaccine and a preparation method thereof, belonging to the technical field of vaccines. The chitosan modified nano enzyme can activate the ROS level of dendritic cells in an enzyme catalysis mode so as to enhance the natural immunity level, has obvious mucosal immunity adjuvant property, and can increase the quantity of influenza virus adhered to mucosa and prolong the adhesion time. After the chitosan modified nano enzyme cross-linked inactivated influenza virus is subjected to nasal drip immunization, the specific mucosal immunity and systemic immunity level aiming at the influenza virus are obviously enhanced, and the antigen-targeted mucosal delivery capacity and mucosal adjuvant characteristics are obvious.)
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法。
背景技术
流行性感冒简称流感(Influenza)，是由流感病毒(Influenza virus)引起的一种人畜共患传染病。流感病毒可分为A型、B型和C型流感病毒，其中A型流感病毒对人类的威胁最大[1]。该病毒主要通过呼吸道传播，历史上流感病毒的大流行给全世界各国人民造成了人员和经济上的巨大损失。1917年-1919年欧洲暴发的西班牙流感(病毒亚型H1N1)疫情，造成5000万人死亡，是历史上最严重的流感疫情[2]。目前预防和控制流感病毒最常用的方法是肌肉注射流感病毒灭活疫苗，包括全病毒灭活流感疫苗和裂解灭活流感疫苗。但是肌肉注射接种疫苗不能在黏膜部位诱导特异性SIgA抗体，并且容易在接种部位产生炎症和形成肉芽肿。鼻腔是流感病毒进入机体的主要入口，如果在鼻腔和上呼吸道建立有效的黏膜免疫保护，将有效阻止流感病毒的入侵，将病毒阻滞在早期阶段，该黏膜免疫策略也可提高交叉保护水平，特别是针对流感病毒多亚型多分支的现状，黏膜免疫可依据“共同黏膜免疫系统”的理论，在消化道和生殖道等其它黏膜面建立黏膜免疫保护，可有效阻断流感病毒从其它途径入侵和散播。全病毒灭活流感疫苗虽然具有较高的安全性[3]，但是它不能在鼻腔黏膜上皮细胞中繁殖，所以单独应用灭活流感疫苗通过鼻腔免疫不能诱导有效的免疫应答。因此亟需开发具有抗原递送能力高和免疫刺激能力强等多重功能的黏膜免疫佐剂。
鼻腔黏膜免疫可以阻断流感病毒的入侵，但是由于灭活H1N1流感病毒和鼻腔黏膜均带负电荷，所以滴鼻免疫灭活H1N1流感病毒后，病毒粒子在鼻腔黏膜处停留时间很短，加之灭活的H1N1流感病毒不能在鼻腔黏膜上皮细胞中增殖，严重限制了抗原递送量，导致单独应用灭活H1N1流感病毒进行鼻腔免疫频频失败。尽管现有研究选用了霍乱毒素(CT)作为黏膜佐剂，但安全性问题始终无法解决。也有人选用Toll-like激动剂如CpG等，但该类佐剂成本较高，而且功能往往单一，难以同时解决黏膜疫苗诸多问题，较难实现应用。
Fe3O4纳米酶(Iron oxide nanozyme，IONzyme)是新近开发的纳米制剂，被广泛应用于蛋白质与核酸的分离纯化、细胞标记、肿瘤治疗以及核磁共振成像[4-6]。Fe3O4纳米酶可模拟多种类酶活性，如过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性等[7]。研究发现，纳米酶具有调节活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的能力[8]，IONzyme在酸性条件下，具有类过氧化物酶(Peroxidase，POD)活性，有利于胞内ROS的产生。而ROS的活化有助于树突状细胞(Dendritic cells，DCs)成熟[9]，提高天然免疫水平[10]。但IONzyme在黏膜佐剂的应用中还没有相关报道。
参考文献：
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[10]Gupta Sudhir,Alt Frederick,Cooper Max,et al.Mechanisms oflymphocyte activation and immune regulation XI B cell biology preface[J].AdvExp Med Biol,2007,596:VII-VIII.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及其制备方法，提高灭活疫苗的黏膜靶向递送效率，促进免疫应答。
