阅读说明：本技术 用于治疗与线粒体活性氧(ros)产生相关的疾病的去甲基茴三硫衍生物 (Demethylanisolanetrithione derivatives for the treatment of diseases associated with mitochondrial Reactive Oxygen Species (ROS) production ) 是由 P·迪奥莱兹 F·马林 O·佩提特金 于 2018-03-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及去甲基茴三硫(AOX)及其衍生物,特别是式(I)的衍生物,用于预防和治疗其开始和/或进展与线粒体来源的活性氧(ROS)的产生和作用有关的疾病。<Image he="161" wi="700" file="DDA0002289663480000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The present invention relates to demethylanethole trithione (AOX) and derivatives thereof, in particular of formula (I), for the prevention and treatment of diseases the onset and/or progression of which is associated with the production and action of Reactive Oxygen Species (ROS) of mitochondrial origin.)

用于治疗与线粒体活性氧(ROS)产生相关的疾病的去甲基茴 三硫衍生物

技术领域

本发明涉及去甲基茴三硫(AOX)及其衍生物，特别是如权利要求中公开的式(I)的衍生物，用于预防和治疗其开始和/或进展与线粒体来源的活性氧(ROS)的产生和作用有关的疾病。

背景技术

线粒体是目前公认的“衰老的自由基理论”的核心，因此几乎参与了所有与衰老相关的疾病的发病机理，包括心血管疾病、神经退行性疾病(帕金森病、阿尔茨海默病等)、癌症和糖尿病以及缺血性引起的组织功能障碍。该理论指出，由活性氧(ROS)引起的损伤累积会影响许多细胞功能，特别是线粒体功能，而线粒体功能对于能量供应和最佳的细胞功能(functioning)至关重要。因此，线粒体成为ROS的主要靶标，因为最佳的细胞功能对于提供细胞自我修复的能量至关重要。

有趣的是，线粒体是活性氧(ROS)的主要来源，并且因此特别受到氧化性损伤的攻击。因此，线粒体自身产生的ROS会导致氧化性损伤，从而导致线粒体的功能障碍和细胞死亡。

针对ROS的生理和病理作用，已经测试了各种抗氧化剂。抗氧化剂的研究已经提供了许多天然的和设计的分子，这些分子调节ROS以具有针对ROS的不同起源(生理的(细胞信号传导)或病理的)的不同选择性。但是，尽管ROS与多种疾病有关，并且抗氧化剂已经在许多临床前实验中显示出了希望，但几乎所有基于抗氧化剂的疗法的临床试验都显示出有限的疗效(Orr等人，2013，FreeRadic.Biol.Med.65：1047-59)。

此外，最近的一些研究还表明，细胞中ROS的过度减少是有害的，并且似乎ROS产生的足够平衡对于细胞功能是必需的(Goodman等人，2004，J.Natl.Cancer Inst.96(23)：1743-50；Bjelakovic等人，2007，JAMA.297(8)：842-57)。结果，人们对不会影响胞质ROS产生的细胞信号传导的线粒体选择性抑制ROS产生的兴趣日益增长。

由于线粒体的氧化性损伤导致广泛的人类疾病，已开发出设计为用于线粒体体内积累的抗氧化剂。在这些靶向线粒体的抗氧化剂中，研究最广泛的是MitoQ，它包含共价连接到亲脂性三苯鏻阳离子上的抗氧化剂醌部分。MitoQ现在已用于大鼠和小鼠的一系列体内研究以及两项II期人体试验中。现在可以更好地表征高ROS产生的条件。似乎在线粒体呼吸链的多个位点可以产生ROS(Quinlan等人，2013，Redox Biol，1：304-12)。最多的超氧化物/H₂O₂产生发生在电子转运体(主要是醌)的高还原以及高值的线粒体膜电位的条件下。矛盾的是，当线粒体氧化性磷酸化作用低(肌肉收缩低)或在低氧条件下(缺氧)时，这些条件得到满足。

申请人在此证明，AOX(去甲基茴三硫)不作为经典的非特异性抗氧化剂分子，而更有趣地是作为主要在线粒体呼吸链的复合物I的I_Q位点处、ROS产生的主要线粒***点处和线粒体功能障碍的主要负责位点处的氧自由基(ROS)产生的直接选择性抑制剂。

因此，本发明涉及用于治疗和/或预防与游离氧自由基相关的疾病的AOX及其生物电子等排体衍生物。

发明内容

本发明涉及式(I)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，X、Y、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶定义如下；

其用作治疗和/或预防与游离氧自由基相关的疾病中的活性氧(ROS)产生的抑制剂。

在一个实施方案中，用于本发明的化合物选自5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮；5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮肟；5-(4-羟基苯基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮；4-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；5-(2-羟基苯并[d]唑-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；5-(2-羟基苯并[d]噻唑-6-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；5-(苯并呋喃-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮；和5-(3-硫代-3H-1,2-二硫杂环戊烯-5-基)-1H-吲哚-1-羧酸甲酯。

在一个实施方案中，用于本发明的化合物是5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(AOX)。

在一个实施方案中，用于本发明的化合物是式(II)或(III)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，X、Y、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、A和B定义如下；

在一个实施方案中，本发明的化合物抑制线粒体产生ROS。在一个实施方案中，本发明的化合物抑制在线粒体的复合物I的I_Q位点处的线粒体产生ROS。

在一个实施方案中，与游离氧自由基相关的疾病选自包含以下的组：心血管疾病、衰老疾病、自身免疫性疾病、早衰综合征、帕金森综合征、神经疾病、缺血再灌注损伤、传染性疾病、肌肉疾病、肺、肾和肝脏疾病。

在一个实施方案中，心血管疾病选自包含以下的组：心肌梗死、心脏毒性(包括蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和抗病毒药物的心脏毒性，优选蒽环类药物的心脏毒性)、动脉型肺动脉高压、心力衰竭、心肺疾病、缺血、心脏病发作、脑卒中、血栓形成和栓塞。

在一个实施方案中，本发明的化合物用于预防转移。

本发明还涉及式(I’)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，X、Y、R¹、R^2’、R^3’、R⁴、R⁵和R⁶定义如下；

在一个实施方案中，本发明的化合物为如下定义的式(IIa)、(IIb)、(IIIa)或(IIIb)，或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物。

在一个实施方案中，本发明的化合物为如下定义的式(IIa-1)、(IIa-2)、(IIIa-1)或(IIIa-2)的化合物，或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物。

在一个实施方案中，本发明的化合物为如下定义的式(IIa-1a)、(IIa-1b)、(IIa-1c)、(IIa-1d)、(IIa-1e)、(IIa-2a)、(IIa-2b)、(IIa-2c)、(IIa-2d)、(IIa-2e)、(IIIa-1a)、(IIIa-1b)、(IIIa-1c)、(IIIa-1d)、(IIIa-1e)、(IIIa-2a)、(IIIa-2b)、(IIIa-2c)、(IIIa-2d)或(IIIa-2e)的化合物，或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物。

在一个实施方案中，本发明的化合物为如下定义的式(IIb-1)、(IIb-2)、(IIb-3)、(IIb-4)、(IIb-5)、(IIIb-1)、(IIIb-2)、(IIIb-3)、(IIIb-4)或(IIIb-5)的化合物，或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物。

本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的化合物，或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明还涉及包含本发明的化合物或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物的药物。

本发明还涉及制备如下定义的式(IIa-1)的化合物、或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物的方法，其特征在于，所述方法包括：

a)在硅氧烷存在下，使式(c)的化合物与硫基试剂环合

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶定义如下；

从而获得式(IIa-1’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶定义如下；

以及可选地，

b1)式(IIa-1’)的化合物可以与氧化剂反应；优选地，氧化剂是醋酸汞Hg(OAc)₂；以获得式(IIa-1”)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶定义如下；

或

b2)在碱的存在下，式(IIa-1’)的化合物可以与羟胺NH₂OH-HCl反应；优选地，碱是乙酸钠(AcONa)；以获得式(IIa-1”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶定义如下。

定义

在本发明中，以下术语具有以下含义：

在数字之前的术语“约”表示所述数字的值的正负10％。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中，烷基如本文所定义。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“烷基”是指式C_nH_2n+1的烃基，其中，n为大于或等于1的数。通常，本发明的烷基包含1至8个碳原子，优选地1至6个碳原子，更优选1至4个碳原子，更优选1至3个碳原子。烷基可以是直链或支链的。合适的烷基包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基和辛基。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“烷基氨基”是指基团-NH-烷基，其中，烷基如本文所定义。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“烷氧羰基”是指基团-C(＝O)-O-烷基，其中，烷基如本文所定义。优选地，烷氧羰基是甲氧羰基。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“烷基磺酰基”是指基团-SO₂-烷基，其中，烷基如本文所定义。

本文使用的术语“氨基”是指基团-NH₂。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“氨基烷基”是指基团-烷基-NH₂，其中，烷基如本文所定义。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“氨基磺酰基”是指基团-SO₂-NH₂。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“芳基”是指具有单环(即，苯基)或稠合在一起的多个芳环(例如，萘基(naphtyl))的多不饱和芳族烃基，其通常含有5至12个原子；优选6至10个原子。芳基的非限制性实例包括苯基、萘乙烯基(naphthalenyl)。

本文所用的术语“生物电子等排体”是指具有近似相等的分子形状和体积、近似相同的电子分布并且表现出相似的物理性质和相似的生物活性的化合物或基团。

本文中使用的术语“羧基”是指基团-COOH。

本文中单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“羧基烷基”是指基团-烷基-COOH，其中，烷基如本文所定义。

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

本文中单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“卤代烷基”是指其中一个或多个氢被如本文定义的卤素取代的如本文定义的烷基。卤代烷基的非限制性实例包括氟甲基、二氟甲基和三氟甲基。

本文中单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“杂芳基”是指其中至少一个碳原子被杂原子取代的如本文所定义的芳基。换句话说，它是指5至12个碳原子的芳族单环或通常含有5至6个原子的含有2个稠合在一起的环的环系统；其中一个或多个碳原子被氧、氮和/或硫原子取代，其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，而氮杂原子可以任选地被季铵化。这种杂芳基的非限制性实例包括：

唑基、噻唑基、咪唑基、呋喃基和吡咯基。

术语“IC₅₀”或“最大半数抑制浓度”表示在体外抑制50％所需的抑制剂的浓度。它与激动剂药物的“EC₅₀”或“最大半数有效浓度”相当。“EC50”也表示在体内获得50％的最大效应所需的血浆浓度。

本文单独使用或作为另一取代基的一部分使用的术语“硝基氧烷基”是指基团-烷基-ONO₂，其中，烷基如本文所定义。

表述“药学上可接受的赋形剂”是指当施用于动物、优选人时，不产生负面的、过敏的或其他不良反应的赋形剂。它包括任何和所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于人类施用，制剂应符合监管局(例如FDA局或EMA)所要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。

本文所用的术语“ROS”是指活性氧。ROS是含氧的化学反应性化学物质。实例包括，但不限于，过氧化物([O-O]^2-和R-O-O-R，诸如H₂O₂)、超氧化物(O2·^-)、羟基自由基(·OH)和单线态氧(¹O₂)。在细胞中，ROS是氧代谢的副产物。但是，环境压力可以导致细胞产生的ROS增多，称为“氧化应激”，从而导致细胞结构受到严重破坏。迄今为止，已经确定了几个不同的ROS产生位点，其中包括线粒体(尤其是线粒体呼吸链的位点I_Q、I_F、III_QO、SDH和mGPDH)、微粒体(例如，细胞色素P450和二胺氧化酶)、过氧化物酶体和质膜中的一些酶(例如，NADPH氧化酶和脂氧化酶)。根据细胞内释放和储存ROS的位置，可以进一步区分“胞质ROS”和“线粒体ROS”。例如，线粒体呼吸链的复合物I(位点I_Q和I_F)和线粒体复合物II的位点SDH产生并向线粒体腔(lumen)释放ROS，因此被认为是“线粒体ROS”；而线粒体呼吸链的复合物III(位点IIIQO)和位点mGPDH产生并向细胞胞质释放ROS，被认为是“胞质ROS”。

本发明化合物的术语“盐”在本文中用于描述其酸加成盐和碱盐。合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。非限制性实例包括乙酸盐、三氟乙酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硼酸盐、四氟硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐(esylate)、甲酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐、盐酸盐/氯化盐、氢溴酸盐/溴化盐、氢碘酸盐/碘化盐、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、萘甲酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、蔗酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和木叶酸盐(xinofoate)。合适的碱盐是由形成无毒盐的碱形成的。非限制性实例包括铝盐、精氨酸盐、苄星青霉素盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、醇胺盐、钾盐、钠盐、氨丁三醇盐、2-(二乙氨基)乙醇盐、乙醇胺盐、吗啉盐、4-(2-羟乙基)吗啉盐和锌盐。还可以形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。优选的药学上可接受的盐包括盐酸盐/氯化盐、氢溴酸盐/溴化盐、硫酸氢盐/硫酸盐、硝酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐。

如本文所用的，术语“位点I_Q”是指NADH：泛醌氧化还原酶(也称为线粒体复合物I)的泛醌结合位点。位点I_Q会产生ROS，这些ROS在线粒体腔内释放。

如本文所用的，术语“位点I_F”是指线粒体复合物I的黄素结合位点。位点I_F产生ROS，这些ROS在线粒体腔内释放。

如本文所用的，术语“位点III_QO”是指细胞色素bc1复合物(也称为线粒体复合物III)的泛醌结合位点。位点III_QO产生ROS，这些ROS向胞质释放。

如本文所用的，术语“位点SDH”是指琥珀酸脱氢酶(也称为线粒体复合物II)。位点SDH产生ROS，这些ROS在线粒体腔内释放。

如本文所用的，术语“位点mGPDH”是指甘油-3-磷酸脱氢酶。位点mGPDH产生ROS，这些ROS向胞质释放。

如本文所用的，术语“溶剂化物”用于描述本发明中的化合物，其包含化学计量或亚化学计量的一种或多种药学上可接受的溶剂分子诸如乙醇或水。术语“水合物”是指当所述溶剂是水时。

术语“受试者”是指动物，包括人。在本发明的意义上，受试者可以是患者，即接受医疗护理、正在接受或已经接受过医学治疗或被监测疾病发展的人。在一个实施方案中，受试者是男性。在另一个实施方案中，受试者是女性。

术语“互变异构体”是指通过称为互变异构化的化学反应可相互转化的有机化合物。所述化学反应涉及氢原子或质子的迁移，伴随着单键和相邻双键的转换。

表述“治疗有效量”是指在对靶标不会造成明显负面或不利副作用的情况下，以下目的的药剂的水平或量：(1)延迟或预防与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况的发作；(2)减慢或停止与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况的一种或多种症状的进展、加剧或恶化；(3)改善与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况的症状；(4)降低与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况的严重性或发生率；或(5)治愈与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况。可以在与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况发作之前施用治疗有效量，以用于防止性或预防性作用。可替代地或另外地，可以在与游离氧自由基有关的疾病、病况或病况开始之后施用治疗有效量，以用于治疗作用。

术语“处理”、“治疗”或“缓解”是指治疗性治疗和防止性或预防性措施；其中目的是预防或减慢靶向病理病况或疾病。需要治疗的人包括已经患有该疾病的人以及易于患该疾病的人或将要预防该疾病的人。如果在接受本发明的治疗后，受试者或哺乳动物在以下一种或多种情况中显示出可观察到的和/或可测量的降低或不存在，则该受试者或哺乳动物被成功地“治疗”了该疾病、感染或病况：减少ROS的产生；和/或在某种程度上缓解了与特定疾病或病况相关的一种或多种症状；降低的发病率和死亡率，以及生活质量的改善问题。可以通过医师熟悉的常规程序容易地测量用于评估疾病的成功治疗和改善的上述参数。

具体实施方式

本发明的一个目的是提供一种治疗和/或预防的方法；或用于治疗和/或预防有此需要的受试者中与游离氧自由基相关的疾病，包括施用有效量的活性氧(ROS)的线粒体产生的抑制剂。

本发明的另一个目的是用于治疗和/或预防的活性氧(ROS)的线粒体产生的抑制剂；或用于治疗和/或预防与游离氧自由基相关的疾病，其中，所述抑制剂抑制ROS的线粒体产生。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂不影响生理性(胞质)ROS产生。在一个实施方案中，在存在本发明的抑制剂的情况下，生理性(胞质)ROS产生被调节不超过5％(增加或减少)。在一个实施方案中，在存在本发明的抑制剂的情况下，生理性(胞质)ROS产生的调节不超过2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％(增加或减少)。

本文所用的术语“不影响”是指通过本领域技术人员已知的用于确定活性氧产生水平的技术测量的本发明的抑制剂不起作用。

在另一个实施方案中，本发明的抑制剂不是胞质ROS产生的抑制剂。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂不影响在选自III_QO和mGPDH的至少一个位点处的生理性(胞质)ROS产生。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂不会使在选自III_QO和mGPDH的至少一个位点处的生理性(胞质)ROS产生降低大于2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂不降低来自线粒体呼吸链的复合物III的位点III_QO处的生理性(胞质)ROS产生。

胞质ROS产生取决于总细胞ROS产生与内部线粒体ROS产生之间的差异。可选地，可以在NAD(P)H氧化酶ROS产生的体外测定中确定胞质ROS产生。

在另一个实施方案中，本发明的抑制剂在ROS产生的上游起作用。

检测胞质ROS产生的测试在本领域和技术人员中是众所周知的。

此类测试的实例包括但不限于：

(1)总体细胞活性氧ROS的测量：

5-(和-6)-氯甲基-2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯(CM-H₂DCFDA)和/或H₂DCFDA是细胞中胞质活性氧(ROS)的指标。CM-H₂DCFDA被动扩散到细胞中，其乙酸酯基团被细胞内酯酶裂解，其硫醇反应性氯甲基基团与细胞内谷胱甘肽和其他硫醇反应。随后的氧化产生荧光加合物，其被困在细胞内部，从而便于长期研究(Zhang et al.,2008.J.Cardiovasc.Pharmacol.51(5)：443-9；Sarvazyan,1996.Am.J.Physiol.271(5 Pt2)：H2079-2085)。

(2)测量细胞中线粒体的ROS产生：

测量完整细胞中的细胞内ROS以及确定线粒体的来源要困难得多。近年来，利用亲脂性三苯基鏻阳离子TPP⁺作为“递送”共轭物，已开发出了对线粒体功能至关重要的质子动力，以将多种化合物靶向于高度阴性的线粒体基质。其中，MitoSOX红，也称为线粒体-氢乙锭或线粒体-二氢乙锭，普遍地用于线粒体ROS的估计。MitoSOX的TPP⁺部分使ROS敏感的氢乙锭在线粒体基质中大量积累，并通过超氧化物来氧化氢乙锭产生特定的荧光氧化产物2-羟基乙锭(Zhao et al.,2005.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102(16)：5727-5732；Polster etal.,2014.Methods Enzymol.547：225-250)。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂是活性氧(ROS)的线粒体产生的选择性抑制剂。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂是在选自I_Q、I_F和SDH的至少一个位点处的ROS的线粒体产生的选择性抑制剂。

在一个实施方案中，根据本发明的线粒体产生的选择性抑制剂使选自I_Q、I_F和SDH的至少一个位点处的线粒体ROS产生降低了大于2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更多，同时对ROS产生的其余位点的线粒体ROS产生的影响少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、18％、16％、14％、12％、10％、8％、6％、4％、2％或更小。

在一个实施方案中，作为来自线粒体ROS产生的单个位点的线粒体ROS产生的选择性抑制剂的抑制剂使来自ROS产生位点I_Q、I_F和SDH之一的ROS产生降低大于18％，同时对来自ROS产生的其余位点的ROS产生的影响少于10％。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是线粒体呼吸链的复合物I的位点I_Q和/或I_F处的ROS的线粒体产生的选择性抑制剂。

