α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用
阅读说明：本技术 α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用 (Application of alpha-lipoic acid in resisting fish viral hemorrhagic septicemia virus infection ) 是由 易梅生 张弯弯 贾坤同 陈晓淇 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及α-硫辛酸的新用途,具体涉及α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用,为寻找对病毒性出血性败血症病毒具有抗病毒活性的药物,本发明通过研究发现α-硫辛酸在病毒性出血性败血症病毒感染细胞过程中发挥显著的抗病毒功能,且在治疗病毒性出血败血症方面具有很好的效果,可用于鱼类感染病毒性出血性败血症病毒后的治疗。本发明不仅提供了α-硫辛酸的新用途,而且为鱼类病毒性出血性败血症的治疗提供了新的方向。(The invention relates to a new application of alpha-lipoic acid, in particular to an application of the alpha-lipoic acid in resisting fish viral hemorrhagic septicemia virus infection, and aims to find a medicine with antiviral activity to the viral hemorrhagic septicemia virus. The invention not only provides a new application of alpha-lipoic acid, but also provides a new direction for treating the fish viral hemorrhagic septicemia.)
技术领域
本发明涉及α-硫辛酸的新用途，具体涉及α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用。
背景技术
病毒性出血性败血症(viral hemorrhagic septicemia，VHS)是一种由病毒性出血性败血症病毒(viral hemorrhagic septicemia virus，VHSV)引起的传染性鱼类病毒病。VHSV能够以水、食鱼鸟类和被感染鱼排泄物作为传播媒介，在鱼群中广泛传播，引起爆发性死亡。目前，VHS主要流行于欧洲、北美和亚洲东部国家，可感染包括虹鳟、鲑鱼、大口黑鲈等多种海淡水经济鱼类，严重危害水产养殖业的可持续发展。因此，我国已将VHS列入二类动物疫病和禁止进入的二类动物传染性疫病行列。
VHSV属于单股负链病毒目(Mononegavirales)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、弹状病毒属(Novirhabdovirus)。VHSV的基因组为单一节段的负链RNA，大小约为11kb(kilobase)，能够在宿主细胞中复制和翻译出6个病毒蛋白，其蛋白开放阅读框在基因组中的排列顺序依次为3′-N-P-M-G-NV-L-5′。整个病毒颗粒的形状与子弹相似，长度约170-180nm，宽度约60-70nm。根据N和G基因的差异，VHSV可分成4种主要的基因型(I–IV)和亚型(基因型Ia-Ie，基因型IVa-IVb)。
α-硫辛酸(α-Lipoic Acid，LA)是一种含有两个硫原子的辛酸衍生物，化学式为C8H14O2S2。LA具有两种对映异构体，分别为右旋异构体(R)和左旋异构体(S)，内源性LA多以R-LA形式存在，而人工合成的LA是由两种对映异构体组成的混合物。LA被称为是“功能最多且活性最强”的一种抗氧化剂。细胞内的LA能够通过消除细胞代谢产生的过氧化分子和超氧化分子，从而降低脂质、DNA和氨基酸等分子所受到的氧化损伤，缓解生物的氧化应激反应；也可以通过促进胞内谷胱甘肽、维生素E和维生素C等抗氧化分子的再生，发挥抗氧化功能。因此，在水产养殖行业中，LA已被用作饲料添加剂，以提高鱼类的抗氧化能力，抵御氧化应激反应对鱼体造成的伤害。此外，LA也可作为一种抗病毒药物，对多种病毒具有抑制作用，包括人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒，HIV-1)、牛痘病毒(VACV)和冠状病毒等。通过抑制依赖NF-κB的长末端重复序列的活化，LA能够阻止HIV-1基因整合进入宿主基因组，从而显著抑制HIV-1的复制。