本发明的目的还在于提供一种流感黏膜疫苗及其制备方法和应用，流感黏膜疫苗为壳聚糖-Fe3O4纳米酶-灭活流感病毒三元复合体，提高黏膜靶向递送效率。
本发明提供了一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂，由以下步骤制备得到：
无水氯化铁的乙二醇溶液与三水醋酸钠混合，得到的悬浊液和壳聚糖混合，再在198～202℃加热反应11～13h，得到的黑色沉淀物为壳聚糖修饰的纳米酶；
所述氯化铁和壳聚糖的质量比为(0.83～8.2):1。
优选的，所述壳聚糖包括低分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖和高分子量壳聚糖；
所述低分子量壳聚糖为50～190KDa；
所述中分子量壳聚糖为190.1～310KDa；
所述高分子量壳聚糖为310.1～375KDa。
优选的，所述三水醋酸钠和壳聚糖的质量比为(0.37～3.6)：1。
优选的，所述黏膜免疫佐剂的直径为180～250nm；
所述黏膜免疫佐剂的表面带正电荷；
所述黏膜免疫佐剂催化H2O2的过氧化物酶活Vmax/Km为0.5～1.31。
本发明提供了一种流感黏膜疫苗，流感病毒呈球状通过静电作用力结合在所述壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂表面，每个纳米酶黏膜免疫佐剂的圆周上结合7～8个流感病毒。
优选的，所述流感黏膜疫苗的表面带正电。
优选的，所述流感病毒包括H1N1流感病毒。
优选的，流感黏膜疫苗在鼻腔黏膜黏附的数量比单独流感病毒的黏附数量增加了30倍以上；
所述流感黏膜疫苗在鼻腔黏膜黏附的时间延长为12h以上。
本发明提供了一种流感黏膜疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将纯化的流感病毒灭活，将灭活的流感病毒溶液和壳聚糖修饰的纳米酶溶液混合，振荡，得到流感黏膜疫苗；
灭活的流感病毒和壳聚糖修饰的纳米酶的配比按灭活的流感病毒的蛋白质量与壳聚糖修饰的纳米酶的质量计算；灭活的流感病毒的蛋白与壳聚糖修饰的纳米酶的质量比为3:(1～20)。
优选的，当所述流感病毒为H1N1流感病毒时，所述灭活的流感病毒溶液的蛋白浓度为0.5～1.5mg/mL；
当壳聚糖为低分子量壳聚糖时，所述壳聚糖修饰的纳米酶溶液的浓度为0.5～10mg/mL；
所述灭活H1N1流感病毒溶液和所述壳聚糖修饰的纳米酶溶液的体积比(1～3):1。
本发明提供了一种壳聚糖修饰的纳米酶(CS-IONzyme)黏膜免疫佐剂，运用X射线光电子能谱分析制备的黏膜免疫佐剂，结果表明，壳聚糖修饰的纳米酶具有IONzyme和壳聚糖的特征峰，表明壳聚糖与纳米酶连接成功。壳聚糖的修饰可改变粒子的电荷性质至正电荷，便于后续通过静电作用力与灭活流感病毒发生结合，提高黏膜靶向递送效率。同时本发明所涉及壳聚糖修饰的纳米酶易大批量制备、成本低、生物相容性高、稳定性高、安全性高、易于修饰。
同时，本发明提供的黏膜免疫佐剂，在IONzyme表面修饰一定配比的壳聚糖(chitosan，CS)可显著提高其过氧化物酶活性，激活树突状细胞ROS水平进而增强天然免疫水平。
进一步的，本发明进一步限定了不同分子量的壳聚糖，实验表明，与IONzyme对比，不同分子量的CS-IONzyme的过氧化物酶活性显著提高，且低分子量CS-IONzyme过氧化物酶活性最高。
本发明提供的流感黏膜疫苗，流感病毒呈球状通过静电作用力结合在所述壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂表面，每个纳米酶黏膜免疫佐剂的圆周上结合7～8个流感病毒。本发明提供的流感黏膜疫苗是以壳聚糖-纳米酶-灭活流感病毒形成的三元复合体颗粒，具有显著的抗原靶向黏膜递送能力，显著提高树突状细胞天然免疫水平，显著提高小鼠呼吸道黏膜局部和全身系统性免疫应答水平，能够完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击，突破了现有黏膜疫苗所面临的瓶颈问题。所制备的黏膜疫苗，通过两次滴鼻免疫后可完全保护小鼠对H1N1流感病毒的致死性攻击，从根本上解决了现有黏膜疫苗效果较差、成本较高、安全性差的问题，壳聚糖-纳米酶-灭活流感病毒三者方法简便、可操作性和重复性强、稳定性高，为流感防控提供了全新思路，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为CS-IONzyme的透射电镜和扫描电镜图，其中图1中A为透射电镜图，图1中B为扫描电镜图；
图2为CS-IONzyme催化H2O2的酶促动力学曲线；
图3为CS-IONzyme的XPS谱图，其中图3中A为IONzyme、CS和CS-IONzyme的XPS曲线图，图3中B为CS-IONzyme中Fe2p N1s和C1s的XPS曲线图；
图4为CS-IONzyme-H1N1流感病毒透射电镜图和Zeta电势，图4中A为透射电镜图，图4中B为Zeta电势图；
图5为CS-IONzyme对H1N1 WIV黏附鼻腔黏膜的影响结果图；
图6为CS-IONzyme对DCs ROS水平的影响结果图；