线粒体呼吸链的复合物I可以从两个不同的位点生成ROS：泛醌结合位点和黄素单核苷酸位点。

复合物I的泛醌结合位点(I_Q)

为了特别分析来自I_Q的ROS产生，可以使用5mM琥珀酸盐作为底物，向呼吸链提供电子。I_Q处的ROS产生对跨线粒体内膜的质子动力(PMF)的变化极为敏感(PMF＝ΔΨm+ΔpH)。因此，当在I_Q ROS测定中评估命中结果(hits)的选择性时，可以使用ΔΨm分析的保守阈值。

在强PMF的存在下，从还原Q池通过CI反向传输到基质NAD⁺的过程中，从位点I_Q泄漏的电子被充分表征。从实验上看，有利于I_Q ROS产生的条件被认为与生理学相去甚远，导致许多人忽略了它的相关性，尽管它具有高比率的能力。然而，即使当提供了较低浓度的谷氨酸盐(用于通过CI向前馈送电子)和琥珀酸盐(用于反向馈送电子)两者时，呼吸线粒体仍会产生大量的鱼藤酮敏感的ROS(即I_Q ROS)。此外，比较分析显示，来自位点I_Q(而非位点I_F)的最大ROS产生与不同脊椎动物的种的最大寿命之间存在反比关系(Lambert et al.,2007.Aging Cell.6(5):607-18；Lambert et al.,2010.Aging Cell.9(1):78-91)。因此，I_Q ROS的选择性调节剂为探讨线粒体ROS产生在正常和病理过程中的假定作用提供独特的机会。

复合物I的黄素结合位点(I_F)：

为了专门分析来自I_F的ROS产生，向呼吸链供应电子的底物溶液可以包含5mM谷氨酸盐、5mM苹果酸盐和4μM鱼藤酮。位点I_F产生ROS的速率与线粒体基质中NADH池的还原状态成正比(Treberg et al.,2011.J.Biol.Chem.286(36):31361-72)。用杀虫剂鱼藤酮阻断位点I_Q可以通过防止黄素氧化来提高来自位点I_F的ROS产生。相较于位点I_Q和III_QO，来自复合物I(位点I_F)的黄素结合位点的最大ROS产生是比较低的，这可能会导致该测定中更高的变化性，并且随后会导致初始筛选中更高的命中结果查找(hit calling)假阳性率。

鱼藤酮和神经毒素MPP⁺对复合物I活性的抑制作用与啮齿动物和人类两者中的帕金森病有关，表明机能失调的复合物I、ROS产生和神经退行性变之间存在联系。因此，能够抑制来自复合物I的ROS产生的化合物可以用于治疗。

在另一实施方案中，本发明的抑制剂或选择性抑制剂是在线粒体呼吸链的复合物I的位点I_Q处的活性氧(ROS)产生的线粒体产生的选择性抑制剂。

本文所用的术语“选择性抑制剂”可以指能够抑制在复合物I的位点I_Q处的ROS产生，同时对其余位点处的ROS产生、线粒体膜电位(ΔΨm)和氧化磷酸化的影响最小的化合物。例如，在分离的线粒体上，当存在鱼藤酮(即，当位点I_Q上的ROS产生被抑制时)和抗霉素A(即，当ROS主要由复合物III产生时)的情况下，该化合物的IC₅₀对ROS产生的抑制作用是不含鱼藤酮时的约5、6、7、8、9、10、15、20倍。

在一个实施方案中，本文所用的术语“选择性抑制剂”还可以以本文所给出的任何一种定义排他性地或包含性地指代一种化合物，该化合物能够在复合物I的位点I_Q处抑制线粒体ROS产生，其IC₅₀为约0.1μM至约20μM，优选地约10μM。在一个实施方案中，本文所用的术语“选择性抑制剂”还可以以本文所给出的任何一种定义排他性地或包含性地指代一种化合物，该化合物能够在复合物I的位点I_Q处抑制线粒体ROS产生，其IC₅₀约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20μM。在另一个实施方案中，所述化合物在NAD(P)H氧化酶ROS产生的体外测定中没有显著地抑制胞质ROS产生。

本文所用的术语“选择性抑制剂”还可以以本文给出的任何一种定义排他性地或包含性指代一种化合物，该化合物能够抑制复合物I的I_Q位处的ROS产生，同时对其余位点处的ROS产生和线粒体膜电位(ΔΨm)和氧化磷酸化的影响最小。例如，在分离的线粒体上，当存在鱼藤酮的情况下(即，当位点I_Q上的ROS产生被抑制时)，该化合物抑制ROS产生的IC₅₀是抗霉素A存在时的约为5、6、7、8、9、10、15、20倍或更多(即在鱼藤酮后添加，因此当ROS主要由复合物III产生时)。

特异性检测在来自各种组织的分离的线粒体上的线粒体呼吸链的复合物I的位点I_Q处产生的ROS的测试是本领域技术人员众所周知的。

还描述了高通量测定方法，以用于鉴定分离的线粒体中限定位点的ROS产生的抑制剂，而不会改变能量产生。该测定确定了ROS产生的位点特异性调节剂，同时还揭示了特异性较差的效应物，例如广泛作用的抗氧化剂和线粒体生物能量学的各种抑制剂。因此，可以识别出下述的抑制剂，所述抑制剂可以区分在电子传输链中特定位置处的不希望的泄漏到氧上的电子(ROS产生)，而又不改变跨内线粒体膜的正常能量耦合电子和质子通量。该测定将使用染料Amplex UltraRed(Invitrogen)的基于荧光的线粒体ROS产生的标准测定方法和使用电势染料TMRM(Invitrogen)的ΔΨm调整为高通量微孔板形式。提供了五个ROS和一个ΔΨm测试的核心集，以用于在刚分离的骨骼肌线粒体中可靠地检测功能调节。可以通过改变底物和添加到普通测定混合物中的抑制剂来分别靶向ROS产生的五个主要位点(I_Q、I_F、III_QO、SDH和mGPDH)。可以并行运行用于监视ΔΨm的计数器屏幕，以消除可能是正常线粒体能量产生的一般抑制剂或解偶联剂的化合物。

在另一个实施方案中，针对所有测定，一式两份以2.5μM测试抑制剂。将终点荧光相对于DMSO进行标准化，并且每个板上均包含已知的线粒体抑制剂对照孔。在每个ROS测定中的阳性采样数可以通过在该测定中施加优选降低15％、或更优选降低18％、或甚至更优选降低20％、或降低更多的阈值来初始过滤。每种ROS测定均可以用作相对于其他ROS的复筛(counter-screen)，同时还可以消除基于TMRM的复筛中改变ΔΨm的化合物。因此，随后可以评估经过滤的采样数，以消除将其他ROS分析改变超过例如20％、或18％、或15％或将ΔΨm改变超过优选地10％、或更优选地5％、或甚至更优选地4％的那些。

在另一个实施方案中，本发明的抑制剂不会显著影响直接在线粒体上的氧化磷酸化，优选地氧化磷酸化调节小于10％、9％、8％、7％、6％、5％。

与游离氧自由基有关的疾病涉及氧化应激失衡和线粒体功能障碍。特别地，涉及线粒体功能障碍的疾病是由线粒体ROS产生引起的。

与游离氧自由基相关的疾病包括但不限于：心血管疾病、衰老疾病、自身免疫性疾病、早衰综合征、帕金森综合征、神经疾病、缺血再灌注损伤、传染性疾病、肌肉疾病、肺、肾和肝脏疾病。

与游离氧自由基有关的心血管疾病包括，但不限于，高血压、心脏毒性(包括蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和抗病毒药物的心脏毒性)、无论起源的心力衰竭(heart failure regardless of origin)、缺血、心肌梗死、心脏病发作、脑卒中、动脉粥样硬化、纤维性颤动、高血压、血栓形成和栓塞、过敏性/炎性疾病诸如支气管哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、II型糖尿病、糖尿病和耳聋(DAD，也称为巴林格-***(Ballinger-Wallace)综合征)、炎性疾病、风湿热、动脉型肺动脉高压、综合征性心肌病(诸如巴特(Barth)综合征、科斯特洛(Costello)综合征、弗雷德里希(Friedreich)共济失调、豹斑(LEOPARD)综合征、努南(Noonan)综合征、心血管系统皮肤(cardiofaciocutaneou)综合征、心脑肌病(cardioencephalomyopathy)和阿耳斯特雷姆(Alstrom)综合征)、固有免疫反应、和心肺疾病(诸如慢性阻塞性肺部疾病、肺栓塞、心包炎、主动脉缩窄、法洛四联症、主动脉狭窄、二尖瓣狭窄、主动脉瓣反流、二尖瓣反流、肺尘埃沉着病、支气管扩张、心肌病和/或内皮***耐受性)。

与游离氧自由基相关的衰老疾病包括但不限于：与年龄有关的黄斑变性(AMD)、皮肤老化、紫外线对皮肤的伤害、变薄、下垂、起皱、老年斑的出现、血管破裂和干燥区域、脂溢性角化病、日光性角化病、金德勒(Kindler)综合征、鲍恩(Bowen)病、皮肤癌、关节炎、强直性脊柱炎、炎性多关节炎、膝关节炎、流行性多关节炎、银屑病关节炎、白内障、耳聋、癌症、转移、转移过程的预防、肝病、移植、肿瘤和抗肿瘤或免疫抑制剂和化学品的毒性、骨质疏松症、皮肤异色症、肢皮早老症、遗传性硬化性皮肤异色症、先天性角化不良、着色性干皮病、布鲁姆(Bloom)综合征、范可尼(Fanconi)贫血、科凯恩(Cockayne)综合征和污染引起的疾病。

与游离氧自由基相关的自身免疫性疾病包括但不限于：多发性硬化症、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、I型糖尿病、克罗恩(Crohn)病；重症肌无力、格雷夫(Grave)病、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、溃疡性结肠炎、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性肝炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、强直性脊柱炎、银屑病。

自身免疫疾病可以是与血液疾病有关的自身免疫疾病，诸如自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血和自身免疫性血小板减少症。

自身免疫疾病还可以是颞动脉炎、抗磷脂综合征、血管炎诸如韦格纳(Wegener)肉芽肿病和白塞(Behcet)病。

其他自身免疫性疾病包括多发性肌炎、皮肌炎、脊柱关节病(如强直性脊柱炎)、抗磷脂综合征和多发性肌炎。

与游离氧自由基有关的早衰综合症包括但不限于：早老症，布鲁姆(Bloom)综合征、科凯恩(Cockayne)综合征、德巴西(De Barsy)综合征、先天性角化不良、限制性皮肤病，罗特蒙德-汤姆森(Rothmund-Thomson)综合症、毛发低硫营养不良、沃纳(Werner)综合症、维德曼-劳滕斯劳奇(Wiedemann-Rautenstrauch)综合征和着色性干皮病。

与游离氧自由基相关的帕金森综合症包括但不限于：帕金森病(PD)、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、皮质基底节变性或路易(Lewy)体痴呆、毒素诱发的帕金森症以及PD的早发性变体(诸如常染色体隐性PARK6关联的帕金森病或常染色体隐性PINK1关联的帕金森病)。

与游离氧自由基相关的神经系统疾病包括但不限于：痴呆、阿尔茨海默(Alzheimer)病、帕金森(Parkinson)病和衰老、亨廷顿氏(Huntington)舞蹈病、弗雷德里希(Friedreich)共济失调、威尔逊(Wilson)病、莱氏(Leigh)综合征、凯恩斯-赛尔(Kearns–Sayre)综合征、莱伯(Leber)遗传性视神经病变、认知障碍、情绪障碍、活动障碍、迟发性运动障碍、脑损伤、细胞凋亡、痴呆、癫痫、癫痫性痴呆、早老性痴呆、创伤后痴呆、老年性痴呆、血管性痴呆、HIV-1相关的痴呆、脑卒中后痴呆、精神***症、唐氏(Down)综合征、运动神经元疾病、淀粉样变性、与II型糖尿病相关的淀粉样蛋白、克鲁兹费尔德-雅各布(Creutzfelt-Jakob)病、坏死性细胞死亡、格斯特曼-斯特劳斯勒(Gerstmann-Straussler)综合征、库鲁和动物痒病、与长期血液透析相关的淀粉样蛋白、老年性心脏淀粉样蛋白和家族性淀粉样变性多神经病、脑病、神经内脏病况(neurospanchnic disorder)、记忆丧失、铝中毒、活受试者的细胞中铁水平降低、哺乳动物的游离过渡金属离子水平降低、患者体内或某些身体隔室具有毒性量的金属、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、运动失认症、酒精相关性痴呆、原发性年龄相关的蛋白病、命名性失语、病感失认、失用症、言语失用症、听觉语言失认症、额颞叶痴呆、额颞叶变性、少词性(logopenic)进行性失语、神经原纤维缠结、声音失认症、皮克(Pick)病、原发性进行性失语症、进行性非流利性失语症、语义性痴呆、类固醇性痴呆综合征、中毒性失语、氨基糖甙类药物耳毒性继发作用和***毒性。

与游离氧自由基相关的缺血再灌注损伤包括但不限于：脑卒中、脑缺血、脑干卒中综合征、颈动脉内膜切除术、小脑卒中综合征、中枢性色盲(cerebral achromatopsia)、脑出血、脑梗死、脑静脉窦血栓形成、脑实质内出血、颅内出血、腔隙脑卒中、延髓外侧综合征、脑桥外侧综合征、部分前循环梗死、后循环梗死、无症状脑卒中(silent stroke)、脑卒中相关(stroke Association)、脑卒中高发带(stroke belt)、脑卒中康复、短暂性脑缺血发作、分水岭(Watershed)脑卒中、韦伯(Weber)综合征、肥胖症、移植器官保存、缺血再灌注损伤。

与游离氧自由基相关的感染性疾病包括，但不限于，丙型肝炎、败血症、感染性肌病和败血性休克。

与游离氧自由基相关的肌肉疾病包括但不限于：肌病、线粒体肌病、面肩肱型肌营养不良症、面肩肱型肌营养不良症1型、面肩肱型肌肉营养不良症2型，瑞安定(Ryanodine)受体1(RYR1)相关肌病、硒蛋白1(SEPN1)相关的肌病卡恩斯-赛尔(Kearns–Sayre)综合征、心肌病、活动障碍、固定引起的肌肉萎缩(immobilization-induced muscle atrophy)、骨骼肌烧伤和掌腱膜挛缩症。

与游离氧自由基相关的肺、肾和肝病包括但不限于：囊性纤维化、哮喘、污染引起的疾病、心肺疾病、动脉型肺动脉高压、慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞、尘肺病、支气管扩张、支气管哮喘、呼吸机引起的隔膜功能障碍、肺癌、酒精性脂肪肝疾病、脂肪肝疾病、糖尿病、离体的肾脏保存、丙型肝炎中的肝脏炎症、I型糖尿病的肾功能损伤和肝硬化。

在一个实施方案中，本发明中具体待治疗的疾病是年龄相关性黄斑变性、帕金森病、阿尔茨海默病、缺血再灌注损伤、动脉型肺动脉高压、硬皮病、动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌梗死、关节炎、肺毒性、心肺疾病、炎性疾病、癌症、转移、心脏毒性(包括蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和抗病毒药的心脏毒性)、无论起源的心力衰竭、缺血、心脏病发作、脑卒中、血栓形成和栓塞、哮喘、过敏性/炎症性疾病、支气管哮喘、类风湿性关节炎、炎性肠病、亨廷顿氏(Huntington)舞蹈病、认知障碍、早老症、早老综合征、癫痫性痴呆、早老性痴呆、创伤后痴呆、老年性痴呆、血管性痴呆、HIV-1相关的痴呆、脑卒中后痴呆、唐氏综合症、运动神经元疾病、淀粉样变性病、与Ⅱ型糖尿病相关的淀粉样蛋白、克鲁兹费尔德-雅各布(Creutzfelt-Jakob)病、坏死性细胞死亡、格斯特曼-斯特劳斯勒(Gerstmann-Straussler)综合征、库鲁和动物痒病、与长期血液透析相关的淀粉样蛋白、老年性心脏淀粉样蛋白和家族性淀粉样变性多神经病、脑病、神经内脏病况(neurospanchnicdisorder)、记忆丧失、铝中毒、活受试者的细胞中铁水平降低、哺乳动物的游离过渡金属离子水平降低、患者体内或某些身体隔室具有毒性量的金属、多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化、白内障、糖尿病、癌症、肝脏疾病、皮肤老化、移植、氨基糖苷类药物的耳毒性继发作用、肿瘤和抗肿瘤或免疫抑制剂和化学品的毒性，固有免疫反应、和弗雷德里希(Friedreich)共济失调。

在一个实施方案中，本发明中具体待治疗的疾病是选自以下的游离氧自由基相关的心血管疾病：心肌梗死、心脏毒性(包括蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和抗病毒药的心脏毒性，优选蒽环类药物的心脏毒性)、动脉型肺动脉高压、心力衰竭、心肺疾病、缺血、心脏病发作、脑卒中、血栓形成和栓塞。

在一个实施方案中，本发明中具体待治疗的疾病是衰老疾病、AMD、皮肤老化、心血管疾病(例如蒽环类药物的心脏毒性)、早老症和早老综合征、帕金森病、阿尔茨海默病，弗雷德里希(Friedreich)共济失调、缺血再灌注损伤、心肺疾病、哮喘、癌症、转移和/或污染引起的疾病。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是心脏毒性，优选蒽环类药物的心脏毒性。引起蒽环类药物毒性的机制是指ROS产生和位点特异性DNA损伤。氧化性应激诱导通过诱导DNA损伤、肌节损伤、线粒体功能障碍和促存活信号的丧失、介导心肌细胞的死亡和存活两者，在蒽环类药物的心脏毒性中发挥确凿的作用(Valcovici et al.,2016.Arch.Med.Sci.12(2):428–435)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是肺动脉高压。实际上，已经显示出促进ROS产生的试剂对肺血管的有害作用，反之，抗氧化剂在肺动脉高压的动物模型中的有益作用。因此，ROS产生与肺血管重塑、内皮功能障碍、血管收缩反应改变、炎性和细胞外基质修饰、肺动脉高压病理生理学的所有重要特征直接相关(Freund-Michelet al.,2013.Ther.Adv.Respir.Dis.7(3):175-200)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是缺血再灌注损伤。实际上，ROS的过量产生是再灌注损伤发生的关键因素(Granger et al.,2015.RedoxBiol.6:524-51)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是糖尿病。事实上，慢性高血糖症和随后的活性氧(ROS)升高会破坏细胞功能并增加胰岛素耐受性，从而导致2型糖尿病加重(Kaneto et al.2010.Mediators Inflamm.,2010:453892)，但也有其他类型的糖尿病，诸如MODY(青少年的成年型糖尿病)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是帕金森病。事实上，线粒体功能障碍和氧化性损伤会导致ROS的产生增加，这是帕金森病的受损大脑区域中经常出现的症况(et al.,2016.Parkinsons Dis.2016:7049108)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是黄斑变性。事实上，特别是在视网膜色素上皮细胞中，过量的ROS产生和积累以及氧化性应激在黄斑变性发病机理中起作用。ROS水平在老化的视网膜中增加，导致氧化性应激并在凋亡过程中导致光感受器、视网膜色素上皮细胞和脉络膜毛细血管层的损坏(Nita et al.,2016.Oxid.Med.Cell.Longev.2016:3164734)。

在一个实施方案中，本发明中具体待预防和/或治疗的疾病是硬皮病。事实上，已证明NADPH氧化酶是一种重要的ROS来源，在硬皮病成纤维细胞中被上调，导致大量的ROS积累，而ROS在细胞活性和DNA损伤中起着至关重要的作用(Spadoni et al.,2015.ArthritisRheumatol.67(6):1611-22)。