在人上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等几种细胞系中，LA显示出对VACV晚期基因表达的显著抑制，从而发挥抗VACV的功能。LA还可以通过增加细胞内的pH值来抑制SARS-CoV-2的入侵过程，从而增强人类对新冠病毒的防御能力。然而，目前，尚未有相关文献证实LA具有抗VHSV活性。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用，本发明通过研究发现α-硫辛酸在病毒性出血性败血症病毒感染细胞过程中发挥显著的抗病毒功能，且在治疗病毒性出血败血症方面具有很好的效果。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供α-硫辛酸在制备抗鱼类病毒性出血性败血症的药物中的应用。
本发明还提供了α-硫辛酸在制备抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染细胞的药物中的应用。
优选地，所述抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染细胞为抑制鱼类病毒性出血性败血症病毒的复制。
优选地，所述细胞包括但不限于FHM细胞。
本发明通过体外细胞毒性实验结果表明，LA对FHM细胞的半数致死浓度CC50为472.6μM；本发明检测了LA在VHSV感染下对FHM细胞具有保护作用，发现LA的半数最大效应浓度是42.7μM；本发明检测了LA抗VHSV感染的能力，药物在病毒感染前、药物在病毒感染时、药物在病毒感染后加入细胞，发现24小时和36小时后CPE均显著减少，细胞内病毒核酸的复制均显著下降；本发明检测了LA抗VHSV感染的过程，发现在VHSV复制过程中，加入LA处理，能够对细胞内VHSV G基因的复制产生显著抑制效果。
本发明还提供了一种抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染细胞的药物，以α-硫辛酸为主要活性成分。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。即该药物可与药学上可接受的载体或赋形剂混合制备成组合物。
上述赋形剂是指可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂等以及一些药用基质。上述载体是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(PLGA)、透明质酸等。
优选地，所述药物制成粉剂、颗粒剂或药液。此外，该药物还可制备成临床上可接受的其他剂型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
为寻找对病毒性出血性败血症病毒具有抗病毒活性的药物，本发明通过研究发现α-硫辛酸在病毒性出血性败血症病毒感染细胞过程中发挥显著的抗病毒功能，且在治疗病毒性出血败血症方面具有很好的效果，可用于鱼类感染病毒性出血性败血症病毒后的治疗。本发明不仅提供了α-硫辛酸的新用途，而且为鱼类病毒性出血性败血症的治疗提供了新的方向。
附图说明
图1为LA对FHM细胞的细胞毒性(半数致死浓度CC50为472.6μM)；
图2为LA在VHSV感染下对FHM细胞具有保护作用(半数最大效应浓度是42.7μM)；
图3为VHSV感染前加入、同时加入或感染后加入时LA对病毒感染的影响(A为感染前加入；B为同时加入；C为感染后加入；*P<0.05，**P<0.01)；
图4为VHSV感染前加入、同时加入或感染后加入时LA影响病毒感染的电镜观察图；
图5为LA对VHSV感染周期的影响(A为病毒吸附；B为病毒内吞；C为病毒基因复制；D、E为细胞预处理；**P<0.01)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1细胞活性检测LA对细胞的保护作用
(1)细胞系和细胞培养
实验使用的细胞系为胖头鲤肌细胞系(fathead minnow，FHM)，FHM细胞使用含有10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的M199培养基于28℃恒温培养箱中培养，实验时更换为含有2％FBS的M199维持培养基。
(2)使用CCK-8检测LA对FHM的细胞毒性