图7为DCs ROS的抑制性试验；
图8为DCs ROS水平与表型标志MHCII、CD40表达的关系图；
图9CS-IONzyme体内安全性评价，其中图9中A为不同处理组免疫小鼠后体重变化；图9中B中标尺：100μm；图9中C中标尺：50μm。
图10为CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后抗体水平检测，其中，图10中A为H1N1 WIV-CS-IONzyme组小鼠鼻腔、气管和肺涮洗液中灭活H1N流感病毒特异性IgA抗体显著高于单独H1N1 WIV组(P<0.01)，图10中B为HI抗体水平，图10中C为H1N1 WIV-CS-IONzyme组血清中灭活H1N1流感病毒特异性IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体水平；
图11为小鼠攻毒后体重变化、存活率和肺脏中病毒载量，其中，图11中A为不同处理组免疫小鼠后体重变化曲线图，图11中B为H1N1WIV-CS-IONzyme组小鼠存活率结果；图11中C为H1N1 WIV-CS-IONzyme组小鼠肺脏中病毒载量结果；
图12为H1N1 WIV-不同剂量的CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后鼻腔涮洗液IgA抗体水平检测。
具体实施方式
本发明提供了一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂，由以下步骤制备得到：
无水氯化铁的乙二醇溶液与三水醋酸钠混合，得到的悬浊液和壳聚糖混合，再在198～202℃加热反应11～13h，得到的黑色沉淀物为壳聚糖修饰的纳米酶；
所述氯化铁和壳聚糖的质量比为(0.83～8.2):1。
在本发明中，所述壳聚糖修饰的纳米酶的制备方法采用水热合成法制备。所述加热反应的温度优选为200℃，所述加热反应的时间优选为12h。将无水氯化铁溶于乙二醇溶液中，优选通过磁力搅拌使无水氯化铁完全溶解于乙二醇中。所述无水氯化铁的质量与乙二醇溶液的体积比优选为0.82g：40mL。所述三水醋酸钠和壳聚糖的质量比优选为(0.37～3.6)：1。
在本发明中，所述壳聚糖优选包括低分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖和高分子量壳聚糖；所述低分子量壳聚糖优选为50～190KDa；所述中分子量壳聚糖为190.1～310KDa；所述高分子量壳聚糖优选为310.1～375KDa。不同壳聚糖的分子量对壳聚糖修饰的纳米酶的酶活性有不同程度的影响，经过酶活性测定，低分子量CS-IONzyme过氧化物酶活性最高。
在本发明中，运用扫描电子显微镜对壳聚糖修饰的纳米酶的形态观察并对其粒径测定，不同分子量的CS-IONzyme呈球形，所述黏膜免疫佐剂的直径为180～250nm，略大于IONzyme。经过氧化物酶活性的测定，所述黏膜免疫佐剂催化酶活性均高于与IONzyme。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme的Zeta电势，所述黏膜免疫佐剂的表面带正电荷，Zeta电势达到8～15mV。CS-IONzyme可以诱导DCs ROS的产生，同时实验表明CS-IONzyme通过ROS途径诱导DCs表型标志的表达。CS-IONzyme在小鼠体内具有较好的安全性。
基于壳聚糖修饰的纳米酶的上述特性，所述壳聚糖修饰的纳米酶作为黏膜佐剂在制备流感黏膜疫苗中的应用。
本发明提供了一种流感黏膜疫苗，流感病毒呈球状通过静电作用力结合在所述壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂表面，每个纳米酶黏膜免疫佐剂的圆周上结合7～8个流感病毒。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme-H1N1流感病毒复合物的Zeta电势，电荷性质所述流感黏膜疫苗的表面带正电，Zeta电势达到2～5mV。
本发明对所述流感病毒的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的流感病毒即可。所述流感病毒优选包括H1N1流感病毒。
在本发明中，流感黏膜疫苗在鼻腔黏膜黏附的数量优选比单独流感病毒的黏附数量增加了30倍以上。所述流感黏膜疫苗在鼻腔黏膜黏附的时间延长优选为12h以上。
在本发明中，H1N1 WIV-CS-IONzyme组小鼠鼻腔、气管和肺涮洗液中灭活H1N流感病毒特异性IgA抗体显著高于单独H1N1 WIV组(P<0.01)，此外，与单独H1N1 WIV组相比，H1N1 WIV-CS-IONzyme组血清中灭活H1N1流感病毒特异性IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体水平(图10中C)、HI抗体水平(图10中B)显著升高(P<0.01)。H1N1 WIV-CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后可以显著提高小鼠局部黏膜和全身系统性免疫应答水平。