在一个实施方案中，在本发明中具体待预防和/或治疗的一种疾病是转移。事实上，ROS产生与肿瘤生长和转移的机制(一种命名为“转移性线粒体开关”的机制)有关：通过自然选择与ROS产生和异常的TCA循环活性相关的线粒体表型，促进肿瘤细胞的迁移、侵袭、克隆形成、转移性摄取、自发性转移(Porporato et al.,2014.Cell Reports.8(3):754-766)。ROS的过度产生还促进血管生成，并且相反地ROS产生的抑制剂是抗血管生成产品。

根据一个实施方案，本发明的抑制剂或选择性抑制剂是AOX或其衍生物。

AOX对应于去去甲基茴三硫，也称为5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(AOX)：

根据一个实施例，AOX的衍生物为其生物电子等排体，优选为其酚生物电子等排体。

在一个实施方案中，酚生物电子等排体是例如以下基团、其互变异构体和任选地取代的衍生物：

在一个特定的实施方案中，本发明的优选的酚生物电子等排体是以下那些，其互变异构体和任选地取代的衍生物：

根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂因此是式(I)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中：

X代表S、O或NHOH；优选地，X为S或O；更优选地，X为S；

Y代表CH、C或N；优选地，Y为CH或N；更优选地，Y为CH；

R¹、R²、R⁴和R⁵各自独立地代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；

R³是羟基；或R³和R²与它们所连接的碳原子一起形成5元杂芳基部分，其中–R³-R²-代表–A-CR⁶＝B-或–B＝CR⁶-A-；其中：

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢、C1-C8烷基或烷氧羰基；

B代表CH或N；以及

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基。

根据一个优选的实施方案，在式(I)中：

X代表S、O或NHOH；优选地，X为S；

Y代表CH、C或N；优选地，Y为CH；

R¹、R²、R⁴和R⁵各自独立地代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；优选地，R¹、R²、R⁴和R⁵代表氢。

R³是羟基；或R³和R²与它们所连接的碳原子一起形成5元杂芳基部分，其中–R³-R²-代表–A-CR⁶＝B-；其中

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢，C1-C8代表烷基；

B代表CH或N；以及

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；

根据一个优选的实施方案，X代表S。根据另一个优选的实施方案，X代表O。根据一个优选的实施方案，Y代表CH。根据另一个优选的实施方案，Y代表N。

根据一个优选的实施方案，R³和R²与它们所连接的碳原子一起形成5元杂芳基部分，其中–R³-R²-代表–A-CR⁶＝B-；其中：

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢、C1-C8烷基或烷氧羰基；优选地，R⁷代表氢或烷氧羰基；

B代表CH或N；以及

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；优选地，R⁶代表氢或羟基。

更优选地，–R³-R²-代表–O-C(OH)＝N-或–N(COOMe)-CH＝CH-，更优选地，–R³-R²-代表–O-C(OH)＝N-。

根据另一个优选的实施方案，R³和R²与它们所连接的碳原子一起形成5元杂芳基部分，其中–R³-R²-代表–B＝CR⁶-A-；其中

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢、C1-C8烷基或烷氧羰基；优选地，R⁷代表氢或烷氧羰基；

B代表CH或N；以及

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；优选地，R⁶代表氢或羟基。

更优选地，–R³-R²-代表–N＝C(OH)-S-。

根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂因此是式(I’)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中：

X代表S、O或NHOH；优选地，X为S或O；更优选地，X为S；

Y代表CH、C或N；优选地，Y为CH或N；更优选地，Y为CH；

R¹、R⁴和R⁵各自独立地代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；

R^2’和R^3’与它们所连接的碳原子一起形成5元杂芳基部分，其中–R^3’-R^2’-代表–A-CR⁶＝B-或–B＝CR⁶-A-；其中：

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢、C1-C8烷基或烷氧羰基；

B代表CH或N；以及

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基。

根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是式(II)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、Y、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、A和B如式(I)所定义。

根据一个实施方案，在式(II)中：

X代表S、O或NHOH；优选地，X为S；

Y代表CH、C或N；优选地，Y为CH；

A代表O、S或NR⁷；其中，R⁷代表氢或C1-C8烷基基团；

B代表CH或N；

R¹、R⁴和R⁵各自独立地代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基；

R⁶代表氢、羟基、卤素、氨基、烷基磺酰基、氨基磺酰基、氰基、硝基、羧基、芳基、烷氧基、卤代烷基、烷基氨基、氨基烷基、硝基氧烷基或羧基烷基。

根据一个优选的实施方案，式(II)的化合物为式(IIa)或(IIb)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、Y、A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIa)的化合物。

根据一个优选的实施方案，式(IIa)的化合物为下式(IIa-1)或(IIa-2)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，X、A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIa-1)的抑制剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIa-2)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIa-1)的化合物为(IIa-1’)、(IIa-1”)或(IIa-1”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIa-1’)或(IIa-1”)的抑制剂，更优选地为式(IIa-1’)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIa-2)的化合物为(IIa-2’)、(IIa-2”)或(IIa-2”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIa-2’)或(IIa-2”)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIa-1)和(IIa-2)的化合物具有式(IIa-1a)、(IIa-1b)、(IIa-1c)、(IIa-1d)、(IIa-1e)、(IIa-2a)、(IIa-2b)、(IIa-2c)、(IIa-2d)或(IIa-2e)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIa-1a)、(IIa-1b)、(IIa-1e)、(IIa-2a)、(IIa-2b)或(IIa-2e)的抑制剂，更优选地是(IIa-1a)或(IIa-1e)的抑制剂；更优选是式(IIa-1a)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIb)的化合物为式(IIb’)、(IIb”)和(IIb”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

根据一个优选的实施方案，式(IIb)的化合物为式(IIb-1)、(IIb-2)、(IIb-3)、(IIb-4)或(IIb-5)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷如上所定义。

根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是式(III)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、Y、R¹、R⁴、R⁵、R⁶、A和B如式(I)所定义。

根据一个优选的实施方案，式(III)的化合物为式(IIIa)或(IIIb)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、Y、A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIIa)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIIa)的化合物为式(IIIa-1)或(IIIa-2)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIIa-1)的抑制剂。在另一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIIa-2)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIIa-1)的化合物为(IIIa-1’)、(IIIa-1”)或(IIIa-1”’)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂为式(IIIa-1’)或(IIIa-1”)的抑制剂，更优选地，为式(IIIa-1’)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIIa-2)的化合物为(IIIa-2’)、(IIIa-2”)或(IIIa-2”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIIa-2’)或(IIIa-2”)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIIa-1)和(IIIa-2)的化合物是式(IIIa-1a)、(IIIa-1b)、(IIIa-1c)、(IIIa-1d)、(IIIa-1e)、(IIIa-2a)、(IIIa-2b)、(IIIa-2c)、(IIIa-2d)或(IIIa-2e)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷如上所定义。

在一个优选的实施方案中，本发明的抑制剂是式(IIIa-1a)、(IIIa-1b)、(IIIa-1e)、(IIIa-2a)、(IIIa-2b)或(IIIa-2e)的抑制剂，更优选地，式(IIIa-1b)的抑制剂。

根据一个优选的实施方案，式(IIIb)的化合物为式(IIIb’)、(IIIb”)和(IIIb”’)的化合物

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

根据一个优选的实施方案，式(IIIb)的化合物为式(IIIb-1)、(IIIb-2)、(IIIb-3)、(IIIb-4)或(IIIb-5)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中X、R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷如上所定义。

根据一个具体的实施方案，本发明的抑制剂选自：

5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(AOX)；

5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮(Cp1)；

5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮肟(Cp2)；

5-(4-羟基苯基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(Cp3)；

4-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(Cp4)；

5-(2-羟基苯并[d]

唑-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(Cp5)；

5-(2-羟基苯并[d]噻唑-6-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(Cp6a)；

5-(苯并呋喃-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮(Cp8)；和

5-(3-硫代-3H-1,2-二硫杂环戊烯-5-基)-1H-吲哚-1-羧酸甲酯(Cp9a)。

根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂选自AOX、Cp1、Cp3、Cp4、Cp5、Cp6a和Cp9a。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂选自AOX、Cp1、Cp3、Cp5和Cp6a。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是AOX。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是Cp1。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是Cp3。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是Cp5。根据一个优选的实施方案，本发明的抑制剂是Cp6a。

本发明还涉及一种制备式(IIa-1)的化合物的方法，更特别地是如上所定义的式(IIa-1’)、(IIa-1”)和(IIa-1”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

所述方法包括：

a)在硅氧烷的存在下，使式(C)的化合物与基于硫的试剂环合，

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；优选地，所述基于硫的试剂是P₄S₁₀；优选地，所述硅氧烷是六甲基二硅氧烷(Me₃SiOSiMe₃,HMDO)；

获得如上所定义的式(IIa-1’)的化合物；

以及可选地，

b1)式(IIa-1’)的化合物可以与氧化剂反应；优选地，所述氧化剂是乙酸汞Hg(OAc)₂；以获得如上所定义的式(IIa-1”)的化合物；或

b2)在碱的存在下，式(IIa-1’)的化合物可以与羟胺NH₂OH-HCl反应；优选地，所述碱是乙酸钠(AcONa)；以获得如上所定义的式(IIa-1”’)的化合物。

根据一个实施方案，一种制备式(IIa-1)的化合物的方法可以包括制备中间体(C)的预备步骤，所述预备步骤包括在氯化镁(MgCl₂)，然后二咪唑基酮和然后HCl的存在下，使式(A)的酸衍生物与3-甲氧基-3-氧代丙酸(B)反应：

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

从而获得式(C)的化合物。

根据一个实施方案，一种制备式(IIa-1)的化合物的方法可以包括制备中间体(C)的预备步骤，所述预备步骤包括在氢化钠存在下，使式(A’)的酸衍生物与碳酸二甲酯反应：

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

从而获得式(C)的化合物。

本发明还涉及制备式(IIa-2)、更具体地式(IIa-2’)和(IIa-2”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物的方法，其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

所述方法包括在碱的存在下，将式(E)的化合物与二硫化碳(CS₂)环合，

其中A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；优选地，碱是氢化钠(NaH)；从而获得如上所定义的式(IIa-2’)的化合物；

以及可选地，在碱的存在下，式(IIa-2’)的化合物可以与羟胺NH₂OH-HCl反应；优选地，碱是乙酸钠(AcONa)；获得如上所定义的式(IIa-2”’)的化合物。

本发明还涉及一种制备式(IIa-2”)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物的方法，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

所述方法包括使式(E)的化合物与氯羰基亚磺酰氯反应，

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

从而获得式(IIa-2”)的化合物。

根据一个实施方案，中间体(E)可以通过使酰胺衍生物(D)与Lawesson's试剂反应以获得如上所定义的式(E)的化合物而获得

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义。

根据一个实施方案，酰胺中间体(D)可以通过在碱的存在下使式(A)的酸衍生物与尿素CO(NH₂)₂反应；

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

优选地，碱是吡啶(C₅H₅N)；获得式(D)的化合物。

本发明还涉及一种制备式(IIb)的化合物、更具体地式(IIb’)、(IIb”)和(IIb”’)的化合物：

或其药学上可接受的互变异构体、盐或溶剂化物的方法，其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

所述方法包括：

a)在Lawesson试剂的存在下，使式(G)的化合物与硫基试剂环合；

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

优选地，硫基试剂为八硫S₈；获得如上所定义的式(IIb’)的化合物；

以及可选地：

b1)式(IIb’)的化合物可以与氧化剂反应；优选地，氧化剂是乙酸汞Hg(OAc)₂；以获得如上所定义的式(IIb”)的化合物；或

在碱的存在下，式(IIb’)的化合物可以与羟胺NH₂OH-HCl反应；优选地，碱是乙酸钠(AcONa)；以获得如上所定义的式(IIb”’)的化合物。

根据一个实施方案，制备式(IIb)的化合物的方法可以包括制备中间体(G)的预备步骤，所述预备步骤包括在碱的存在下，使式(F)的酯衍生物与路易斯酸反应；

其中，A、B、R¹、R⁴、R⁵和R⁶如上所定义；

优选地，所述路易斯酸为TiCl₄；优选地，所述碱是三乙胺(Et₃N)；获得如上所定义的式(G)的化合物。

本发明还涉及一种包含本发明的抑制剂或选择性抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成的组合物。

本发明还涉及一种用于治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病中使用的组合物，其包含上述抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种用于治疗与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗与游离氧自由基相关的疾病中使用的组合物，其中所述组合物包含ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种药物组合物，其包含本发明的抑制剂或选择性抑制剂以及至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种用于治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病中使用的药物组合物，其包含如上所述的抑制剂以及至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种用于治疗与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗与游离氧自由基相关的疾病中使用的药物组合物，其中所述药物组合物包含ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂，或由其组成，或基本上由其组成。

合适的赋形剂包括水，盐水，林格溶液，右旋糖溶液，以及乙醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸盐、乙酸盐、明胶、胶原蛋白、卡波姆植物油的溶液等。合适的赋形剂还可以额外地包括合适的防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、抗微生物剂和缓冲剂，例如BHA、BHT、柠檬酸、抗坏血酸、四环素等。

可以用于本发明的组合物中的药学上可接受的赋形剂的其他实例包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾，氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

另外，一些赋形剂可以包括表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)；合适的载体，例如包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物的溶剂和分散介质，以及植物油，例如花生油和芝麻油；等渗剂，例如糖或氯化钠；包衣剂，例如卵磷脂；延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶；防腐剂，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、氯丁醇、硫柳汞等；缓冲液，例如硼酸、碳酸氢钠、碳酸氢钾、硼酸钠、硼酸钾、碳酸钠、碳酸钾、乙酸钠、磷酸二氢钠等；张力剂，例如葡聚糖40、葡聚糖70、右旋糖、甘油、氯化钾、丙二醇、氯化钠；抗氧化剂和稳定剂，例如亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、硫代亚硫酸钠、硫脲等；非离子润湿剂或澄清剂，例如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆282和泰洛沙泊；粘度调节剂，例如葡聚糖40、葡聚糖70、明胶、甘油、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素、羊毛脂、甲基纤维素、矿脂、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素；等等。

药学上可接受的赋形剂的其他实例是环糊精(CD)及其衍生物。环糊精可以改善活性组分的溶解和/或稳定性。优选地，环糊精为β-环糊精。在一个实施方案中，环糊精选自SBE-环糊精(SBE：磺丁基基醚)和HP-环糊精(HP：羟丙基)或其衍生物。在一个实施方案中，环糊精为SBE-环糊精，优选为SBE-β-环糊精。在一个实施方案中，环糊精是HP-环糊精，优选HP-β-环糊精。

本发明还涉及一种包含本发明的抑制剂或选择性抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成的药物。

本发明还涉及一种用于治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗有此需要的受试者的与游离氧自由基相关的疾病中使用的药物，其包含如上所述的抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种用于治疗与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗与游离氧自由基相关的疾病中使用的药物，其中所述药物包含ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成。

本发明还涉及一种包含本发明的抑制剂的化妆品组合物。

本发明还涉及一种包含本发明的抑制剂的药妆组合物。

本发明的另一个目的是包含本发明的抑制剂，或由其组成，或基本上由其组成的保存介质或储存介质。

在一个实施方案中，保存介质用于储存器官、生物组织和/或活细胞。在一个实施方案中，所述器官包括但不限于心脏、肝脏、肾脏、肺、胰腺、肠、皮肤和角膜。在一个实施方案中，所述器官用于移植，即，将任何器官或身体组织从其原位点转移到受***点。具体而言，在同种异体移植过程中，移植器官的原位点在供体个体中，而受体部位在另一个受体个体中。

在一个实施方案中，保存介质包含浓度范围为0.1μM-120μM，即浓度为约0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、15μM、20μM、30μM、40μM、50μM、75μM、100μM或120μM的本发明的抑制剂。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物或药妆组合物会被全身或局部施用。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物或药妆组合物将通过口服、经注射、局部地、经鼻、经颊、经直肠、经***、经气管内、经内窥镜、经粘膜和经皮施用。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物或药妆组合物被注射，优选地，被全身注射。适用于全身注射的制剂的实例包括但不限于液体溶液、或悬浮液、固体形式，该固体形式适合于在注射之前溶解或悬浮于液体中。全身注射的实例包括但不限于静脉内、皮下、肌内、皮内和腹膜内注射、以及灌注。在另一个实施方案中，当注射时，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物或药妆组合物是无菌的。获得无菌的药物组合物的方法包括但不限于GMP合成(GMP代表“良好生产规范(Goodmanufacturing practice)”)。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物通过口服施用。适于口服施用的制剂的实例包括但不限于固体形式、液体形式和凝胶。适于口服的固体形式的实例包括但不限于丸剂、片剂、胶囊、软明胶胶囊、明胶硬胶囊、囊片、压制片剂、扁囊剂、薄片(wafer)、糖衣丸剂、糖衣片剂、或分散剂/或崩解片剂、粉剂、适于在口服施用之前溶解或悬浮于液体中的固体形式、和泡腾片剂。适于口服施用的液体形式的实例包括但不限于溶液剂、混悬剂、可饮用溶液剂、酏剂(elixirs)、密封的小瓶、饮剂(potion)、浸液(drench)、糖浆和液剂(liquor)。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物是局部施用的。适于局部施用的制剂的实例包括但不限于棒、唇膏、蜡、乳膏、洗剂、软膏、药膏(balms)、凝胶、唇彩(gloss)、防晒制剂、化妆品、面膜、免洗洗剂或清洁剂、脱毛剂等。

局部施用表征了将本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物直接施用或应用于感兴趣的部位以局部产生作用(通常在其的一个或多个暴露的表面或外表面上，例如暴露在外且视觉可见的表皮的最外层)，诸如使用手、手指或各种各样的美容工具(卷起(roll-up)、走珠或其他棒状容器、管状容器、棉球、粉扑、棉签、泵、刷子、垫子、布等)。可以例如通过敷、放置、摩擦、擦拭、倾倒、铺展和/或按摩到皮肤中或皮肤上，或者通过任何其他方便或合适的方法来进行应用。优选地，局部施用是有效的，而受试者的血流对组合物的组分没有任何显著吸收(以避免全身作用)。

可以将本发明的组合物、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物与例如作为防腐剂的1％或2％(w/w)的苄醇、乳化蜡、甘油、棕榈酸异丙酯、乳酸、纯净水和山梨醇溶液混合，以形成白色、光滑、均匀、不透明的乳膏或洗剂。另外，该组合物可以包含聚乙二醇400(PEG400)。它们可以与例如作为防腐剂的2％(w/w)的苄醇、白色矿脂、乳化蜡和tenox II(丁基羟基茴香醚、没食子酸丙酯、柠檬酸、丙二醇)混合以形成软膏。可以用溶液、洗剂、乳膏、软膏或其他能够用于局部应用的此类形式的组合物浸渍编织垫或绷带材料卷，例如纱布。

在另一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物也可以使用透皮系统局部应用，诸如具有浸渍有该组合物并层压至不可渗透的衬背的树脂交联剂的基于丙烯酸聚合物粘合剂中的一种。

在一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物可以作为透皮贴剂施用，更特别地作为缓释透皮贴剂施用。透皮贴剂可以包括任何常规形式，诸如粘合剂基质、聚合物基质、储库型贴剂、基质或单片型层压结构，并且通常由一个或多个衬背层、粘合剂、渗透促进剂、任选的速率控制膜和在应用之前被移除以暴露粘合剂的离型衬垫。聚合物基质贴剂还包含聚合物基质形成材料。合适的透皮贴剂在例如美国专利第5,262,165号、第5,948,433号、第6,010,715号和第6,071,531号中有更详细的描述，其每个的公开内容整体并入本文。