采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测LA对FHM的毒性。将处于对数生长期的FHM细胞提前接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，于28℃下培养至细胞覆盖密度达到80-90％。吸弃原培养基，加入已含有不同终浓度LA(10μM、20μM、30μM、50μM、100μM、200μM、400μM和800μM)的维持培养基，并以含有0.1％DMSO的维持培养基作为阴性对照，实验组和对照组均设置4个复孔，于28℃下继续培养48h。培养结束后每孔更换100μL维持培养基，并加入10μL CCK-8试剂，将培养板置于28℃恒温培养箱中孵育2h后，使用活细胞成像仪测定各孔在450nm处的吸光值，数据来自三次独立重复实验并取平均值。每孔的细胞存活率计算方法如下：
细胞存活率＝(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100％。
使用GraphPad Prism 8.0.2作图并计算得出LA的半数致死浓度CC50。
如图1所示，实验条件下LA的CC50为472.6μM，50μM LA对细胞活性无明显影响。
(3)使用CCK-8检测LA对FHM的保护作用
采用CCK-8检测LA处理对VHSV感染后的FHM细胞活性。将处于对数生长期的FHM细胞提前接种于96孔板中，每孔加入细胞悬液100μL，于28℃下培养至细胞覆盖密度达到80-90％。吸弃原培养基，加入已含有不同浓度梯度LA(0μM、10μM、20μM、30μM、40μM和50μM)和100.86TCID50VHSV的维持培养基。并以含有0.1％DMSO和100.86TCID50的维持培养基作为阴性对照，实验组和对照组均设置4个复孔，于28℃下继续培养48h。培养结束后每孔更换100μL维持培养基，并加入10μL CCK-8试剂，将培养板置于28℃恒温培养箱中孵育2h后，使用活细胞成像仪测定各孔在450nm处的吸光值，数据来自三次独立重复实验并取平均值。每孔的细胞存活率计算方法如下：
细胞存活率＝(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)×100％。
使用GraphPad Prism 8.0.2作图并计算得出LA的半数最大效应浓度EC50。
如图2所示，实验条件下LA的EC50为42.7μM，50μM LA处理能够维持受VHSV感染细胞约90％的细胞活性。
实施例2qRT-PCR检测LA的抗VHSV活性
1、药物处理
将处于对数生长期的FHM细胞提前接种于12孔板中，每孔加入细胞悬液1mL，于28℃下培养至细胞覆盖密度达到80-90％，更换新的维持培养基后，以3种不同的药物处理方式检测LA的抗VHSV能力。
(1)LA在VHSV感染前加入细胞
将FHM细胞更换为维持培养基，加入终浓度为50μM的LA，先在28℃下孵育4h，随后接种终浓度为101.5TCID50的VHSV，并在28℃下分别培养24h和36h。培养结束后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的病毒唑(Ribavirin)。
(2)LA与VHSV共同加入细胞
将FHM细胞更换为维持培养基，加入终浓度为50μM的LA与101.5TCID50的VHSV，在28℃下共同培养24h和36h。培养结束后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
(3)药物在病毒感染后加入细胞
将FHM细胞更换为维持培养基，接种101.5TCID50的VHSV后，先在28℃下培养4h，随后加入终浓度为50μM的LA，在28℃下共同培养24h和36h。培养结束后，使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
2、RNA提取
药物处理结束后，使用TriZol法提取不同样品中的细胞总RNA。将收集到的细胞悬液以1000rpm室温离心10min，吸弃上清，加入500μL TriZol试剂吹打混匀至无明显沉淀，室温静置5min。随后加入100μL氯仿，涡旋混匀，室温静置10min，4℃下以13000rpm离心15min。离心管内液体分为三层，取上层无色透明液体转移至新无RNA酶离心管中，加入等量的异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min，4℃下以13000rpm离心15min；吸弃液体，加入800μL去核酸酶水配置的75％乙醇，4℃下以7500rpm离心5min；吸弃上清，室温晾干RNA沉淀10min；用8μL无核酸水溶解RNA沉淀，即得细胞总RNA。
3、cDNA合成
采用Reverse transcription Mix(Promega)反转录试剂盒按照说明书对所得RNA进行反转录。10μL反应体系如下：在无核酸酶200μL离心管内加入2μL Reaction Buffer和1μLEnzyme Mix，随后加入总量不超过5μg的样品RNA模板，用去核酸酶水补齐至10μL。逆转录反应程序如下：42℃、20min；85℃、5s，16℃、2min，即得cDNA，-20℃保存。