在本发明中，H1N1 WIV-CS-IONzyme鼻腔免疫小鼠后，可以完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击。
本发明提供了一种流感黏膜疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将纯化的流感病毒灭活，将灭活的流感病毒溶液和壳聚糖修饰的纳米酶溶液混合，振荡，得到流感黏膜疫苗；
灭活的流感病毒和壳聚糖修饰的纳米酶的配比按灭活的流感病毒的蛋白质量与壳聚糖修饰的纳米酶的质量计算；灭活的流感病毒的蛋白与壳聚糖修饰的纳米酶的质量比为3：(1～20)。
在本发明对所述灭活的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的灭活方法即可。在本发明实施例中，所述灭活优选在56℃条件下灭活30min。灭活后，还包括检验。所述检验方法优选包括将灭活后的流感病毒接种SPF鸡胚，3代盲传后，血凝试验为阴性，未检测到病毒，证实病毒已被完全灭活。
在本发明中，当所述流感病毒为H1N1流感病毒时，所述灭活的流感病毒溶液的蛋白浓度优选为1.5mg/mL；优选采用0.01M PBS调整浓度。
当壳聚糖为低分子量壳聚糖时，所述壳聚糖修饰的纳米酶溶液的浓度为10mg/mL；优选采用0.01M PBS调整浓度。
所述灭活H1N1流感病毒溶液和所述壳聚糖修饰的纳米酶溶液的体积比优选为1：1。灭活的流感病毒的蛋白与壳聚糖修饰的纳米酶的质量比优选为3:20
下面结合实施例对本发明提供的一种壳聚糖修饰的纳米酶黏膜免疫佐剂及流感黏膜疫苗及其制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
试验材料说明
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine，TMB)、氯化铁、乙二醇、醋酸钠、30％H2O2、低分子量壳聚糖(50-190KDa)、中分子量壳聚糖(190-310KDa)、高分子量壳聚糖(310-375KDa)、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)、霍乱毒素(choleratoxin，CT)购自Sigma公司，室温储存备用。FITC-MHCII、PE-CD40、PE-CD80、FITC-CD86购自BD公司。活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。NHS(N-hydroxysuccinimide)ester fluorescentprobe DyLight 488、荧光染料去除柱试剂盒购自Thermo公司。H1N1亚型流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1，PR8)，由农业部畜禽传染病学重点开放实验室(扬州大学兽医学院)保存，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。
实施例1
壳聚糖-纳米酶-灭活流感病毒交联方法的建立及功能评价
1.1壳聚糖修饰的纳米酶的合成
通过水热合成法制备壳聚糖修饰的纳米酶(Chitosan-Iron oxide nanozyme，CS-IONzyme)，首先，0.82g无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.6g三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入0.1g不同分子量的壳聚糖(Chitosan，CS)，包括低分子量(50～190KDa)、中分子量(190～310KDa)、高分子量(310～375KDa)，充分搅拌后，超声10min，使壳聚糖与上述溶液均匀混合。然后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即壳聚糖修饰的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用。
1.2壳聚糖修饰的纳米酶形态、粒径测定
取适量的壳聚糖修饰的纳米酶，运用扫描电子显微镜(Scanning electronmicroscope，SEM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)观察壳聚糖修饰的纳米酶形态和粒径。如图1所示，不同分子量的CS-IONzyme呈球形，直径为180～250nm，略大于IONzyme。
实施例2
1.1壳聚糖修饰的纳米酶的合成
通过水热合成法制备壳聚糖修饰的纳米酶(Chitosan-Iron oxide nanozyme，CS-IONzyme)，首先，8.3g无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.7g三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入1.0g不同分子量的壳聚糖(Chitosan，CS)，包括低分子量(50～190KDa)、中分子量(190～310KDa)、高分子量(310～375KDa)，充分搅拌后，超声10min，使壳聚糖与上述溶液均匀混合。然后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即壳聚糖修饰的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用。