适于透皮施用的制剂的实例包括但不限于软膏、糊剂、乳膏、膜剂、香脂、贴剂(例如透皮贴剂)、凝胶、脂质体形式等。

在一个实施方案中，透皮组合物是软膏、糊剂、乳膏；膜剂、香脂、贴剂(例如透皮贴剂)、凝胶、脂质体形式等。

在本发明的一个实施方案中，该软膏是一种油性软膏；乳化软膏，例如水包油或油包水软膏；或水溶性软膏，优选是油性软膏。

在本发明的一个实施方案中，该油性软膏使用基质，例如植物油和动物油；动植物脂肪；蜡；凡士林，例如白色凡士林或凡士林油；和石蜡，例如液体石蜡或石蜡油。

在本发明的一个实施方案中，透皮组合物还包含一种或多种赋形剂。合适的药学上可接受的赋形剂是技术人员众所周知的。合适的赋形剂的实例包括但不限于载体、乳化剂、硬化剂、流变改性剂或增稠剂、表面活性剂、润肤剂、防腐剂、湿润剂、缓冲剂、溶剂、保湿剂和稳定剂。

在另一个实施方案中，具体的施用途径可以是眼内施用。在另一个实施方案中，施用途径可以是局部眼部施用，例如滴眼剂的施用或通过在包含本发明的抑制剂的眼用溶液中洗眼。

眼用溶液是指预期在眼球和/或结膜上施用，或在结膜囊中***或在眼睛的后段施用的无菌液体、半固体或固体制剂。如本文所用，术语“眼睛的后段”指的是眼睛的后三分之二，包括前玻璃体膜和其后的结构(玻璃体液、视网膜、脉络膜、视神经)。特别地，眼用组合物可以例如通过玻璃体内注射施用到玻璃体内。眼科用组合物的实例包括但不限于滴眼剂、眼用洗剂、用于滴眼剂的粉末和用于眼用洗剂的粉末，以及注射到结膜囊或玻璃体内的组合物。

载体的实例包括但不限于水；缓冲盐水；矿油(凡士林，也称为白色软石蜡)；矿脂；油，例如矿物油、植物油、动物油、石蜡油、蓖麻油或凡士林油；有机和无机蜡，例如微晶蜡、石蜡、蜂蜡和地蜡；天然聚合物，例如黄原胶(xanthanes)、明胶、纤维素、胶原蛋白、淀粉或***胶；合成聚合物；醇类；多元醇等。在本发明的一个实施方案中，载体是基质乳膏，其包含乳化剂、油相组分和水相组分。

众所周知的软膏或洗剂的基质赋形剂的实例包括但不限于凡士林，Plastibase^TM(这是一种用聚乙烯(平均分子量约为21000Da)和液体石蜡制备的基质)和ESMA-P^TM(由微晶蜡制成)。

乳化剂的实例包括但不限于单独的鲸蜡醇、鲸蜡硬脂醇、硬脂醇、羧化聚乙烯、聚卡波非、聚乙二醇及其衍生物、聚氧乙烯及其衍生物(例如聚山梨酯20或聚山梨酯80)，或与脂肪醇(例如鲸蜡醇、硬脂醇和鲸蜡硬脂醇)和脱水山梨醇酯(例如脂肪酸脱水山梨醇酯)的组合。

油相组分的实例包括但不限于凡士林，例如白凡士林、黄凡士林或凡士林油；石蜡，例如液体石蜡或石蜡油；二甲聚硅氧烷及其混合物。

水相组分的实例包括但不限于水、甘油和丙二醇。

硬化剂的实例包括但不限于硬脂醇、鲸蜡硬脂醇和鲸蜡醇。

流变改性剂或增稠剂的实例包括但不限于卡波姆(例如

)，和聚氧乙烯牛脂胺(例如

)。

表面活性剂的实例包括但不限于阴离子、阳离子、两性和非离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、十二烷基硫酸镁、蜡或其组合。

润肤剂的实例包括但不限于白矿脂或黄矿脂(白凡士林或黄凡士林)、液体矿脂(液体凡士林)、石蜡、或优色林(aquaphor)。

防腐剂的实例包括但不限于抗微生物防腐剂，例如尼泊金(羟基苯甲酸甲酯)、尼泊索(羟基苯甲酸酯)、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯钾、对羟基苯甲酸丙酯钠；对羟基苯甲酸酯类；山梨酸；山梨酸钾；苯甲酸；对羟基苯甲酸酯类；氯丁醇；苯酚；硫柳汞；苯甲酸钠和苯甲醇。

湿润剂的实例包括但不限于丙二醇和藻酸丙二醇酯。

缓冲剂的实例包括但不限于氢氧化钠、柠檬酸和氢氧化钾。

溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、苯甲醇和丙二醇。

保湿剂的实例包括但不限于甘油、矿物油、聚氧乙烯硬化的蓖麻油和凡士林、丙二醇；石蜡；蜡，例如蜂蜡；聚乙二醇或其混合物，例如macrogol(macrogol是不同分子量的聚乙二醇的混合物)；硬脂醇；苄醇；对羟基苯甲酸酯(对羟基苯甲酸酯类)；胶凝烃；柠檬酸；角鲨烯；羊毛脂；甘油；聚氧乙烯硬化的蓖麻油；脱水山梨醇脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯；动物和植物脂肪；油；淀粉；黄芪胶；纤维素衍生物；硅酮；膨润土；硅酸；膨润土；氧化锌及其混合物。

稳定剂的实例包括但不限于碳水化合物，例如蔗糖、乳糖和海藻糖；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；氨基酸，例如组氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和精氨酸。

在本发明的一个实施方案中，本发明的组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物可以与有利于将试剂递送至中枢神经系统的递送系统结合使用。例如，各种血脑屏障(BBB)的通透性增强剂可以用于瞬时和可逆地增加血脑屏障对治疗剂的通透性。这种BBB的通透性增强剂包括但不限于白细胞三烯、缓激肽激动剂、组胺、紧密连接破坏剂(例如连蛋白、zot)、高渗溶液(例如甘露醇)、细胞骨架收缩剂和短链烷基甘油(例如1-O-戊基甘油)。经口服、经舌下、经肠胃外、移植、经鼻和吸入途径可以将活性剂递送至中枢神经系统。在一些实施方案中，可以将本发明的化合物以对周围神经系统的影响最小的方式施用于中枢神经系统。

血脑屏障(BBB)是中枢神经系统(CNS)中的血管与CNS本身的大部分区域之间的物理屏障和细胞运输机制系统。BBB通过限制血液中潜在的有害化学物质的进入并允许必需营养物质的进入来维持体内平衡。然而，BBB会成为将药理学药剂递送到CNS以治疗病症或维持或增强正常和理想的大脑功能(诸如认知、学习和记忆)的强大障碍。

在一个实施方案中，抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物以缓释形式施用。在另一个实施方案中，该组合物、药物组合物、或药物包含控制调节剂释放的递送系统。

在一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物以技术人员确定的且适合于每个受试者的剂量施用。

应当理解，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的每日总用量会由主治医师在合理的医学判断范围内决定。对于任何具体的患者而言，特定的治疗有效量会取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和该疾病的严重程度；所使用的特定组合物、受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径、治疗持续时间；与本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物组合或同时使用的药物；以及医学领域众所周知的因素。例如，以治疗化合物的剂量水平低于获得期望的治疗效果所需剂量开始，并逐渐增加剂量直至获得期望的效果，这在本领域技术范围内；但是相反，从负荷剂量开始(这是一种更快地达到稳态血浆浓度的方式)，然后再施用计算出的维持剂量以精确补偿消除作用的效果，能够同样有用。

在一个实施方案中，每天至少一次、每天两次、每天至少三次施用治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物。

在另一个实施方案中，每两、三、四、五、六天施用治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物。

在另一个实施方案中，每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次施用治疗有效量的本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约1μg/天-约100mg/天、约1μg/天-约50mg/天、约1μg/天-约10mg/天、约1μg/天-约9mg/天、约1μg/天-约8mg/天、约1μg/天-约7mg/天、约1μg/天-约6mg/天、约1μg/天-约5mg/天、约1μg/天-约4mg/天、约1μg/天-约3mg/天、约1μg/天-约2mg/天、约1μg/天-约1mg/天、约1μg/天-约100μg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约1μg/天-约10mg/天、约5μg/天-约10mg/天、约10μg/天-约7.5mg/天、约10μg/天-约5mg/天、约10μg/天-约2.5mg/天、约10μg/天-约2mg/天、约10μg/天-约1mg/天、约10μg/天-约0.75mg/天、约10μg/天-约1mg/天、约10μg/天-约0.5mg/天、从约10μg/天-约0.25mg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.1mg/天-约2000mg/天、约0.1mg/天-约1500mg/天、约0.1mg/天-约1000mg/天、约0.1mg/天-约500mg/天、约0.1mg/天-约200mg/天、约0.5mg/天-约2000mg/天、约0.5mg/天-约1500mg/天、约0.5mg/天-约1000mg/天、约0.5mg/天-约500mg/天、约0.5mg/天-约200mg/天、约1mg/天-约2000mg/天、约1mg/天-约1500mg/天、约1mg/天-约1000mg/天、约1mg/天-约500mg/天、约1mg/天-约200mg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约1μg/天、约2μg/天、约4μg/天、约6μg/天、约8μg/天、约10μg/天、约15μg/天、约20μg/天、约25μg/天、约30μg/天、约35μg/天、约40μg/天、约45μg/天、约50μg/天、约55μg/天、约60μg/天、约65μg/天、约70μg/天、约75μg/天、约80μg/天、约85μg/天、约90μg/天、约95μg/天、约100μg/天、约150μg/天、约200μg/天、约250μg/天、约300μg/天、约350μg/天、约400μg/天、约450μg/天、约500μg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.1mg/天、0.2mg/天、0.3mg/天、0.4mg/天、0.5mg/天、0.6mg/天、0.7mg/天、0.8mg/天、0.9mg/天、1mg/天、2mg/天、4mg/天、6mg/天、8mg/天、10mg/天、15mg/天、20mg/天、25mg/天、30mg/天、35mg/天、40mg/天、45mg/天、50mg/天、75mg/天、100mg/天、125mg/天、150mg/天、175mg/天、200mg/天、300mg/天、400mg/天、500mg/天、600mg/天、700mg/天、800mg/天、900mg/天、1000mg/天、1200mg/天、1400mg/天、1600mg/天、1800mg/天、2000mg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.1μg/kg/天-约10mg/kg/天、约0.1μg/kg/-约5mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约1mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.9mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.8mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.7mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.6mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.5mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.4mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.3mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.2mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约0.1mg/kg/天、约0.1μg/kg/天-约10μg/kg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.1μg/kg/天-约1mg/kg/天、约0.5μg/kg/天-约1mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.75mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.5mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.25mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.2mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.1mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.075mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.05mg/kg/天、约1μg/kg/天-约0.025mg/kg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.01mg/kg/天-约20mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约15mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约12mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约10mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约9mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约8mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约7mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约6mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约5mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约4mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约3mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约2mg/kg/天、约0.01mg/kg/天-约1mg/kg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.1μg/kg/天、约0.2μg/kg/天、约0.4μg/kg/天、约0.6μg/kg/天、约0.8μg/kg/天、约1μg/kg/天、约1.5μg/kg/天、约2.0μg/kg/天、约2.5μg/kg/天、约3.0μg/kg/天、约3.5μg/kg/天、约4.0μg/kg/天、约4.5μg/kg/天、约5.0μg/kg/天、约5.5μg/kg/天、约6.0μg/kg/天、约6.5μg/kg/天、约7.0μg/kg/天、约7.5μg/kg/天、约8.0μg/kg/天、约8.5μg/kg/天、约9.0μg/kg/天、约9.5μg/kg/天、约10.0μg/kg/天、约15.0μg/kg/天、约20.0μg/kg/天、约25.0μg/kg/天、约30.0μg/kg/天、约35.0μg/kg/天、约40.0μg/kg/天、约45.0μg/kg/天、约50.0μg/kg/天。

在本发明的一个实施方案中，待施用于受试者的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的日量为约0.01mg/kg/天、约0.02mg/kg/天、约0.03mg/kg/天、约0.04mg/kg/天、约0.05mg/kg/天、约0.06mg/kg/天、约0.07mg/kg/天、约0.08mg/kg/天、约0.09mg/kg/天、约0.1mg/kg/天、约0.2mg/kg/天、约0.3mg/kg/天、约0.4mg/kg/天、约0.5mg/kg/天、约0.6mg/kg/天、约0.7mg/kg/天、约0.8mg/kg/天、约0.9mg/kg/天、约1mg/kg/天、约1.5mg/kg/天、约2mg/kg/天、约2.5mg/kg/天、约3mg/kg/天、约3.5mg/kg/天、约4mg/kg/天、约4.5mg/kg/天、约5mg/kg/天、约6mg/kg/天、约7mg/kg/天、约8mg/kg/天、约9mg/kg/天、约10mg/kg/天、约12mg/天kg/天、约14mg/kg/天、约16mg/kg/天、约18mg/kg/天、约20mg/kg/天。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的施用量为约1μg-约100mg、约1μg-约50mg、约1μg-约10mg、约1μg-约9mg、约1μg-约8mg、约1μg-约7mg、约1μg-约6mg、约1μg-约5mg、约1μg-约4mg、约1μg-约3mg、约1μg-约2mg、约1μg-约1mg、约1μg-约100μg。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的施用量为约1μg-约10mg、约5μg-约10mg、约10μg-约7.5mg、约10μg-约5mg、约10μg-约2.5mg、约10μg-约2mg、约10μg-约1mg、约10μg-约0.75mg、约10μg-约0.5mg、约10μg-约0.25mg。

在另一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的施用量为约0.02mg-约2000mg、约0.02mg-约1500mg、约0.02mg-约1000mg、约0.02mg-约500mg、约0.02mg-约200mg、约0.02mg-约100mg、约0.02mg-约50mg、约0.02mg-约25mg、约0.02mg-约10mg、约0.02mg-约5mg。

在另一个实施方案中，本发明的抑制剂、组合物、药物组合物、药物、化妆品组合物、或药妆组合物的施用量为约0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg、5mg、5.5mg、6mg、6.5mg、7mg、7.5mg、8mg、8.5mg、9mg、9.5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1200mg、1400mg、1600mg、1800mg、2000mg。

在一个实施方案中，本发明的方法用于慢性治疗。在另一个实施方案中，本发明的方法用于急性治疗。

在本发明的一个实施方案中，受试者被诊断为患有与游离氧自由基相关的疾病。在本发明的另一个实施方案中，受试者处于患有与游离氧自由基相关的疾病的风险。

在一个实施方案中，所述受试者是成年人、青少年、儿童、幼儿或新生儿。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基产生而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中至少一种与游离氧自由基相关的疾病的方法，或用于有此需要的受试者中至少一种与游离氧自由基相关的疾病的治疗和/或预防方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者的至少一种与游离氧自由基相关的疾病，或用于有此需要的受试者的至少一种与游离氧自由基相关的疾病的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者的至少一种与游离氧自由基相关的疾病，或用于有此需要的受试者的至少一种与游离氧自由基相关的疾病的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的与游离氧自由基相关的心血管疾病，或用于有此需要的受试者中的与游离氧自由基相关的心血管疾病的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的与游离氧自由基有关的心血管疾病，或用于有此需要的受试者中的与游离氧自由基有关的心血管疾病的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的与游离氧自由基有关的心血管疾病，或用于有此需要的受试者中的与游离氧自由基有关的心血管疾病的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的心肌梗死，或用于有此需要的受试者中的心肌梗死的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的心肌梗死，或用于有此需要的受试者中的心肌梗死的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种治疗和/或预防有此需要的受试者中的心肌梗死，或用于有此需要的受试者中的心肌梗死的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者的心力衰竭，或用于有此需要的受试者中的心力衰竭的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的心力衰竭，或用于有此需要的受试者中的心力衰竭的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的心力衰竭，或用于有此需要的受试者中的心力衰竭的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的心脏毒性，或用于有此需要的受试者中的心脏毒性的治疗和预防的方法，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性；所述方法包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的心脏毒性，或用于有此需要的受试者中的心脏毒性的治疗和预防的方法，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性；所述方法包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的心脏毒性，或用于有此需要的受试者中的心脏毒性的治疗和预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性；所述方法包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的肺动脉高压，或用于有此需要的受试者中的肺动脉高压的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的肺动脉高压，或用于有此需要的受试者中的肺动脉高压的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的肺动脉高压，或用于有此需要的受试者中的肺动脉高压的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤，或用于有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤，或用于有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤，或用于有此需要的受试者中的缺血再灌注损伤的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的衰老疾病，或用于有此需要的受试者中的衰老疾病的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来治疗和/或预防有此需要的受试者中的衰老疾病，或用于有此需要的受试者中的衰老疾病的治疗和/或预防的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于治疗和/或预防有此需要的受试者中的衰老疾病，或用于有此需要的受试者中的衰老疾病的治疗和/或预防，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于增加有此需要的受试者中的胰岛素分泌的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来增加有此需要的受试者中的胰岛素分泌的方法，包括施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种增加有此需要的受试者中的胰岛素分泌，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种保护有此需要的受试者中的神经元的方法，包括向受试者施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来保护有此需要的受试者中的神经元的方法，包括施用有效量的ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种用于保护有此需要的受试者中的神经元，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括施用有效量的线粒体ROS产生的抑制剂或选择性抑制剂。

本发明的另一个目的是一种保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的方法，包括使所述器官、生物组织和/或活细胞与ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂接触。

本发明的另一个目的是一种通过作用于复合物I的位点I_Q的线粒体来保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的方法，包括使所述器官、生物组织和/或活细胞与ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂接触。

本发明的另一个目的是一种保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞，而不抑制胞质ROS产生的方法，包括使所述器官、生物组织和/或活细胞与ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂接触。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病，或在治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心肌梗死，或在治疗和/或预防心肌梗死中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防心肌梗死，或在治疗和/或预防心肌梗死中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心肌梗死，或在治疗和/或预防心肌梗死中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心力衰竭，或在治疗和/或预防心力衰竭中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防心力衰竭，或在治疗和/或预防心力衰竭中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心力衰竭，或在治疗和/或预防心力衰竭中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心脏毒性，或在治疗和/或预防心脏毒性中使用，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防心脏毒性，或在治疗和/或预防心脏毒性中使用，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防心脏毒性，或在治疗和/或预防心脏毒性中使用，而不抑制胞质ROS产生；所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性；或在治疗和/或预防其的过程中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防肺动脉高压，或在治疗和/或预防肺动脉高压中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防肺动脉高压，或在治疗和/或预防肺动脉高压中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防肺动脉高压，或在治疗和/或预防肺动脉高压中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤，或在治疗和/或预防缺血再灌注损伤中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤，或在治疗和/或预防缺血再灌注损伤中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤，或在治疗和/或预防缺血再灌注损伤中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于治疗和/或预防衰老疾病，或在治疗和/或预防衰老疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于治疗和/或预防衰老疾病，或在治疗和/或预防衰老疾病中使用。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，用于治疗和/或预防衰老疾病，或在治疗和/或预防衰老疾病中使用，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于增加胰岛素分泌。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来用于增加胰岛素分泌。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于增加胰岛素分泌，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于保护神经元。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体而用于保护神经元。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于保护神经元，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞。