4、实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)采用Promega GoTaqTMqPCR试剂盒，按照说明书进行。10μL反应体系如下：5μL qPCR Mix(2×)、1μL cDNA模板、0.5μL上游引物(5’-AACTGTCTCCAAAGAAGTGTGT-3’,10μM)、0.5μL下游引物(5’-GCCATCAAGGAGATAATGTG-3’,10μM)和3μL水。qRT-PCR反应条件为：95℃、1min，95℃、15s、60℃、30s、72℃、30s、40个循环。反应完成后，以FHMβ-actin作为内参基因对样品进行归一化处理。使用2^-ΔΔCT法计算目的基因VHSV G的相对表达量。
如图3和图4所示，在LA的3种处理方式下，VHSV G基因的表达均受到显著抑制，细胞内的病毒量均显著降低，表明LA具有抗VHSV效果。
实施3qRT-PCR检测LA对VHSV感染过程的影响
1、药物处理
将处于对数生长期的FHM细胞提前接种于12孔板中，每孔加入细胞悬液1mL，于28℃下培养至细胞覆盖密度达到80-90％，更换新的维持培养基，随后对LA采用5种不同的处理方式探究LA对VHSV感染过程的影响。
(1)检测LA对VHSV吸附的影响
首先，将FHM置于4℃预冷10min，将FHM细胞更换为维持培养基，加入终浓度为50μM的LA并接种101.8TCID50的VHSV，4℃下培养2h。随后，吸弃培养液，PBS洗3次，更换新鲜的维持培养基，并置于28℃恒温培养箱中继续培养22h。使用0.25％的胰蛋白酶消化将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
(2)检测LA对VHSV内吞的影响
将FHM在4℃预冷10min，将FHM细胞更换为维持培养基并接种101.8TCID50的VHSV，4℃下培养2h；2h后吸弃培养基，PBS洗3次，更换为已含终浓度为50μM LA的维持培养基，在28℃下培养2h；随后吸弃培养液，PBS洗3次，更换维持培养基，在28℃下继续培养20h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
(3)检测LA对VHSV复制的影响
将FHM细胞更换为维持培养基，接种101.8TCID50的VHSV，28℃下培养4h；随后，吸弃原培养基，PBS洗3次，更换为已含终浓度为50μM LA的维持培养基，在28℃下继续培养4h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
(4)检测LA预处理的FHM细胞对VHSV的敏感性影响
将FHM细胞更换为维持培养基，加入终浓度为50μM的LA，在28℃下培养4h；吸弃原培养基，PBS洗3次，接种101.8TCID50的VHSV，在28℃下继续培养4h；吸弃原培养基，PBS洗3次，更换新的维持培养基，在28℃下继续培养20h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
(5)检测LA预处理细胞对VHSV感染的影响
将1.5mM的LA与101.8TCID50的VHSV在4℃下混匀孵育4h，随后将混合物接种到细胞中，将细胞置于28℃恒温培养箱中培养4h；吸弃原培养基，PBS洗3次，更换新鲜的维持培养基，以除去未吸附的VHSV病毒粒子及游离的LA，将细胞置于28℃恒温培养箱中继续培养20h。使用0.25％的胰蛋白酶消化并将细胞收集于无RNA酶离心管中。阴性对照为0.1％的DMSO，阳性对照为8μM的Ribavirin。
2、VHSV感染检测
RNA提取、cDNA合成、实时荧光定量PCR操作同实施例2。
如图5所示，在VHSV胞内复制过程中加入LA处理，能够显著抑制VHSV G基因的表达。在吸附、内吞过程中加入LA，使用LA预处理细胞后接种病毒或LA与病毒预混后接种细胞后，对VHSV G基因的表达无显著影响，表明LA能够抑制VHSV的复制。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学
<120> α-硫辛酸在抗鱼类病毒性出血性败血症病毒感染方面的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aactgtctcc aaagaagtgt gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gccatcaagg agataatgtg 20
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