1.2壳聚糖修饰的纳米酶形态、粒径测定
取适量的壳聚糖修饰的纳米酶，运用扫描电子显微镜(Scanning electronmicroscope，SEM)和透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)观察壳聚糖修饰的纳米酶形态和粒径。不同分子量的CS-IONzyme呈球形，直径约180～250nm，略大于IONzyme。
实施例3
壳聚糖修饰的纳米酶过氧化物酶活性的测定
通过催化底物H2O2，测定酶促动力学参数。首先取适量壳聚糖修饰的纳米酶，溶于200μL的0.1M醋酸钠缓冲溶液(pH 4.5)，其次加入4μL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethyl benzidine，TMB)(10mg/mL，溶于DMSO)，分别加入不同量(0、0.375、0.75、1.5、3、6、12、24μL)的30％H2O2溶液，酶标仪检测652nm的光吸收值，时间扫描300s，反应温度37℃。如图2所示，与IONzyme对比，不同分子量的CS-IONzyme过氧化物酶活性显著提高，且低分子量CS-IONzyme过氧化物酶活性最高。因此，选用低分子量CS-IONzyme用于后续的试验。
实施例4
壳聚糖修饰的纳米酶元素测定
取适量的壳聚糖修饰的纳米酶，运用X射线光电子能谱分析(X-rayphotoelectron spectroscopy，XPS)仪器检测壳聚糖修饰的纳米酶中的氮元素，推测壳聚糖与纳米酶是否连接成功。如图3所示，低分子量壳聚糖修饰的纳米酶具有IONzyme和壳聚糖的特征峰，表明壳聚糖与纳米酶连接成功。
实施例5
壳聚糖修饰的纳米酶对小鼠骨髓源树突状细胞ROS产生和表型标志表达的影响
原代培养和收集未成熟的小鼠DCs(YinY.et al.Amino Acids.2014,46(7):1763-74)，与CS(8.5μg/mL)、IONzyme(100μg/mL)、CS-IONzyme(100μg/mL)孵育24h，收集DCs，PBS清洗后，加入10μM DCFH-DA，37℃孵育20min，PBS清洗后，流式检测。如图6所示，CS-IONzyme组DCs产生的ROS量显著高于对照组，表明CS-IONzyme可以诱导DCs ROS的产生。使用ROS抑制剂NAC预处理DCs 1h后，CS(8.5μg/mL)、IONzyme(100μg/mL)、CS-IONzyme(100μg/mL)与DCs共孵育24h，收集DCs，PBS清洗后，一部分DCs加入10μM DCFH-DA，37℃孵育20min，PBS清洗后，流式检测DCs ROS水平，一部分DCs加入流式抗体FITC-MHCII、PE-CD40，4℃孵育30min，PBS清洗后，流式检测DCs表型标志的表达情况。如图7和图8所示，ROS抑制剂NAC预处理DCs后，IONzyme和CS-IONzyme组DCs ROS水平、表型标志(MHCII、CD40)表达与对照组没有差异，表明CS-IONzyme通过ROS途径诱导DCs表型标志的表达。
实施例6
壳聚糖修饰的纳米酶-灭活H1N1流感病毒的三元复合物的制备及其电荷性质的检测
H1N1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。纯化后的H1N1流感病毒在56℃水浴中灭活30min。将灭活后的病毒接种10日龄的SPF鸡胚，3代盲传后，血凝试验为阴性，未检测到病毒，证实病毒已被完全灭活。BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)测定纯化的灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度。0.01MPBS调整灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度为1.5mg/mL，0.01M PBS调整壳聚糖修饰的纳米酶浓度为10mg/mL，灭活H1N1流感病毒和低分子量的壳聚糖修饰的纳米酶按照体积1:1混匀，150rpm，25℃，混匀30min后，透射电镜观察，如图4中A所示，在电镜下观察，纳米酶的截面上有7～8个病毒粒子呈环状结合在CS-IONzyme表面，因此，病毒粒子呈球状结合在CS-IONzyme球体的整个表面。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物的Zeta电势，如图4中B所示，CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物带有正电荷。
实施例7
壳聚糖-纳米酶-灭活H1N1流感病毒三元复合体黏附鼻腔黏膜的能力