本发明的另一个目的是一种ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂，其用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞，而不抑制胞质ROS产生。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生，而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心肌梗死的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防心肌梗死的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心肌梗死而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心力衰竭的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防心力衰竭的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心力衰竭而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心脏毒性的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防心脏毒性的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防心脏毒性，而不抑制胞质ROS产生的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防肺动脉高压的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防肺动脉高压的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防肺动脉高压而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防衰老疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于治疗和/或预防衰老疾病的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于治疗和/或预防衰老疾病而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于增加胰岛素分泌的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于增加胰岛素分泌的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于增加胰岛素分泌，而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于保护神经元的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于保护神经元的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于保护神经元，而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂保存器官、生物组织和/或活细胞，优选地在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞，而不抑制胞质ROS产生的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于抑制有此需要的受试者中的游离氧自由基的产生，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的疾病，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防至少一种与游离氧自由基相关的心血管疾病，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心肌梗死的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防心肌梗死的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心肌梗死，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心力衰竭的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防心力衰竭的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心力衰竭，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心脏毒性的药物中的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防心脏毒性的药物中的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防心脏毒性，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途，所述心脏毒性优选蒽环类药物的心脏毒性、抗癌药的心脏毒性、喹诺酮类药物的心脏毒性和/或抗病毒药的心脏毒性，更优选蒽环类药物的心脏毒性。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防肺动脉高压的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防肺动脉高压的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防肺动脉高压，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防缺血再灌注损伤的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防缺血再灌注损伤，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防衰老疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来治疗和/或预防衰老疾病的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于治疗和/或预防衰老疾病，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于增加胰岛素分泌的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来增加胰岛素分泌的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于增加胰岛素分泌，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于保护神经元的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体来保护神经元的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于保护神经元，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备通过作用于复合物I的位点I_Q处的线粒体，用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞的药物中的用途。

本发明的另一个目的是ROS的线粒体产生的抑制剂或选择性抑制剂在制备用于保存器官、生物组织和/或活细胞，优选在移植程序之前保存器官、生物组织和/或活细胞，而不抑制胞质ROS产生的药物中的用途。

附图说明

图1显示AOL(5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮)对线粒体呼吸没有作用。图A：在AOL(在本实例中为20μM)存在下孵育后，从大鼠心脏分离的线粒体氧化作为底物的谷氨酸盐+苹果酸盐(GM)。磷酸化由二磷酸腺苷(ADP)触发，并由苍术苷(ATR)(腺嘌呤转运蛋白的特异性抑制剂)终止。图B至图D：在AOL浓度增加(5μM至80μM)的情况下对各种呼吸底物存在下的线粒体氧化性磷酸化进行经典研究。添加AOL后，不同能量状态下的线粒体呼吸没有统计学差异。添加ADP后的氧化率反映了分离的线粒体的三磷酸腺苷(ATP)合成活性。

图2显示在ATR(态4)的存在下，在复合物I和III两者的底物的存在下，由分离的线粒体产生氧自由基的主要位点，以获得最大的线粒体ROS产生。如前所述，线粒体ROS的产生高度依赖于线粒体的活性和条件。尽管AOL已在多种条件下进行了测试，但为清楚起见，我们选择在此处仅提供最具证明性的结果。向整个链提供电子的所有底物(即谷氨酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐)的存在最接近细胞中的原位条件。在这些底物条件下，我们评估了AOL的存在对通过ATR(抑制磷酸化：最大产量)下完整链以及通过复合物I(被鱼藤酮抑制)和复合物II(被抗霉素A抑制)的ROS产生的影响。颜色参考图3。

图3表示在ATR(态4)的存在下，在复合物I和II的底物存在下，AOL(5μM-80μM)对分离的线粒体的ROS/H₂O₂产生的影响，鱼藤酮、抗霉素A和粘噻唑的影响。在不存在复合物的特异性抑制剂的情况下，ROS产生最多，并且主要来自位点I_Q的反向电子传递(见图4)。加入通过抑制I_Q特异性反向电子传递的鱼藤酮后，产量降低，并且几乎全部发生在位点III_QO。随后加入阻止电子向氧转移的抗霉素A，从而增加了位点III_QO的ROS产生，并且最后，粘噻唑阻止了位点III_QO的ROS产生(详见图2)。

图4是表示AOL对线粒体ROS产生的作用位点和AOL没有作用或作用很小的位点的示意图。

图5是显示10μM和20μM AOL对从雄性C57Bl/6J小鼠分离的胰岛中的葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的影响的直方图。显示三个实验的组合。每个实验使用两只小鼠的胰岛；每个孔有五个胰岛；每个条件需要四至六个孔。将胰岛素分泌数据相对于11mM Glc-Veh组(认为是100％)进行标准化。相比于3mM Glc-Veh的*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001；相比于11mM Glc-Veh的#p<0.05、##p<0.01和###p<0.001；单因素方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验。

图6是显示治疗3周后测定的脂肪量的直方图。脂肪量以克(g)表示。数据表示为平均值±SEM。

图7是显示治疗3周后测定的瘦体重的直方图。瘦体重以克(g)表示。数据表示为平均值±SEM。

图8是显示在胰岛素耐受性测试(ITT)期间用AOL(5mg/kg和10mg/kg)慢性治疗对葡萄糖响应的影响的图。该图表示ITT期间血糖水平的变化。数据表示为平均值±SEM。

图9是显示AOL对血糖水平的影响的直方图。治疗五周后，对禁食2小时的小鼠测量血糖。数据表示为平均值±SEM。

图10是显示在MPTP治疗的小鼠中，AOL(5mg/kg，bid，11天)对SN中TH阳性细胞计数的神经保护作用的直方图。数据以平均值±SEM(n＝10-11)表示，并使用ANOVA和邓内特(Dunnett)多重比较检验进行分析。**P<0.01；***P<0.001c.f.MPTP+溶媒(vehicle)。

图11是显示缺血后再灌注阶段期间，AOL对心脏收缩力恢复的影响的图。数据表示为6个独立实验的平均值±SEM，对照(黑色)和AOL治疗(灰色)。

图12是显示AOL对缺血性心脏切片的梗死面积的影响的图。在再灌注期结束时，用氯三苯四唑(TTC)对心脏进行染色。活组织显示为红色，而受损组织显示为白色。

图13是显示了AOL治疗对肺动脉压和心脏重塑的影响的一组两幅图。图A：在常氧大鼠(N，白色柱)、慢性低氧大鼠(CH，浅灰色柱)和经野百合碱治疗的大鼠(MCT，深灰色柱)中，AOL(阴影柱)对测量的平均肺动脉压(mPAP)的影响。图B：以富尔顿指数表示的右心室肥大(即右心室重量(RV)与左心室加上隔膜重量(LV+S)的比率)。n是大鼠的数量。*、**和***分别表示相比于N的显著性差异为P<0.05、0.01和0.0001。###表示相比于CH的显著性差异为P<0.05。

和

分别表示相比于N+AOL的显著性差异为P<0.05和0.01。

表示相比于MCT的显著性差异为P<0.05。

图14是显示AOL对肺动脉(PA)重塑的影响的一组图。在常氧大鼠(N，白色柱)、慢性低氧大鼠(CH，浅灰色柱)和经野百合碱处理的大鼠(MCT，深灰色柱)中，通过测量PA内测厚度的百分比来评估AOL(阴影柱)对PA重塑的影响。为评估PA重塑而观察的腺泡泡内动脉被分成具有不同的横截面直径的三组(图A：低于50μm；图B：50μm-100μm；图C：100μm-150μm)。n是脉管的数量。*、**和***分别表示相比于N的显著性差异为P<0.05、0.01和0.0001。##和###表示相比于CH的显著性差异为P<0.01和0.0001。相比于N+AOL的显著性差异分别为P<0.05和0.01。

表示相比于MCT的显著性差异为P<0.05。

图15是显示在进行性光诱导的视网膜变性中，AOL对视网膜外核层(ONL)厚度的影响的一组图。图A：溶媒和AOL对“未转移”动物的影响。在低强度循环照明下饲养动物，并接受溶媒或AOL注射，每天三次，持续7天。治疗结束后15天，对视网膜进行组织学分析。数据表示为未经治疗的动物(浅灰色，方形点)，经溶媒处理的动物(深灰色，三角形点)和经AOL治疗的动物(黑色，圆形点)的来自视神经和视神经盘的上极和下极中的每0.39毫米的ONL厚度的平均值±SEM，单位为μm。图B：溶媒和AOL对“转移”动物的影响。在低强度循环照明下饲养动物，并将其转移至高强度循环照明中持续7天，在此期间，动物每天接受3次溶媒或AOL注射。治疗结束时，将动物转移回低强度循环照明条件下，并在十五天后对视网膜进行组织学分析。数据表示为未经治疗的动物(浅灰色，方形点)、经溶媒治疗的动物(深灰色，三角形点)和经AOL治疗的动物(黑色，圆形点)的来自视神经和视神经盘的上极和下极中的每0.39毫米的ONL厚度的平均值±SEM，单位为μm。

图16是显示四组小鼠(WT-KOL：用溶媒治疗的野生型小鼠；WT-AOL：用AOL治疗的野生型小鼠；KO-KOL：用溶媒治疗的SOD2-KO小鼠；KO-AOL：用AOL治疗的SOD2-KO小鼠)的寿命SOD2-KO实验的一组图。数据表示为平均值。图A：小鼠体重(以克计)随时间(以天计)的变化。图B：小鼠体重的基线校正为体重随时间(以天计)增加的百分比。图C：KO-KOL和KO-AOL组随时间(以天计)的存活率(以百分比计)。

图17是显示五组小鼠(WT-KOL：用溶媒治疗的野生型小鼠；WT-AOL：用AOL治疗的野生型小鼠；KO-KOL：用溶媒治疗的SOD2-KO小鼠；KO-AOL：用AOL治疗的SOD2-KO小鼠；WT：野生型未治疗小鼠)的心脏中的琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的图。用图像处理软件Image AnalystMKII(Akos)测量从心脏部分取样的SDH反应的光密度。该密度以平均灰度水平的形式表示，其中平均灰度水平＝灰度之和/测量的像素数。数据表示为测得的光密度的平均值。

图18是显示了用AOL治疗或不用AOL治疗的WT和SOD2-KO小鼠的肝脏切片的油红O(Oil Red O)染色的一组图。直方图代表脂质液滴的平均大小(图A)，液滴密度(液滴数/肝脏面积)(图B)和总脂质面积(平均大小×液滴数)(图C)。

图19显示了AOX对线粒体氧化的影响。图19A显示了一个典型的实验，该实验显示了在AOX存在下各种氧化性磷酸化条件下的线粒体呼吸作用。在氧化性磷酸化试验之前，将AOX加入到线粒体中孵育5分钟。耗氧量(深灰色痕迹)在添加底物(GM：谷氨酸盐-苹果酸盐)后开始，并被ADP激活(磷酸化状态)。磷酸化被ATR(苍术苷)终止，并且低残留呼吸反映了线粒体内膜的完整性。图19B显示了在DMSO中，AOX浓度增加的情况下，在上述不同呼吸状态(Succ/ROT：GM底物、琥珀酸盐和鱼藤酮)期间，线粒体氧化率的变化。

图20显示了AOX对线粒体ATP磷酸化的影响。如先前Gouspillou等人(2014.AgingCell.13(1)：39-48)中所述，已经同时测定了磷酸化率和氧化率，并且已经报道了AOX浓度增加的影响。结果表示为相对于pH单位/秒(unit/sec)的对照变化的相对百分比。

图21显示了在复合物I和III两者的底物(谷氨酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐)存在下，在ATR存在下，因此在主要由复合物I产生的条件下，增加AOX浓度对分离的线粒体的氧自由基产生的影响。通过使用经典的过氧化物酶-Amplex Red系统进行线粒体产生的ROS的测量，该系统通过氧化Amplex Red产生荧光试卤灵来测量H₂O₂的出现(参见图22B)。

图22显示在体外试验中与AOL和Oltipraz相比，AOX对非线粒体ROS没有作用。在还原的NAD(P)H存在下，使用市售NAD(P)H氧化酶获得非线粒体ROS/H₂O₂，然后再次使用经典的过氧化物酶-Amplex Red系统进行测量(图22B)。图22A中显示了不同的测试分子的增加浓度的作用。水平直线表示在所有测试浓度下，ROS产生的平均百分比为AOL(99.2％)和AOX(109.9％)。

图23显示了AOX对癌细胞系A549和H460的活力的影响，以相对于对照(0μM AOX)的％表示。以0至500μM AOX的增加剂量孵育细胞，并通过磺酰罗丹明B(SRB)试验评估细胞毒性(图23A)。结果也表示为AOX浓度的对数(图23B)。

图24显示通过氧描记法证实，AOX和AOL对H460细胞的呼吸没有作用。

图25显示了使用Transwell测试的AOX对癌细胞转移活性的影响。简而言之，将H460癌细胞置于细胞可渗透膜的上层，并在孵育一段时间后，对已经通过该膜迁移的细胞进行染色并计数。图25A显示了在不同条件下(对照、5μM AOX、10μM AOX和10μM NAC[N-乙酰基半胱氨酸])在下方隔室中染色的细胞的照片。图25B是示出图25A的结果的直方图。

图26显示了在不同浓度的AOL(图26A)或AOX(图26B)存在下，由5-羟色胺(5HT)或内皮素(ET-1)诱导的肺内动脉的收缩。双因素ANOVA：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。

图27显示了在有或没有AOL的情况下，在10％胎牛血清(FCS)、0.2％FCS和0.2％FCS+100μM 5-羟色胺(5HT)中孵育后，肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的增殖。

图28显示了当使用琥珀酸盐(呼吸系统复合物2的能量底物)和呼吸链的已知抑制剂的组合(即对于位点I_Q，单独使用10mM琥珀酸盐，对于位点III_Q外，使用10mM琥珀酸盐、4μM鱼藤酮和2.5μM抗霉素A)分别靶向时，AOL、AOX和Oltipraz(0至80μM)对分离的线粒***点I_Q和III_QO处的ROS/H₂O₂产生的影响。图28A显示了这三种分子对位点I_Q的影响，以及图28B显示了对位点III_QO的影响。

图29显示了当使用琥珀酸盐(呼吸系统复合物2的能量底物)和呼吸链的已知抑制剂的组合(即对于位点I_Q，单独使用10mM琥珀酸盐，以及对于位点III_QO，使用10mM琥珀酸盐、4μM鱼藤酮和2.5μM抗霉素A)分别靶向时，AOX类似物(Cp1；Cp2；Cp3；Cp4；Cp5；Cp6a；Cp8；Cp9a)(0至25μM)对分离的线粒体的位点I_Q和III_QO处的ROS/H₂O₂产生的影响。图29A显示了(上图)Cp1、Cp2、Cp3、Cp4、(下图)Cp5、Cp6a、Cp8和Cp9a对位点I_Q的影响，图29B显示了Cp5、Cp6a和Cp9a对位点III_QO的影响。

实施例

本发明通过以下实施例进一步进行说明。

化学实例

一般实验程序

试剂和溶剂

所有合成级试剂和溶剂均按所提供的使用。反应中使用的溶剂可以根据现有技术进行干燥、蒸馏。一些溶剂可以干燥形式商购获得，并且可以原样使用。

反应条件

当需要干燥条件时，将玻璃器皿用烘箱干燥，并在氮气氛下进行反应。室温(r.t.)表示20℃-25℃。使用固体CO₂和丙酮获得-78℃的反应温度。对于0℃的那些，使用冰浴，并且在需要加热的地方，使用带有接触温度计的油浴。

通过TLC监测反应。使用具有硅胶和荧光指示剂的Merck DC Kieselgel 60 F254板UV254预涂铝板进行TLC。所使用的指示剂包括乙醇磷钼酸溶液。

快速色谱

来自Macherey-Nagel的硅胶，MN Kieselgel 60，15–40微米级，用于通过快速柱层析法纯化粗产物。将样品直接施加到硅胶/溶剂柱的顶部，或作为干燥硅胶浆液施加。

自动化的快速色谱

Teledyne Isco Combiflash Companion^TM的纯化系统。将粗样品溶解在少量合适的溶剂中，并施加到预装柱上。将该柱放置在Teledyne Isco Combiflash

的纯化系统中，并使用溶剂梯度程序进行自动纯化。该系统与自动馏分收集设备(在该设备中通过UV来检测化合物)一起使用，或通过收集所有馏分使用该系统。

核磁共振波谱(NMR)

在以400MHz(¹H)和100MHz(¹³C)运行的Bruker UltraShield仪器上记录NMR。使用氘化溶剂的残留溶剂移位进行校准。当使用CDCl₃作为溶剂时，在7.26(¹H)和77.16(¹³C)下对该溶剂信号进行校准。当要分析的样品中存在芳族化合物时，将Me₄Si添加到CDCl₃中，并在0.0(1H)处校准光谱。当使用D₂O时，水信号被指定为4.79ppm(1H)的内参。对于CD₃OD，内参指定为3.31ppm(¹H)和49.0ppm(¹³C NMR)。对于(CD₃)₂SO，内参指定为2.50ppm(¹H)和39.5ppm(¹³C)。对于¹⁹F，使用CFCl₃作为外参。化学位移以百万分比(ppm)表示，耦合常数以赫兹(Hz)表示。质子和碳的信号多重性的缩写如下：s单峰、d双重峰、dd双二重峰、dt双三重峰、ddt双双三重峰、t三重峰、tt三三重峰、q四重峰、m多重峰。

质谱(MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)联用分析

在Waters Alliance 2695，Waters 3100质量检测器上进行质量分析。灵敏度为1pg，使用ESI或APCI。10,000Da/秒的扫描速度最高达2,000Da，与数秒宽(seconds wide)的快速LC峰完全兼容。使用ZSpray^TM源进行双正交采样电离。受支持的可调谐UV(TUV)，光电二极管阵列(PDA)和蒸发光散射(ELS)光学探测器可以提供多种检测策略。或在UPLC/MS：XevoG2 Qtof(Xevo G2 QTof质谱仪)上进行质量分析，采用

/MSE和QuanT技术。

熔点分析

熔点在STUART SMP3仪器上测量。

高效液相色谱(HPLC)

HPLC-DAD分析是在配备有合适的分析柱、Empower软件、Waters Delta 600多溶剂输送系统和光电二极管阵列检测器(Waters 2996)和/或折光仪、系统控制器(Waters 600)的Waters分析HPLC系统上进行的，使用带有20μL样品环的Rheodyne进样器7725i。

中间体化合物(C)的合成

通用步骤A。在装有磁力搅拌器的100mL圆底烧瓶中装入适当的市售芳基乙酮和碳酸二甲酯。在搅拌下缓慢加入氢化钠(在矿物油中60％)，并将整个回流过夜。将混合物倒入水中，用HCl(2M)酸化，并用乙酸乙酯萃取。用水(50mL)和饱和盐水溶液(50mL)洗涤有机层。有机层经无水Na₂SO₄干燥，并在减压下除去溶剂。通过硅胶层析柱使用合适的溶剂纯化粗物质，得到相应的3-氧代-3-芳基丙酸甲酯。

使用常规的烷基化步骤A合成中间体7、11和13。

中间体7：5-(3-甲氧基-3-氧代丙酰基)-1H-吲哚-1-羧酸甲酯

根据常规的烷基化步骤A，使用6作为芳基酮(1.03g，6.47mmol)，碳酸二甲酯(12mL)和氢化钠(2.5g，64.7mmol)进行反应。经处理和纯化后，获得化合物7(m＝1.4g，78％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)8.30(d,J＝1.4Hz,1H),7.78(dd,J＝8.7,1.7Hz,1H),7.55(d,J＝8.7Hz,1H),7.48(d,J＝3.1Hz,1H),6.64(dd,J＝3.1,0.7Hz,1H),4.23(s,2H),3.84(s,3H),3.66(s,3H)。

中间体11：3-(2-羟基苯并[d] 唑-5-基)-3-氧代丙酸甲酯

根据常规的烷基化步骤A，使用10作为芳基酮(1.9g，10.7mmol)，碳酸二甲酯(24mL)和氢化钠(4.75g，118mmol)进行反应。经处理和纯化后，获得化合物11(m＝580mg,23％).¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)11.94(s,2H),7.77(dd,J＝8.4,1.8Hz,2H),7.58(d,J＝1.7Hz,2H),7.44(d,J＝8.4Hz,2H),4.23(s,3H),3.64(s,6H)。