6-8周龄的C57BL/6小鼠，随机分为5组，第一组滴鼻0.01M PBS(20μL)，第二组滴鼻DyLight 488-H1N1 WIV(15μg)，第三组滴鼻DyLight488-H1N1 WIV(15μg)+CS(8.5μg)，第四组滴鼻DyLight488-H1N1 WIV(15μg)+IONzyme(100μg)，第五组滴鼻DyLight488-H1N1 WIV(15μg)+CS-IONzyme(100μg)，30min后，处死小鼠，分离鼻腔，4％多聚甲醛4℃孵育12h后，将鼻腔组织置于脱钙液(10％EDTA，pH值7.4)中脱钙7d，OCT固定，冰冻切片机进行切片，厚度为8～10μm，PBS清洗切片两次，DAPI避光染色5min，PBS清洗后，共聚焦观察。如图5所示，滴鼻15min后，H1N1 WIV-CS-IONzyme组鼻腔黏膜黏附的H1N1 WIV的量比单独H1N1WIV组增加了10倍以上，滴鼻60min后，H1N1 WIV组没有病毒黏附在鼻腔黏膜表面，而H1N1 WIV-CS-IONzyme组有大量的病毒黏附在鼻腔黏膜表面，而且直到12h仍有大量病毒黏附，表明CS-IONzyme不仅能够显著提高H1N1 WIV黏附鼻腔黏膜的量，而且可以显著延长H1N1 WIV黏附在鼻腔黏膜的时间。
实施例8
壳聚糖-纳米酶-灭活H1N1流感病毒三元复合体在流感黏膜疫苗的应用
1.壳聚糖修饰的纳米酶在小鼠体内安全性评价
6周龄的C57BL/6小鼠随机分成5组，每组20只小鼠，一组用于滴鼻20μL 0.01MPBS，一组用于滴鼻20μL IONzyme(0.25mg/kg)，一组用于滴鼻20μL IONzyme(5mg/kg)，一组用于滴鼻20μL CS-IONzyme(0.25mg/kg)，一组用于滴鼻20μL CS-IONzyme(5mg/kg)，监测小鼠15d内体重变化，滴鼻后第3d，每组取10只小鼠处死，分别鼻腔，4％多聚甲醛4℃孵育12h后，将鼻腔组织置于脱钙液(10％EDTA，pH值7.4)中脱钙7d，梯度酒精脱水，二甲苯置换酒精，石蜡包埋，切片机切片，厚度4μm，HE染色，显微镜观察。
结果见图9。图9为CS-IONzyme体内安全性评价，其中图9中A为不同处理组免疫小鼠后体重变化；图9中B中标尺：100μm，图9中C中标尺：50μm。如图9所示，与PBS组小鼠对比，IONzyme和CS-IONzyme组小鼠体重没有改变，鼻腔黏膜完整，表明CS-IONzyme在小鼠体内具有较好的安全性。
2.壳聚糖-纳米酶-灭活H1N1流感病毒滴鼻免疫小鼠后的黏膜和系统性免疫应答水平
6周龄的C57BL/6小鼠随机分成6组，每组10只小鼠，一组用于滴鼻20μL 0.01MPBS，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(15μg)，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(15μg)+CS(8.5μg)，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(15μg)+IONzyme(100μg)，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(15μg)+CS-IONzyme(100μg)，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(15μg)+CT(2μg)，在0、14d鼻内免疫。首免28d后，宰杀小鼠，眼球摘除取血，分离血清，-70℃保存。分离鼻腔、气管和肺脏，分别注入0.5、0.2、0.5mL无菌0.01M PBS，反复冲洗，收集涮洗液，-70℃保存。运用间接酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)对鼻腔、气管和肺涮洗液中特异性IgA抗体水平和血清中特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平进行检测。通过血凝抑制试验检测血清中中和病毒的抗体水平。
结果见图10。图10为H1N1 WIV-CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后抗体水平检测。如图10中A所示，首免后28d，H1N1 WIV-CS-IONzyme组小鼠鼻腔、气管和肺涮洗液中灭活H1N流感病毒特异性IgA抗体显著高于单独H1N1 WIV组(P<0.01)，此外，与单独H1N1 WIV组相比，H1N1WIV-CS-IONzyme组血清中灭活H1N流感病毒特异性IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体水平(图10中C)、HI抗体水平(图10中B)显著升高(P<0.01)。研究报道IgG1抗体是Th2型免疫的代表因子，而IgG2a是Th1型免疫的代表因子，IgG1/IgG2a＞1，表明单独H1N1 WIV组和H1N1WIV-CS-IONzyme组主要诱导Th2型免疫应答。综上所述，H1N1 WIV-CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后可以显著提高小鼠局部黏膜和全身系统性免疫应答水平。
3.攻毒保护试验