中间体13：3-(苯并呋喃-5-基)-3-氧代丙酸甲酯

根据常规的烷基化步骤A，使用12作为芳基酮(1.45g，9.06mmol)、碳酸二甲酯(25mL)和氢化钠(2.17g，90.6mmol)进行反应。经处理和纯化后，获得化合物13(m＝1.58g,80％)。¹H-NMR(300MHz,CD₃OD):δ(ppm)8.35(d,J＝1.8Hz,1H),7.98-8.01(m,1H),7.89(d,J＝2.1Hz,1H),7.61(d,J＝8.7Hz,1H),7.00-7.01(m,1H),4.17(s,2H),3.65(s,3H)。

中间体9：3-(2-羟基苯并[d]噻唑-6-基)-3-氧代丙酸甲酯

在装有磁力搅拌器的100mL圆底烧瓶中装入氢化钠(于矿物油中60％)(1g，48mmol)，碳酸二甲酯(4.2mL)和四氢呋喃(30mL)。在搅拌下在四氢呋喃(30mL)中缓慢加入市售的芳基酮8(1.94g，10mmol)，并将全部回流72小时。将混合物缓慢倒入水中，用饱和氯化铵(50mL)酸化，并用乙酸乙酯萃取。有机层用水(50mL)洗涤，并用无水Na₂SO₄干燥。减压蒸发后，通过在乙酸乙酯中结晶来纯化粗物质，得到相应的3-氧代-3-芳基丙酸甲酯9(m＝1.89g，75％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)12.33(s,1H),8.24(d,J＝1.7Hz,1H),7.89(dd,J＝8.4,1.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H),4.17(s,2H),3.65(s,3H)。

化合物Cp1的合成

步骤1：Cp1-甲氧基：5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮。将乙酸汞(II)(4g，12.5mmol)添加到商业二硫醇1的溶液(1g，4.16mmol)中，该溶液为乙酸(v＝25mL)和氯仿(v＝80mL)的混合液。将反应混合物在室温搅拌过夜。将整体过滤并蒸发。将获得的固体在硅胶(石油醚：丙酮＝90：10)上进行色谱分离，得到黄色固体Cp1-甲氧基(800mg，85％产率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)7.59(d,J＝8.9Hz,2H),6.98(d,J＝8.9Hz,2H),6.77(s,1H),3.88(s,3H)。¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ(ppm)194.29,170.13,162.52,128.08,125.08,116.30,114.75,55.60。

步骤2：Cp1：5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮。将甲基芳基醚Cp1-甲氧基(410mg，1.83mmol)和吡啶盐酸盐(630mg，5.5mmol)的混合物置于圆底烧瓶中，并在250W下进行微波照射5分钟。完全转化后，使反应混合物通过层析柱(二氯甲烷：甲醇＝97∶3)，得到二硫醇Cp1(m＝70mg，10％产率)。¹H NMR(400MHz,丙酮-D₆)δ(ppm)9.31(s,1H),7.80–7.66(m,2H),7.05–7.00(m,2H),6.98(s,1H).¹³C NMR(101MHz,丙酮-D₆)δ(ppm)192.95,170.48,161.08,160.96,128.34,123.94,116.25,116.16,115.17。

化合物Cp2的合成

Cp2:5-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-酮肟。将盐酸羟胺(140mg，2mmol)添加至市售二硫醇2(224mg，1mmol)和乙酸钠(165mg，2mmol)的乙醇(v＝5mL)溶液中。将反应混合物在室温搅拌过夜，然后在减压下浓缩。所获得的固体在硅胶(二氯甲烷)上进行层析，得到呈红色固体的二硫醇Cp2(m＝51mg，32％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)11.55(s,1H),10.08(s,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.07(s,1H),6.84(d,J＝8.7Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)161.99,159.83,153.46,128.36,123.71,116.30,112.77。

化合物Cp3的合成

参考文献:MacDonald&McKinnon,1967.Can.J.Chem.45(11):1225-1229

步骤1.Cp3-甲氧基：5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮。将二硫化碳(18mL)中市售的异硫氰酸酯3(3g，15.5mmol)和五硫化二磷(6g，13.5mmol)置于圆底烧瓶中，并在65W下进行微波照射15分钟。完全转化后，将溶液过滤并减压蒸发。用乙醇(约30mL)处理油状残余物，并冷却至0℃。滤出粗二硫醇，并从(二氯甲烷：乙醇＝1∶1)中重结晶，得到黄色固体Cp3-甲氧基(m＝220mg，7％产率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)8.12(d,J＝8.9Hz,2H),7.26(s,1H),7.00(d,J＝9.0Hz,3H),3.92(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)185.35,160.71,126.65,119.04,110.23,51.10。

步骤2.Cp3：5-(4-羟基苯基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮。将甲基芳基醚Cp3-甲氧基(300mg，1.25mmol)和二氯甲烷(v＝6mL)的混合物置于圆底烧瓶中，并冷却至0℃。缓慢加入在二氯甲烷(v＝6mL，6mmol)中的1M三溴化硼，并将整体搅拌过夜。完全转化后，将反应混合物倒入水中以得到悬浮液。滤出固体，并用水洗涤。在二氯甲烷中沉淀，得到所需的苯酚Cp3(m＝270mg，95％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)11.09(s,1H),8.07(d,J＝8.8Hz,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)214.93,191.66,165.12,132.15,122.22,117.20。

化合物Cp4的合成

参考文献：Brown et al.,2014.Bioorg Med Chem Lett.24(24):5829-5831

步骤1.Cp4-甲氧基：4-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。加热250mL甲苯中的2-(4-甲氧基苯基)-3-氧代丙酸甲酯4(3.79g，19.52mmol)、Lawesson试剂(7.89g，19.52mmol)和硫(313mg，9.59mmol)的混合物，回流270分钟。当反应完成时，将混合物过滤并将滤液浓缩。通过柱层析法(石油醚：丙酮＝10∶1)纯化，得到红色固体。将获得的固体用醚洗涤，并在丙酮中结晶，得到Cp4-甲氧基(1.56g，33％产率)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm)8.37(s,1H),7.50(d,J＝8.8Hz,2H),6.97(d,J＝8.8Hz,2H),3.84(s,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ(ppm)214.12,160.10,153.04,149.08,130.28,125.43,113.88,55.35。

步骤2.Cp4：4-(4-羟基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。将甲基芳基醚Cp4-甲氧基(171mg，0.71mmol)和吡啶盐酸盐(264mg，0.86mmol)的混合物置于圆底烧瓶中，并在250W下进行微波照射5分钟。完全转化后，使反应混合物通过层析柱(二氯甲烷：甲醇＝97∶3)，得到二硫醇Cp4(m＝51mg，32％)。¹H NMR(400MHz,Acetone-D₆)δ(ppm)8.94(s,1H),8.67(s,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,1H),6.91(d,J＝8.6Hz,1H)。

化合物Cp5的合成

常规步骤B。将五硫化二磷(0.7mmol)、硫(1mmol)，六甲基二硅氧烷HMDO(3mmol)在二甲苯(2.5mL)中于145℃加热5分钟。分批加入适当的3-氧代-3-芳基丙酸甲酯，并将反应混合物回流1小时，完成反应。随后，滤出粗硫醇并将滤液浓缩。通过柱层析法和结晶纯化，得到相应的芳基二硫醇。

Cp5：5-(2-羟基苯并[d]

唑-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。化合物Cp5的合成按照常规的硫化步骤B进行，使用中间体11(580mg，2.47mmol)，P₄S₁₀(658mg，1.53mmol)，硫(79mg，2.55mmol)，HMDO(0.76mL，7.65mmol)和二甲苯(5mL)。处理后，在硅胶(THF)上快速纯化，并在乙醇和丙酮中结晶，得到Cp5(m＝70mg)，为红黑色固体。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)12.07(s,1H),7.84(s,1H),7.66(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),7.59(d,J＝1.8Hz,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)215.73,173.92,154.61,146.65,136.06,132.07,127.48,122.31,110.94,108.69。

化合物Cp6a的合成

Cp6a：5-(2-羟基苯并[d]噻唑-6-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。按照常规的硫化步骤B，使用中间体9(700mg，2.55mmol)，P₄S₁₀(680mg，1.53mmol)，硫(81.5mg，2.55mmol)，HMDO(1.63mL，7.65mmol)和二甲苯(6mL)进行反应。处理后，在硅胶(THF)上快速纯化，并在C18上进行反相纯化(乙腈：水梯度)，得到红色固体Cp6a(m＝6.7mg)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)8.26(d,J＝1.9Hz,1H),7.84(dd,J＝8.4,1.9Hz,1H),7.77(s,1H),7.22(d,J＝8.4Hz,1H).³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)173.85,170.59,144.13,140.39,135.24,126.37,125.48,122.20,112.62。

化合物Cp8的合成

Cp8：5-(苯并呋喃-5-基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮。按照常规的硫化步骤B，使用中间体12(1.58g，7.25mmol)，P₄S₁₀(1.93g，4.35mmol)，硫(232mg，7.25mmol)，HMDO(0.76mL，21.7mmol)和二甲苯(15mL)进行反应。处理后，在硅胶(二氯甲烷)上快速纯化，并在乙醇和丙酮中结晶，得到黄色固体的Cp8(m＝890mg)。H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)8.26(d,J＝1.7Hz,1H),8.14(d,J＝2.2Hz,1H),7.86–7.81(m,3H),7.75(d,J＝8.7Hz,1H),7.06(dd,J＝2.2,0.9Hz,1H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D6)δ(ppm)215.64,174.84,156.73,148.51,135.82,128.82,126.87,124.25,121.26,113.04,107.68。

化合物Cp9a的合成

Cp9a：5-(3-硫代-3H-1,2-二硫杂环戊烯-5-基)-1H-吲哚-1-羧酸甲酯。按照常规的硫化步骤B，使用中间体7(700mg，2.55mmol)，P₄S₁₀(680mg，1.53mmol)，硫(81.5mg，2.55mmol)，HMDO(1.63mL，7.65mmol)和二甲苯(6mL)进行反应。处理后，在硅胶(THF)上快速纯化，并在乙醇和丙酮中结晶，获得了红黑色固体Cp9a(m＝55mg)。¹H NMR(400MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)8.20(d,J＝1.6Hz,1H),7.81(s,1H),7.69(dd,J＝8.7,1.8Hz,1H),7.59(d,J＝8.7Hz,1H),7.49(d,J＝3.1Hz,1H),6.59(d,J＝3.1Hz,1H),3.84(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO-D₆)δ(ppm)176.78,138.90,134.27,132.59,128.85,122.84,120.72,111.52,102.57,34.12,33.24,31.09。

生物学实施例

实施例1：AOL不影响线粒体的氧化性磷酸化

材料和方法

动物程序和伦理学声明

所描述的所有实验均按照国家和欧洲研究委员会关于实验动物的护理和使用指南进行。P.Diolez拥有法国Ministère de l’agriculture et de la Forêt的Service Vétérinaire de la Santéet de la Protection Animale的进行动物试验的有效许可证(1999年3月17日，许可证号3308010)。

材料

除蔗糖和NADH氧化酶(购自Merck公司(Darmstadt，Germany))外，所有化学品均为试剂级，购自西格玛化学公司(St.Louis,MO)。三硫-茴香脑化合物(AOL，对应于5-(4-甲氧基苯基)-3H-1,2-二硫杂环戊烯-3-硫酮)是来自私人公司GMPO(法国巴黎)的赠送。在DMSO中制备15mM储备溶液，并在0℃的黑暗中保持仅几天。

线粒体的分离

雄性Wistar大鼠(250-325g；获自Janvier Lab，Le Genest-Saint-Isle，法国)，通过打昏和颈脱位法杀死，并迅速取出心脏并在含有100mM蔗糖、180mM KCl、50mM Tris、5mMMgCl₂、10mM EDTA和0.1％(w/v)脱脂BSA(pH 7.2)的冷分离培养基中洗涤。

心脏线粒体的分离是在冷室中进行的。在均质化之前，用剪刀切碎心脏(约1.5g)，并在5mL补充有蛋白酶(2mg XXIV型细菌蛋白酶/mL分离缓冲液)的相同培养基中搅拌处理5分钟。将组织悬浮液倒入50mL玻璃Potter均质器中，用20mL分离缓冲液稀释，然后使用机动的聚四氟乙烯(Teflon)研杵均质化3分钟。通过滤布(Sefar Nitex)过滤匀浆以除去碎屑，并以8,000g离心10分钟。将所得沉淀物用5mL分离缓冲液冲洗，重悬于25mL相同缓冲液中，然后进行低速离心(400g)8分钟。将得到的上清液以7,000g离心两次，持续15分钟，以产生洗涤后的线粒体沉淀物，将其轻轻重悬于150μL分离缓冲液中。以BSA为标准，通过Bradford方法(Sigma，试剂盒#B6916)测定蛋白质浓度。线粒体以终浓度为40-50mg/mL在冰上保持小于5小时。

线粒体呼吸

使用高分辨率血氧仪(Oxygraph-2K，Oroboros仪器，奥地利)在25℃在恒定搅拌下通过极谱法记录在不存在AOL或存在AOL的情况下以递增剂量(从0至终浓度80μM)孵育的心脏线粒体(0.1mg/mL)的耗氧率。呼吸培养基包含140mM蔗糖、100mM KCl、1mM EGTA、20mMMgCl₂、10mM KH₂PO₄和1g/L(w/v)基本不含脂肪酸的BSA(pH 7.2)。

线粒体ROS/H₂O₂的产生

在外源性辣根过氧化物酶(HRP，EC 1.11.1.7，Sigma)的存在下，通过氧化无色非荧光指示剂Amplex Red来评估心脏线粒体的ROS/H₂O₂产生的速率。H₂O₂以1：1的化学计量比与Amplex Red反应，生成荧光化合物试卤灵(激发：560nm；发射：585nm)，其一旦形成就很稳定。用配备有温度控制和搅拌的分光荧光计(SAFAS Xenius，摩纳哥)连续测量荧光。将分离的线粒体(0.1mg/mL)在补充15μM Amplex Red和10μg/mL HRP的与之前相同的实验缓冲液中孵育。谷氨酸盐(5mM)/苹果酸盐(2.5mM)与琥珀酸盐(5mM)分别用作复合物I和复合物II的底物。实验是在非磷酸化条件下，在15μM白术苷的存在下进行的，即在线粒体膜为最大的IV态下进行。然后，依次加入鱼藤酮(1.5μM)、抗霉素A(2μM)和粘噻唑(0.2μM)以抑制电子传递链中的氧化还原中心(图2)，即位点I_Q、I_F(用鱼藤酮)，III_Qi(用抗霉素A)和III_QO(用粘噻唑)。最后，在所有相关化合物(包括AOL)存在下，用已知量的H₂O₂(每步300nM)校准测定。在心脏线粒体不存在和NAD(P)H氧化酶(EC 1.6.3.3,5mU/mL,Sigma)和NADH(100μM)溶液的存在下，进行了AOL对Amplex Red测定本身和NAD(P)H氧化酶ROS/H₂O₂产生没有影响的对照实验。

结果

我们首先证实(图1)，AOL化合物并不会直接影响从大鼠心脏分离的线粒体的氧化性磷酸化作用。这是通过使用目前经典的测氧描记法进行的。首先用各种AOL浓度(5至80μM)孵育线粒体，然后添加呼吸底物(底物状态，黑色曲线)，然后加入饱和ADP浓度以获得最大的氧化磷酸化率(灰色曲线)，最后添加苍术苷(ATR)，其抑制ADP/ATP转运蛋白并在非磷酸化条件下产生线粒体泄漏速率(图1A)。图1B-D的其他图显示了使用不同呼吸底物组合获得的结果：向复合物I供给电子的谷氨酸盐+苹果酸盐，用于复合物II的琥珀酸盐(+鱼藤酮)，以及向两种复合物供给电子的谷氨酸盐+苹果酸盐+琥珀酸盐。选择了最后一种底物组合，因为它最类似于体内条件，其中克雷布斯(Krebs)循环功能且琥珀酸盐和NADH均被呼吸链氧化。结果表明，在AOL存在下，对所测试的不同浓度未观察统计学上的差异(图1)，这表明在这些条件下，AOL对线粒体的氧化性磷酸化(即，对呼吸链活性和ATP合成两者)以及线粒体内膜的完整性(添加ATR后的泄漏率)没有影响。最后的结果表明AOL不会影响氧化性磷酸化产量。总之，所有这些结果证实了AOL没有任何有害作用，这是该药物长期用于人类健康所证实的。

实施例2：AOL抑制线粒体的超氧化物/H₂O₂产生

如前所述，线粒体ROS产生高度依赖于线粒体的活性和条件。尽管我们在许多条件下测试了AOL对线粒体产生ROS的影响，但为清楚起见，我们选择在此仅介绍AOL的非常特定的作用中最具代表性的结果。如上所述，使电子传递到整个呼吸链的底物组合(即谷氨酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐)(图2A)的存在是最能代表代谢活跃的细胞中的原位条件。此外，在高线粒体磷酸化的条件下，但在电子转运体的高度还原(即低或没有磷酸化)的条件下，不会发生最大的线粒体ROS/H₂O₂产生。这些条件在ATR存在(ATR抑制ATP/ADP转运蛋白)下得到满足(图1)，并且我们可以有效地验证在饱和ADP的条件下添加ATR会触发ROS的产生，其在最大磷酸化条件下处于检测限(结果未显示)。在这些条件下，ROS在呼吸链的不同位点产生(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059；Quinlan et al.,2013.RedoxBiol.1:304-312)(图2)。生产的主要位点位于复合物I和III，其中，电子的势能发生较大变化(Balaban et al.,2005.Cell.120(4):483-495；Goncalves et al.,2015.J.Biol.Chem.290(1):209-27)，这也使得能够在这些位点泵送质子。

我们设计了一系列抑制剂滴定法，以解释在最大ROS产生的条件下AOL对整个呼吸链的ROS产生的影响(图2E)。在不存在特定的复合物抑制剂的情况下，ROS的产生最多，并且主要来自于位点I_Q处的反向电子传递(图2A)。值得注意的是，由复合物I产生的ROS，无论是通过位点I_Q(醌位点)还是位点I_f(黄素位点)，都被递送到线粒体内膜的内基质侧。添加鱼藤酮(一种与IQ特异性结合的复合物I的经典抑制剂)后，ROS产生急剧下降，几乎全部发生在位点III_QO，并且由于存在复合物I底物和没有被鱼藤酮抑制的NADH产生，剩余的产生在位点I_f处(图2B)。随后添加抗霉素A(一种电子转移至细胞色素c的抑制剂)会导致还原相对于氧化醌的比例增加，但复合物II活性仍会降低该比例，因此在位点III_QO处的ROS产生随之增加(图1C)。最后，添加粘噻唑(一种复合物III位点III_QO的抑制剂)消除了复合物III位点ROS产生，而剩余的极低产量可以归因于复合物I的黄素位点，对于该位点，我们没有已知的抑制剂(Goncalves et al.,2015.J.Biol.Chem.290(1):209-27)。

图3示出了在图2所限定的不同条件下测得的AOL浓度升高(5μM至80μM)对ROS/H₂O₂产生的影响。从该图显示的结果可以清楚地看出，AOL仅对在没有抑制剂的情况下测量的ROS产生的影响约为80％，而未观察到这一范围的AOL浓度对在其他条件下测量的ROS/H₂O₂有统计学上的差异。如图2所示，这种特定条件(仅存在ATR)是由复合物I(位点I_Q)产生ROS的测定中的唯一条件。当将鱼藤酮添加到测定中时，无论涉及什么位点，ROS/H₂O₂产生对即使在高浓度下的AOL也不敏感。对线粒体ROS产生的几个位点明显没有作用，这不仅令人惊讶，而且还提出了有关AOL对线粒体的作用机理的有趣问题。实际上，这些结果排除了先前论文中描述的AOL的作用模式并以此为治疗用途的专利基础的基本假设。这些结果有效地证明了AOL并不是自由基清除剂。否则，其作用将与ROS的来源无关。但是，由于AOL明显会大大降低复合物I在位点I_Q处的ROS产生，并且仅在该位点，因此我们有证据表明AOL会特异性抑制该位点上ROS的形成。