首免28d后，小鼠鼻腔接种50μL H1N1流感病毒：106EID50/只，每组20只小鼠，监测小鼠15d内体重变化和存活率。攻毒后第5d，每组取10只小鼠处死，无菌分离脾脏，加入0.4mL含有抗生素的PBS，组织匀浆机匀浆，液氮反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清，DMEM倍比稀释，接种在M90细胞中，0.1mL/孔，37℃吸附1h后，弃上清，PBS清洗后，加入含有TPCK胰酶(2μg/mL)的DMEM培养液，37℃孵育72h，收集细胞上清，通过血凝试验检测细胞上清中是否有病毒，使用Reed-Muench方法统计TCID50/0.1mL。如图11中A所示，与未攻毒组小鼠对比，H1N1WIV-CS-IONzyme组小鼠体重轻微下降后慢慢恢复，而单独H1N1 WIV组小鼠体重下降较多。如图11中B所示，H1N1 WIV-CS-IONzyme组小鼠存活率为100％。如图11中C所示，与单独H1N1 WIV组相比，H1N1WIV-CS-IONzyme组小鼠肺脏中病毒载量显著降低。以上结果表明：H1N1WIV-CS-IONzyme鼻腔免疫小鼠后，可以完全抵抗H1N1流感病毒的致死性攻击。
实施例9
壳聚糖修饰的纳米酶-H1N1流感病毒三元复合体的合成[H1N1 WIV(15μg)+0.1gCS-IONzyme(5μg)，其中15μg表示20μL的三元复合体中H1N1WIV的总蛋白质量，0.1g表示纳米酶制备时的壳聚糖用量，5μg表示20μL的三元复合体中CS-IONzyme的总质量]
通过水热合成法制备壳聚糖修饰的纳米酶(Chitosan-Iron oxide nanozyme，CS-IONzyme)，首先，8.2g无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.6g三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入0.1g不同分子量的壳聚糖(Chitosan，CS)，包括低分子量(50～190KDa)、中分子量(190～310KDa)、高分子量(310～375KDa)，充分搅拌后，超声10min，使壳聚糖与上述溶液均匀混合。然后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即壳聚糖修饰的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用。
H1N1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。纯化后的H1N1流感病毒在56℃水浴中灭活30min。将灭活后的病毒接种10日龄的SPF鸡胚，3代盲传后，血凝试验为阴性，未检测到病毒，证实病毒已被完全灭活。BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)测定纯化的灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度。0.01MPBS调整灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度为1.5mg/mL，0.01M PBS调整壳聚糖修饰的纳米酶浓度为0.5mg/mL，灭活H1N1流感病毒和低分子量的壳聚糖修饰的纳米酶按照体积1:1混匀，150rpm，25℃，混匀30min后，透射电镜观察，病毒粒子呈球状结合在CS-IONzyme整个表面。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物的Zeta电势，CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物带有正电荷。
实施例10
壳聚糖修饰的纳米酶-H1N1流感病毒三元复合体的合成[H1N1 WIV(15μg)+1.0gCS-IONzyme(5μg)]
通过水热合成法制备壳聚糖修饰的纳米酶(Chitosan-Iron oxide nanozyme，CS-IONzyme)，首先，8.3g无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.7g三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入1g不同分子量的壳聚糖(Chitosan，CS)，包括低分子量(50～190KDa)、中分子量(190～310KDa)、高分子量(310～375KDa)，充分搅拌后，超声10min，使壳聚糖与上述溶液均匀混合。然后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即壳聚糖修饰的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用。