尽管其机理尚待研究，但此处提供的证据表明，AOL化合物特异性地干扰线粒体复合物I，并选择性抑制复合物I的泛醌结合位点(位点I_Q)处的超氧化物生成，而对来自其他位点的超氧化物产生或氧化磷酸化没有影响。据我们所知，最近仅描述了一种具有相当性质的化合物，即N-环己基-4-(4-硝基苯氧基)苯磺酰胺(Orr et al.,2013.FreeRadic.Biol.Med.65:1047-1059)。类似于AOL，该化合物不会改变作为呼吸链和氧化性磷酸化的组分的复合物I的活性。

使用用于测量线粒体的ROS/H₂O₂的过氧化物酶-Amplex Red系统在体外进一步测试AOL的特异性，该系统实际上是通过将Amplex Red氧化为荧光试卤灵来测量H₂O₂的出现(见图4)。在没有线粒体的情况下，通过向测量系统中添加H₂O₂生成系统，可以测试AOL对该系统的影响。这已通过使用商业NAD(P)H氧化酶(该酶在添加的NAD(P)H存在下产生H₂O₂)，并测量Amplex Red至试卤灵的还原来进行(图4)。在这些条件下，我们没有观察到荧光的任何抑制作用，这排除了AOL对NAD(P)H氧化酶或对过氧化物酶活性的任何影响(结果未显示)。这些结果证实，AOL不会干扰测量系统，也不会直接与H₂O₂相互作用。有趣的是，这些结果还表明，AOL不会抑制NADP(H)氧化酶的ROS/H₂O₂产生，NADP(H)氧化酶是细胞中一种(如果不止一种)主要的非线粒体ROS/H₂O₂产生者。图4的方案概括了AOL对线粒体和NAD(P)H氧化酶的ROS/H₂O₂产生的作用模式的不同信息，并强调了此处显示的很高的特异性。这些结果与先前关于AOL作为自由基清除剂的推定作用的断言截然不同。

在对从大鼠心脏中分离的线粒体进行测试时，AOL有效降低了线粒体ROS/H₂O₂产生(在分离的线粒体中，H₂O₂是由线粒体超氧化物歧化酶还原ROS产生的)。但是，此处给出的结果清楚地表明AOL不是作为简单的抗氧化剂或自由基清除剂。尽管抗氧化剂是一般的ROS/H₂O₂清除剂，但AOL表现出针对复合物I中位点I_Q形成的ROS的完全选择性，这表明AOL不是简单地与超氧自由基发生相互作用，而且还特异性地阻止了它们在复合物I中的形成。因此，在这方面，AOL似乎是一类全新的氧化应激保护剂的成员，其只有一个成员最近被描述(Orret al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)。而抗氧化剂通常不会直接干扰电子传递并清除下游处产生的ROS和/或H₂O₂，因此无法完全抑制ROS的作用(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)，AOL可以通过阻止ROS形成并且因此更加有效地保护线粒体免受其自身ROS的侵害而不同地起作用。

此处提供的数据进一步证明了AOL是线粒体呼吸链的复合物I的位点I_Q处的ROS形成的特异性抑制剂。但是，需要进一步的实验来确定AOL对其他线粒***点完全没有影响，但这并不排除上述结论。在这里还显示了一些证据，表明AOL只会与线粒体相互作用，而不会影响胞质溶胶中氧自由基的形成，因此不会影响细胞内信号传导。

鱼藤酮或神经毒素MPP+对复合物I活性的抑制作用与啮齿动物和人类两者的帕金森病有关，表明功能失调的复合物I、ROS产生与神经变性之间存在联系(Langston et al.,1983.Science.219(4587)：979-980；Betarbet et al.,2000.Nat.Neurosci.3(12):1301-1306)。相比之下，比较分析显示，来自位点I_Q而不是位点I_F的最大超氧化物/H₂O₂产生与不同脊椎动物的种的最大寿命之间存在反比关系(Lambert et al.,2007.Aging Cell.6(5)：607-618；Lambert et al.,2010.Aging Cell.9(1)：78-91)。因此，来自位点I_Q或位点I_F的超氧化物/H₂O₂产生的选择性调节剂将提供独特的机会来探究线粒体ROS产生在正常和病理过程中的推定作用(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)。还有一些推测，甚至是有争议的，位点III_Q(不受AOL影响)在缺氧期间在细胞信号传导中起重要作用。

总之，AOL性质似乎代表了在寻找细胞中ROS/H₂O₂产生的特异性调节剂方面的突破。这是当前研究中的重要问题，AOL对新发现的分子具有巨大的优势，因为它已被批准用于人类。

-AOL在ROS产生的上游起作用，因此确保了比经典抗氧化剂更高的保护作用；

-AOL特异性地作用于线粒体ROS产生；

-AOL确保线粒体保护，这对许多疾病(尤其是心脏疾病)至关重要；

-AOL不会干扰细胞信号传导；

-AOL特异性地作用于复合物I的位点I_Q，其是主要的线粒***点，可能与包括帕金森氏病和心脏纤维性颤动的重要疾病有关。

→AOL可能代表一类新的“保护剂”的第一个成员，其特异性地防止线粒体内的ROS产生，因此可以在各种氧化性应激期间用于线粒体保护，从而预防疾病，并且对关键的细胞ROS信号传导的副作用极小。

实施例3：AOL在心血管疾病：糖尿病中的作用

化合物AOL对小鼠胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)的影响

该研究的目的是研究化合物AOL在调节小鼠的分离的胰岛中葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)上的能力。

材料和方法

实验严格按照欧盟的建议(2010/63/EU)进行，并得到了法国农业和渔业部(许可证号3309004)和波尔多大学当地伦理委员会的批准。已尽最大的努力减少所用动物的痛苦和数量。

进行了三个独立的实验，并且对于每个实验，处死两只小鼠，并根据下文进一步描述的程序分离胰岛。

使用胶原酶消化方法分离胰岛。简而言之，用pH 7.35的含有0.33mg/mL胶原酶(Sigma-Aldrich)、5.6mM葡萄糖和1％牛血清白蛋白的汉克斯(Hanks)溶液使胰腺膨胀，取出并在37℃保持6-9分钟。在组织消化和通过三次连续的洗涤去除外分泌后，在双目放大镜下手动收集胰岛。通过在含有11mM葡萄糖(Invitrogen,CA，美国)并补充2mM谷氨酰胺、200IU/mL青霉素、200μg/mL链霉素和用木炭-葡聚糖(Invitrogen)剥离的8％胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养20-24小时，使胰岛从消化中恢复。

对于每个静态GSIS实验，首先将两只小鼠的胰岛在用95％O₂：5％CO₂的混合物平衡的pH 7.4的3mL Krebs-碳酸氢盐缓冲溶液(以mM为单位计，14NaCl、0.45KCl、0.25CaCl₂、0.1MgCl₂、2HEPES和3葡萄糖)中于37摄氏度孵育2小时。然后，将具有五个大小匹配的胰岛的组转移到装有0.5mL新鲜缓冲液的24孔板的孔中，再孵育1小时，该缓冲液包含以下刺激物之一：3mM葡萄糖(Glc)和11mM葡萄糖加溶媒(0.4％DMSO于Krebs碳酸氢盐缓冲溶液中)，或11mM葡萄糖加待测的稀释药物(10μM或20μM AOL于溶媒中)。每个实验条件使用六个不同的孔。孵育结束时，将牛白蛋白添加至每个孔中至终浓度为1％，并将板置于4℃15分钟以停止胰岛素分泌。接下来，收集培养基并将其保存在-20℃下，以便随后通过ELISA(试剂盒，来自Mercodia，Uppsala，瑞典)根据制造商的说明测量胰岛素含量。将每个孔中的胰岛素分泌量计算为每个胰岛和每小时孵育的胰岛素ng，然后表示为11mM葡萄糖溶媒组中胰岛素分泌(认为是100％)的百分比。

实验组的描述示于表1中。

表1

结果

将在三个实验的每个中获得的个体胰岛素分泌值组合并取平均值。这些表示为相对于11mM葡萄糖溶媒组标准化的胰岛素分泌的相对百分比(图5)。

数据的组合分析显示，AOL在10μM和20μM时均增强了GSIS，显示出相似的效力，与11mM葡萄糖溶媒组相比，GSIS增加了约65-75％(单因素分析；Bonferroni事后检验)。有关统计分析，请参见表2。

表2

结论

该研究表明，在测试的剂量(10μM和20μM)下，AOL增强GSIS并显著刺激来自小鼠的分离的胰岛体外胰岛素分泌。

因此，AOL会在胰岛素分泌不足的病理状况中特别有用，例如糖尿病，包括1型糖尿病、2型糖尿病和其他类型的糖尿病，例如MODY(青少年的成熟型糖尿病)。

用AOL长期治疗对饮食诱导的肥胖小鼠的食物摄入量、体重和葡萄糖代谢的影响

材料和方法

本研究的目的是确定在用高脂肪饮食(HFD)喂养的饮食诱导的肥胖(DIO)的小鼠中，化合物AOL以每天5mg/kg和10mg/kg的剂量通过腹膜内(i.p.)每日施用最长达五周是否改变食物摄入量、体重、肥胖和葡萄糖代谢。

在药理学研究开始之前，对小鼠随意喂食HFD(60％的卡路里来自脂肪，其中大部分为猪油)12周。动物通过腹膜内(i.p.)施用接受AOL或其溶媒，并在研究期间持续喂食HFD。每天测量食物摄入量和体重，并连续记录三周。

在药理学研究开始之前为了将小鼠适当地分配在不同的实验组中，我们使用EchoMRI 900(美国德克萨斯州休斯顿的EchoMedical系统)评估了他们内体的身体组成(另请参见Cardinal et al.,2014.Mol.Metab.3(7):705-16；Cardinal et al.,2015.Endocrinology.156(2):411-8)。使用天平(型号TP1502，Denver Instruments)获得每日食物摄入量和体重测量值。

30只7周大的雄性C57/Bl6J小鼠于2016年2月25日到达实验室，在适应实验饲养房屋1周后进行了首次体内身体组成分析(Echo MRI 900，EchoMRI System)。首次进行MRI分析后，对动物随意喂养高脂饮食(HFD)，持续12周。此后，他们进行了第二次MRI分析，并被分为体重和身体组成相等的3个实验组。

药理学治疗开始后(第1天)，每天在笼中饲养的动物进入黑暗阶段之前，测量其食物摄入量(FI)和体重(BW)。每天检查食物溢出量。通过从初始预称重量中减去喂料斗中剩余的食物来计算消耗的食物。连续三周测量FI和BW。之后，对动物进行第三次的MRI分析以观察治疗对身体组成(脂肪量和瘦体重的变化)的潜在影响，随后进行葡萄糖耐量测试(GTT)和胰岛素耐量测试(ITT)。小鼠每天腹腔内接受AOL或其溶媒的施用，总时长为5周，直到被处死。

使用核回波磁共振成像全身组成分析仪(Echo MRI 900；EchoMedical Systems)来重复评估清醒小鼠中的身体脂肪和瘦体重。

GTT和ITT通常分别用于评估葡萄糖负荷和胰岛素负荷期间葡萄糖代谢的动态调节。他们提供了有关葡萄糖不耐受的存在以及对激素胰岛素作用的可能抗性的信息。

对于GTT，动物经腹膜内注射1.5g/kg的D-葡萄糖(Sigma-Aldrich)；对于ITT，注射0.5U/kg的胰岛素(Humulin，Lilly，法国)。对于GTT和ITT，将动物禁食过夜。第二天早晨进行了测试。在不同时间点(经腹膜内施用葡萄糖或胰岛素后0、15、30、60、90和120分钟)从尾静脉采集血样，并且使用葡萄糖棒(OneTouch Vita，Lifescan France，Issy lesMoulineaux，法国)测量葡萄糖浓度。

处死时，收集血液样品，用葡萄糖棒快速评估血糖，然后将血液样品以3000rpm离心15分钟。将获得的血浆存储在-80℃以便随后进行胰岛素测量，胰岛素测量通过实施ELISA(试剂盒来自Mercodia，Uppsala，瑞典)根据制造商的说明进行。

HOMA-IR指数是使用公式(葡萄糖mmol/L×胰岛素mU/L)/22.5计算得出的，它提供有关胰岛素抗性的存在信息。

使用GraphPad Prism软件(SanDiego，CA，USA)进行统计分析。进行了双因素分析(ANOVA)的重复测量，以分析治疗因素、时间因素及其相互作用对食物摄入量、体重、GTT和ITT的影响。进行单因素ANOVA以比较治疗因素对处死时累积食物摄入量、身体组成、GTT和ITT的AUC、以及循环葡萄糖、胰岛素和HOMA-IR的影响。当ANOVA结果显著(p<0.05)时，进行Tukey事后检验，以在各组之间进行足够的多重比较。数据表示为平均值±SEM。使用GraphPad Prism软件生成图。

结果

该处理对体重或从第一次施用AOL之前测量的体重的第1天计算的体重变化的百分比(％)均无显著影响。

长期服用AOL三周后趋向于减少脂肪量(p＝0.13，图6)，而对瘦体重没有任何影响(图7)。在表6和图7中表示平均值±SEM值，在表3和表4中分别表示统计分析。

单因素ANOVA	平方和	自由度	均方	F	p
						治疗	18.50	2	9.248	2.151	0.1366
剩余	111.8	26	4.299

表3：图6所示数据的统计分析。

单因素ANOVA	平方和	自由度	均方	F	p
						治疗	2.773	2	1.387	1.256	0.3014
剩余	28.70	26	1.104

表4：图7所示数据的统计分析。

在ITT期间，剂量为10mg/kg的AOL显著减弱了胰岛素对循环葡萄糖水平的作用(图8)，表明存在胰岛素抵抗。因此，在分析AUC(AUC溶媒：12812.50±750.35,AUC AOL 5mg/kg：15006.56±1139.69,AUC AOL10mg/kg:18168.33±1562.90,单因素ANOVA F(2,23)＝5.186,p＝0.0138)时，也发现了治疗作用，其中AOL 10mg/kg组的AUC显著高于溶媒组(Tukey事后，p＝0.0107)。平均值±SEM值示于图8，统计分析示于表5。

表5：对图8中的数据的治疗因素的事后分析。Tukey事后分析表中的数字表示p值。粗体值对应于显著(p<0.05)结果。

治疗五周后，处死时，在禁食2小时的小鼠中测量血糖水平。

AOL倾向于降低血糖水平(图9)，在表6中给出统计分析。

单因素ANOVA	平方和	自由度	平方和的平均	F	p
						治疗	3972	2	1986	2.586	0.0980
剩余	16898	22	768.1

表6：图9所示数据的统计分析。

结论

在饮食诱导的肥胖动物中，长期每日施用AOL趋于降低DIO小鼠的体重和食物摄入量(数据未显示)。因此，这与减少脂肪量和基础血糖水平的趋势有关。

总体而言，这些数据表明AOL在饮食肥胖模型中会具有某些有益的作用。

实施例4：AOL在神经疾病：帕金森病中的作用

在这项研究中，通过对帕金森病的亚慢性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)小鼠模型的黑质(SN)中酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元的数量进行计数来评估AOL的潜在神经保护作用。连续11天用AOL(5mg/kg；经腹膜内)或溶媒治疗小鼠。在治疗第4-8天施用MPTP(20mg/kg；经腹腔内)或生理盐水。在最后一次治疗后的第12天杀死所有小鼠。

在C57/b16小鼠中进行亚慢性MPTP施用诱导了黑质纹状体多巴胺能神经元的变性，从而导致SN中TH阳性神经元的数量减少，在这种情况下，减少了39％。

材料与方法

对于溶媒条件，将实验物品溶解在0.5％DMSO/0.95％Tween 20的盐水溶液中，同时以5mg/kg的剂量经腹膜内(i.p.)施用AOL。施用量为10mL/kg。

将重达22-28g的C57bl/6雄性小鼠(Janvier)饲养在温控室内，进行12小时的明/暗循环，自由进食和饮水。为了实验性地达到每组n＝10的最终数量，考虑到实验过程中可能出现的损失，使用每组n＝12。为了在黑质中产生多巴胺能神经元的神经变性，用MPTP盐酸盐(20mg/kg，经腹腔内每天一次，连续五天)治疗小鼠。

最后一次施用后通过颈脱位法对小鼠进行人道安乐死。

将大脑的尾部半部分(包含黑质)放入多聚甲醛(于0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)中4％，pH 7.4)中5天，然后转移至20％蔗糖(于0.1M PBS中20％)中，用于抗冻保护。然后将组织冷冻在冷的异戊烷中(-50℃±2℃)。

解剖出纹状体，称重并分别在干冰中(-70℃±10℃)速冻。组织样品存储在-70℃(±10℃)，用于可选的多巴胺及其代谢产物的HPLC分析。如果不采用此选项，则纹状体会被破坏。

在低温恒温器上以50μm的间隔切割整个中脑的冠状连续切片。收集自由漂浮在含有冷冻保护剂溶液的孔板中的切片，然后将其储存在-20℃下，直到TH免疫组织化学处理的当天。

按如下对每四个切片进行TH免疫组织化学。从-20℃的冷冻库中取出组织切片，放置直到其恢复至室温，然后在PBS溶液中冲洗。通过在含有0.3％H₂O₂的PBS中孵育10分钟来抑制内源性过氧化物酶。此后，将切片在PBS中洗涤，在4％PBS的正常马血清(NHS)和0.3％Triton X-100中孵育30分钟，以阻断非特异性抗原位点。然后将切片在抗体稀释剂+酪氨酸羟化酶(TH)的第一抗体(抗TH亲和力分离的抗体，Sigma T8700，以1/10,000稀释)中在室温下孵育过夜。然后将切片在PBS中彻底冲洗，并在ImmPRESS Ig过氧化物酶聚合物检测试剂(Vector MP7401)中孵育30分钟。之后，用PBS彻底清洗切片。然后用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)/Tris/H₂O₂试剂盒(Vector SK4100)显示免疫染色。一分钟后，通过几次PBS洗涤停止显示。固定切片，并用0.1％的甲苯酚紫复染。

使用无偏的体视学分析来估计TH免疫阳性(TH+)神经元的数量(Mercator，Explora Nova，La Rochelle，法国)。通过检查不同的TH+神经元组的大小和形状来确定SN的边界。使用以下公式计算体积：V＝ΣS td；其中ΣS是表面积的总和，t是平均切片厚度，d是测量的两个连续切片之间的片数。每4个切片使用1个；使用系统抽样方案分配光学解剖器。解剖器(长度为50μm，宽度为40μm)彼此分开150μm(x)和120μm(y)。以下公式用于估计TH+神经元的数量：N＝V(SN)(ΣQ-/ΣV(dis))；其中，N是细胞数量的估计值，V是SN的体积，ΣQ-是在解剖器中计数的细胞数量，而ΣV(dis)是所有解剖器的总体积。然后计算每组的神经元的平均估计数和SEM。

所有统计分析均使用Graphpad Prism第7版进行。所有数据均表示为平均值±标准平均误差(SEM)。先通过单因素ANOVA分析AOL的作用，然后再进行Dunnett多重比较事后分析。P值小于0.05被认为是显著的。

结果

治疗对SN中TH+细胞的数量有显著影响(F2,29＝10.94，p<0.001，图10)。与溶媒治疗的动物相比，在MPTP治疗的动物中，SN中的TH+细胞数量减少了39％(p<0.001)。施用AOL后，与溶媒相比，MPTP治疗的小鼠中的SN中TH+细胞的数量增加了44％(p<0.01)。