H1N1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。纯化后的H1N1流感病毒在56℃水浴中灭活30min。将灭活后的病毒接种10日龄的SPF鸡胚，3代盲传后，血凝试验为阴性，未检测到病毒，证实病毒已被完全灭活。BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)测定纯化的灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度。0.01MPBS调整灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度为1.5mg/mL，0.01M PBS调整壳聚糖修饰的纳米酶浓度为0.5mg/mL，灭活H1N1流感病毒和低分子量的壳聚糖修饰的纳米酶按照体积1:1混匀，150rpm，25℃，混匀30min后，透射电镜观察，有病毒粒子呈球状结合在CS-IONzyme整个表面。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物的Zeta电势，CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物带有正电荷。
实施例11
壳聚糖修饰的纳米酶--H1N1流感病毒三元复合体的合成[H1N1 WIV(15μg)+1.0gCS-IONzyme(100μg)]
通过水热合成法制备壳聚糖修饰的纳米酶(Chitosan-Iron oxide nanozyme，CS-IONzyme)，首先，8.3g无水氯化铁通过磁力搅拌完全溶于40mL的乙二醇中，形成澄清的溶液。接着，缓慢加入3.7g三水醋酸钠，快速搅拌，形成均匀悬浊液。再加入1.0g不同分子量的壳聚糖(Chitosan，CS)，包括低分子量(50～190KDa)、中分子量(190～310KDa)、高分子量(310～375KDa)，充分搅拌后，超声10min，使壳聚糖与上述溶液均匀混合。然后，将溶液转移至50mL聚四氟乙烯反应釜中，将反应釜置于200℃加热12h。待反应釜自然冷却到室温后，得到黑色沉淀物，即壳聚糖修饰的纳米酶。然后，用乙醇和水洗涤产物三次。最终，将得到的黑色沉淀物分散在乙醇中，放置4℃冰箱待用。
H1N1亚型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1，PR8)，通过蔗糖梯度密度离心法进行纯化。纯化后的H1N1流感病毒在56℃水浴中灭活30min。将灭活后的病毒接种10日龄的SPF鸡胚，3代盲传后，血凝试验为阴性，未检测到病毒，证实病毒已被完全灭活。BCA蛋白试剂盒(Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)测定纯化的灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度。0.01MPBS调整灭活H1N1流感病毒的蛋白浓度为1.5mg/mL，0.01M PBS调整壳聚糖修饰的纳米酶浓度为10mg/mL，灭活H1N1流感病毒和低分子量的壳聚糖修饰的纳米酶按照体积1:1混匀，150rpm，25℃，混匀30min后，透射电镜观察，有病毒粒子呈球状结合在CS-IONzyme整个表面。运用Zeta sizer粒径分析仪检测CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物的Zeta电势，CS-IONzyme-H1N1 WIV复合物带有正电荷。
实施例12
不同剂量的壳聚糖修饰的纳米酶对灭活H1N1流感病毒滴鼻免疫小鼠后的黏膜免疫应答水平
6周龄的C57BL/6小鼠随机分成6组，每组10只小鼠，一组用于滴鼻20μL 0.01MPBS，一组用于滴鼻20μL H1N1 WIV(总质量15μg)，一组用于滴鼻20μL实施例9制备的三元复合体溶液[H1N1 WIV(15μg)+0.1g CS-IONzyme(5μg)]，一组用于滴鼻20μL实施例6制备的三元复合体溶液[H1N1 WIV(15μg)+0.1g CS-IONzyme(100μg)]，一组用于滴鼻20μL实施例10制备的三元复合体溶液[H1N1 WIV(15μg)+1.0g CS-IONzyme(5μg)]，一组用于滴鼻20μL实施例11制备的三元复合体溶液[H1N1 WIV(15μg)+1.0g CS-IONzyme(100μg)]，在0、14d鼻内免疫。首免28d后，宰杀小鼠，分离鼻腔，注入0.5mL无菌0.01M PBS，反复冲洗，收集涮洗液，-70℃保存。运用间接酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)对鼻腔涮洗液中特异性IgA抗体水平进行检测。
结果见图12。图12为H1N1 WIV-不同剂量的CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后鼻腔涮洗液IgA抗体水平检测。如图12所示，首免后28d，H1N1WIV+0.1g CS-IONzyme(5μg)、H1N1 WIV+0.1g CS-IONzyme(100μg)、H1N1 WIV+1.0g CS-IONzyme(5μg)和H1N1 WIV+1.0g CS-IONzyme(100μg)组小鼠鼻腔涮洗液中灭活H1N流感病毒特异性IgA抗体水平显著高于单独H1N1 WIV组(P<0.01)。
综上所述，H1N1 WIV-不同剂量的CS-IONzyme滴鼻免疫小鼠后可以显著提高小鼠局部黏膜免疫应答水平。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。