结论

与溶媒相比，连续11天以5mg/kg的剂量进行AOL治疗具有显著的神经保护作用，防止了SN中TH+细胞中的MPTP诱导的减少，从而使得施用AOL的SN中存活的细胞增加44％。

这些数据表明，AOL治疗可以保护黑质中的多巴胺能神经元免受MPTP中毒。

实施例5：AOL在心血管疾病：缺血再灌注损伤中的作用

本研究旨在评估AOL保护经灌注的大鼠心脏免受全心缺血和再灌注后发生的损伤的能力。

在用10μM AOL预处理或未预处理(对照溶媒)的分离的经灌注的大鼠心脏上研究了30分钟全心缺血，然后120分钟再灌注的收缩性和组织活性的影响(图11)。

材料与方法

所有程序均符合1986年英国动物(科学程序)法和国立卫生研究院出版的实验动物的护理和使用指南(NIH出版第85-23号，1996年修订)。将雄性Wistar大鼠(250-300g)用3％异氟烷麻醉，肝素化并通过腹膜内注射致死性戊巴比妥(130mg/kg)安乐死。快速收获心脏(约0.95g鲜重)并将其置于冰冷的Krebs-Henseleit缓冲液(pH7.4)中，该缓冲液含有(以mmol/L计)：NaCl 118、NaHCO₃ 25、KCl 4.8、KH₂PO₄ 1.2、MgSO₄ 1.2、葡萄糖11和CaCl₂ 1.8；在37℃下用95％O₂/5％CO₂充气。进行Langendorff心脏灌注(Garlid et al.,2006.Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.291(1)：H152-60)，并且通过连续测量心率收缩压乘积(RPP)评估收缩性，这是由于气囊放置在左心室并连接至压力传感器。以恒流模式(12mL/min)灌注心脏。稳定10分钟后，用溶媒(对照)或10μM AOL溶液治疗10分钟，通过将灌注流停止30分钟，同时在37℃将心脏浸入灌注缓冲液中来诱导全心常温缺血。在再灌注期结束时，对心脏进行染色以评估梗死大小，或使用液氮冷却术将心脏冷冻钳住(freeze-clamped)。在后一种情况下，将心脏在液氮下研磨，并保存在-80℃以进行进一步分析。

在再灌注期结束时，将心脏用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色：以13mL/min的速度用12％(w/v)的TTC溶液对心脏进行7分钟的灌注，以获得心脏中的1％的最终浓度。然后将心脏从插管上取下并在37℃下再孵育4分钟，然后将其垂直于纵轴切成6片。然后将切片在4％(w/v)***溶液中于4℃处理过夜，然后称重，然后再对每张切片的两侧进行拍照。通过测面法(AlphaEase v5.5)在每张照片上确定每侧的坏死区域和高危区域的表面积，并且由于全心脏经受缺血，梗死大小以心脏总横截面积的百分比表示。

来自6种独立制剂的数据表示为平均值±SEM。每组中的n数小于20，该分布被认为是非正态的，因此进行了非参数Mann-Whitney检验(SPSS统计17.0)以比较两组。如果p值低于0.05，则结果被认为是统计学显著的。

结果

图11显示了在缺血后再灌注的关键阶段期间RPP的变化，其在此被认为代表心脏收缩性。显然，AOL改善了收缩性，并且在进行了相同的变化后与用AOL治疗的对照心脏相比，再灌注2小时后，收缩性是对照心脏的约三倍。此时，准备心脏以进行TTC染色以评估组织活力。通过TTC染色证实了AOL心脏具有更高的收缩活性，治疗过的和未治疗过的心脏切片的照片(数据未显示)清楚地表明AOL可以诱导对心脏组织的重要保护。已对该保护进行了更彻底的分析，其结果如图12所示。梗死面积(受损组织)表示为每个独立实验的总表面积的百分比，以及经AOL治疗和未经治疗的心脏的平均值。结果清楚地表明，AOL可以高度显著地保护心脏组织免受缺血/再灌注损伤。实际上，通过AOL预处理可以挽救约50％的梗死组织(图12)。

结论

在离体(活体器官)条件下，这些结果扩展了AOL作为线粒体ROS产生抑制剂的作用，最可能在复合物I的水平上。

它们还证明了AOL不仅在心脏中而且在任何遭受缺血的组织中都具有针对缺血/再灌注损伤的组织保护的治疗意义。

实施例6：AOL在心血管疾病：肺动脉高压中的作用

本研究旨在研究线粒体在肺血管生理学中的作用，并为肺动脉高压提供一种新的替代治疗方法。该疾病的特征是肺动脉压升高和肺动脉重塑(PA)，导致肺血管阻力增加、右心室肥大、右心衰竭并最终导致死亡。

肺动脉高压可以分为五组，其中第一组对应于动脉型肺动脉高压。对于第3组，它包括由于肺部疾病(例如慢性阻塞性肺疾病)和/或肺泡低氧血症引起的肺动脉高压。

为了解决AOL的作用问题，使用了两种不同的大鼠模型：低氧模型和野百合碱诱导的模型，它们分别与第3组和第1组肺动脉高压共有病理生理学特征。

材料和方法

将雄性Wistar大鼠(300-400g)分为3组，并在4周后使用：

ο第一组(对照组或常氧大鼠–N大鼠)被饲养在环境室内空气中；

ο第二组(慢性低氧大鼠-CH大鼠)在低压室(50kPa)中暴露于慢性低氧3周；以及

ο第三组(MCT大鼠)以60mg/kg的单次剂量经腹膜内注射野百合碱。将MCT(Sigma，St Quentin Fallavier，法国)溶解在等体积的HCl(1M)和NaOH(1M)中。

在每组中，一些动物接受了AOL的治疗(Sulfarlem，EG Labo Eurogenerics。压碎的药片与食物混合，随意喂食)，而其他一些动物则未经治疗。每天对食用的食物称重，以估计所施用的AOL剂量。因此，在第二和第三组的3周实验期间，施用10mg/kg/天。

对于每种情况，使用7至10只大鼠。所有动物护理和实验程序均符合欧洲实验动物科学协会联合会(the Federation of European Laboratory Animals ScienceAssociation)的建议，并得到当地伦理委员会(Comitéd’éthique régional d’Aquitaine)的批准(编号为50110016-A)。

通过测量平均肺动脉压(mPAP)和右心室肥大来评估肺动脉高压。为了测量PAP，通过经腹膜内注射戊巴比妥钠(Centravet，60mg/kg)麻醉N、CH和MCT大鼠，并在封闭胸腔的大鼠中，通过将导管***右颈静脉，然后通过右心房和右心室进入肺动脉，并连接至BaxterUniflow表压传感器来测量mPAP。右心室肥大是通过右心室(RV)与左心室加上隔膜(LV+S)重量的比值(富尔顿指数)来估算。

通过测量石蜡包埋的肺切片中肺动脉(PA)内侧(medial)厚度的百分比来评估PA重塑。根据常规组织学方法，首先用苏木精和伊红(VWR)对肺切片进行染色。在每个切片上，观察到三组10个不同横截面直径的腺泡内动脉来评估内侧壁厚度(即横截面直径为50μm以下、50至100μm和100至150μm)。

结果

结果表示为n个独立观察值的平均值±SEM。使用非参数检验对未配对样品分析了所有数据(Mann-Whitney检验)。图13显示了AOL对肺动脉压(图13A)和心脏重塑(图13B)的影响。n表示进行mPAP和富尔顿指数测量的大鼠数。所有条形图和统计数据均使用GraphpadPRISM软件(v6，Graphpad Software)进行。P＜0.05被认为是显著的。如图所示，AOL对对照组(N大鼠)无显著影响。但是，用AOL治疗的MCT大鼠的平均肺动脉压降低，并且用AOL治疗的CH大鼠的平均肺动脉压甚至更显著地降低。然而，AOL治疗对富尔顿指数没有影响。

图14显示了AOL对肺动脉重塑的影响。n表示用于分析内侧厚度测量值的百分比的血管数量。所有条形图和统计数据均使用Graphpad PRISM软件(v6，Graphpad Software)进行。P＜0.05被认为是显著的。AOL在CH大鼠中显示出显著的作用，其中肺动脉直径减少了≈30％。

结论

口服剂量为10mg/kg/天的AOL治疗预防和/或治疗体内肺动脉高压，特别是在第3组肺动脉高压中具有显著作用。结果确实显示出临床症状的显著改善。

这些数据表明线粒体在肺血管生理学中起主要作用，并将AOL的应用扩展到肺动脉高压的治疗中。

实施例7：AOL在衰老疾病和早衰综合征：黄斑变性中的作用

本研究旨在评估AOL保护视网膜免受进行性变性的能力。

材料与方法

将在低强度循环照明下饲养的大鼠转移到高强度循环照明下一周，并分为3组(未治疗的动物、溶媒治疗的动物和AOL治疗的动物)。在转移的7天中，治疗的动物接受了以6mg/kg/天的剂量注射的溶媒或AOL，每天三次(在灯亮前30分钟；下午1：00点；下午9.00点)。一周后，将动物转移到黑暗中(D0)。

对照组(“未转移”)没有转移至高强度循环照明下，而是接受了与上述相同的治疗：每天3次注射溶媒或AOL，共7天，然后转移到黑暗中(D0)。

在转移到黑暗中的第二天(D1)，实施第一次视网膜电描记术。它测量视网膜响应于光刺激而产生的电生理信号。它的典型特征是两个波，即a波和b波。a波代表来源于外部光感受器层的视锥细胞和视杆细胞的初始角膜负偏转。它反映了由于外段膜中钠离子通道的关闭导致光感受器的超极化。b波代表来源于内部视网膜(主要是Muller和ON双极细胞)的角膜正偏转。视网膜电图的分析在于测量这些波的振幅和/或潜伏期，作为光刺激强度的函数。对于给定的光刺激强度，a波振幅取决于光感受器的数量；而对于给定的光刺激强度和给定数量的光感受器，b波的幅度表示信号传输效率。

在D1的视网膜电描记术后，将动物转移回低强度循环照明条件下，并在D15实施第二次视网膜电描记术。

然后处死动物以进行组织学分析。测量视网膜各层的厚度，特别是外核层(ONL)和内核层(INL)的厚度(以μm为单位，从视神经并且在视神经盘的上下极中每0.39mm)。

结果

组织学分析报告在图15中。它表明，在对照组(“未转移”)中，用AOL治疗对ONL的厚度没有影响(图15A)。这表明AOL对视网膜的光感受器没有毒性作用。

相反，在未经治疗的动物中，高强度循环照明条件下的转移(“转移”)会诱导ONL的显著减少(在某些区域减少一半)。但是，AOL倾向于保护ONL免受光诱导的损害。组织学分析确实表明，在AOL治疗/高强度循环光暴露下的动物中的ONL的厚度显著增加(图15B)。

结论

AOL治疗对光诱导的视网膜损害具有显著的保护作用。尤其是，在长时间的高强度循环照明下，与未治疗的动物相比，视网膜的厚度得以保持。

实施例8：AOL在与线粒体功能障碍有关的疾病中的作用

本研究旨在在氧化磷酸化功能障碍模型中测试AOL在体内的作用。

材料与方法

在CD1背景上使用缺乏线粒体Mn超氧化物歧化酶(Sod2-KO)的小鼠。这种遗传改变导致不良表型和动物在平均8日龄时死亡。线粒体超氧化物歧化酶是一种自由基清除酶，其将超氧化物(高反应性)转化为过氧化氢(低反应性)，然后可以穿过线粒体膜并通过基质和胞质抗氧化剂体系进行解毒。这项研究的目的是测试AOL是否可以通过其对I_Q超氧化物产生的活性来挽救Sod2-KO表型。

出生后，对幼鼠进行基因分型(3日龄)，同胎生仔数减少到每笼6只。然后对动物进行治疗(AOL-5mg/kg)或不治疗(仅在下文中标注为KOL)。剂量的选择主要取决于化合物的溶解度极限(在

中为2.8mM)和在幼鼠的最大可注射体积(每克体重6μL至7μL)。对同一双亲的两个不同代进行了两项研究：寿命；和心脏中的琥珀酸脱氢酶活性(SDH)和肝中脏的油红O染色。每天对动物称重并注射(经腹膜内)。

琥珀酸脱氢酶活性是线粒体基质中超氧化物的标志。因此，SOD2的缺乏与心脏中SDH活性的降低有关。该实验的目的是测试AOL是否可以恢复KO小鼠的SDH活性。

油红O(Oil Red O)染色是已显示在Sod2-KO肝脏中累积的脂质的标志物。但是，超氧化物/过氧化氢的产生与肝脂质累积之间没有直接联系。该研究的目的是测试AOL预防Sod2-KO小鼠的肝脂质累积的效力。

结果

寿命

组成4个小组：

1-WT-KOL(n＝7)，仅用溶媒治疗的野生型小鼠组；

2-WT-AOL(n＝17)，用AOL治疗的野生型小鼠组；

3-KO-KOL(n＝2)，仅用溶媒治疗的Sod2-KO小鼠组；

4-KO-AOL(n＝4)，用AOL治疗的Sod2-KO小鼠组。

动物从3日龄起开始每天注射一次，直至它们死亡。

图16A和图16B示出了体重(A)和初始体重的百分比的变化。这些结果表明，KO小鼠的体重和体重增加低于WT小鼠。然而，如从第8天到第12天观察到的，用AOL治疗倾向于减轻这种作用，表明该化合物具有潜在的有益作用。

图16C显示了Sod2-KO小鼠的存活率，无论是否用AOL治疗。鉴于以上结果所预期，通过AOL治疗略微改善了KO小鼠的中值寿命和最大寿命，与未治疗的小鼠相比，经AOL治疗的小鼠的寿命延长了2天，从而支持了AOL的有益作用。

心脏中的SDH活性和油红O染色

组成5个小组：

1-未注射WT(n＝6)，未经治疗的野生型小鼠组；

2-WT-KOL(n＝6)，仅用溶媒治疗的野生型小鼠组；

3-WT-AOL(n＝6)，用AOL治疗的野生型小鼠组；

4-KO-KOL(n＝4)，仅用溶媒治疗的Sod2-KO小鼠组；

5-KO-AOL(n＝6)，用AOL治疗的Sod2-KO小鼠组。

在这项研究中，从第3天到第5天每天(5mg/kg)对动物进行治疗。在第6天收获心脏和肝脏。

如所预期的，与WT型动物相比，KO中的SDH活性倾向于降低(不显著)。然而，在KO小鼠中，AOL仅显示了非常轻微的SDH活性增加，但无法将SDH活性恢复到WT小鼠的水平(图17)。

图18显示了脂质液滴的平均大小(图A)、密度(图B)和面积(图C)。与WT型动物相比，未经治疗的KO小鼠表现出高脂质含量表型。但是，在经AOL治疗的KO小鼠中，与未治疗的动物相比，脂质滴的密度降低。更重要的是，这些结果还表明，AOL治疗能够恢复KO小鼠体内的总脂质面积，这与对Sod2-KO小鼠体内线粒体超氧化物产生的靶向抑制相一致。

结论

体内研究显示出令人鼓舞的结果。尽管AOL治疗不能完全抵消小鼠中SOD2耗竭的影响，但结果表明，与未经治疗的KO动物相比，寿命仍可以延长几天，同时缓解了体重增加的减少。这表明AOL的潜在作用。

已知AOL的生物利用度非常短。因此，在这些实验中，较高剂量的治疗可能会改善AOL效果。但是，组成性KO仍保持高度不良的表型，只能用一种非常特异性的治疗救护，并且会需要与其他药物协同作用。

在体内，结果还显示AOL可以恢复脂质含量和/或防止脂质在Sod2-KO小鼠肝脏中的累积。

实施例9：AOX在高浓度(超过20μM)下影响线粒体氧化性磷酸化

材料与方法

动物程序和伦理声明

所描述的所有实验均按照国家和欧洲研究委员会关于实验动物的护理和使用指南进行。P.Diolez拥有法国Ministère de l’agriculture et de la Forêt的Service Vétérinaire de la Santéet de la Protection Animale颁发的进行动物试验的有效许可证(1999年3月17日，许可证号3308010)。

材料

除蔗糖和NADH氧化酶(其购自默克(Merck)公司(Darmstadt，德国))外，所有化学品均为试剂级，购自西格玛化学公司(St.Louis,MO)。AOL和AOX是OP2(Bordeaux，法国)的馈赠。在DMSO中制备15mM储备溶液，并在0℃的黑暗中保持几天。

心脏线粒体的分离

雄性Wistar大鼠(250-325g；获自Janvier Lab，Le Genest-Saint-Isle，法国)，通过打昏和颈脱位法杀死，并迅速取出心脏并在含有100mM蔗糖、180mM KCl、50mM Tris、5mMMgCl₂、10mM EDTA和0.1％(w/v)脱脂BSA(pH 7.2)的冷分离培养基中洗涤。

心脏线粒体的分离是在冷室中进行的。在均质化之前，用剪刀切碎心脏(约1.5g)，并在5mL补充有蛋白酶(2mg XXIV型细菌蛋白酶/mL分离缓冲液)的相同培养基中搅拌处理5分钟。将组织悬浮液倒入50mL玻璃Potter均质器中，用20mL分离缓冲液稀释，然后使用机动的聚四氟乙烯(Teflon)杵均质化3分钟。通过滤布(Sefar Nitex)过滤匀浆以除去碎屑，并以8,000g离心10分钟。将所得沉淀物用5mL分离缓冲液冲洗，重悬于25mL相同缓冲液中，然后进行低速离心(400g)8分钟。将得到的上清液以7,000g离心两次，持续15分钟，以产生洗涤后的线粒体沉淀物，将其轻轻重悬于150μL分离缓冲液中。使用BSA为标准，通过Bradford方法(Sigma，试剂盒#B6916)测定蛋白质浓度。线粒体以终浓度为40-50mg/mL在冰上保持小于5小时。

线粒体耗氧量和ATP合成

使用高分辨率血氧仪(Oxygraph-2K，Oroboros Instruments，奥地利)在25℃在恒定搅拌下，通过极谱法记录了在不存在AOL或存在AOL的情况下以递增剂量(0至终浓度100μM)孵育的心脏线粒体的耗氧率(0.1mg/mL)。呼吸培养基包含140mM蔗糖、100mM KCl、1mMEGTA、20mM MgCl₂、10mM KH₂PO₄和1g/L(w/v)基本不含脂肪酸的BSA(pH 7.2)。

如前所述(Gouspillou et al.,2014.Aging Cell.13(1)：39-48)，在相同条件下使用高灵敏度pH电极(Metrohm)测量ATP的合成。

线粒体ROS/H₂O₂的产生

在外源性辣根过氧化物酶(HRP，EC 1.11.1.7，Sigma)的存在下，通过氧化无色非荧光指示剂Amplex Red来评估心脏线粒体的ROS/H₂O₂产生的速率。H₂O₂以1：1的化学计量比与Amplex Red反应，生成荧光化合物试卤灵(激发：560nm；发射：585nm)，其一旦形成就很稳定。用配备有温度控制和搅拌的分光荧光计(SAFAS Xenius，摩纳哥)连续测量荧光。

将分离的线粒体(0.1mg/mL)在与之前相同的实验缓冲液中补充了15μM AmplexRed和10μg/mL HRP的缓冲液中孵育。谷氨酸盐(5mM)/苹果酸盐(2.5mM)与琥珀酸盐(5mM)分别用作复合物I和复合物II的底物。实验在非磷酸化条件下，在15μM白术苷的存在下进行的。然后，依次加入鱼藤酮(1.5μM)、抗霉素A(2μM)和粘噻唑(0.2μM)以抑制电子转移链中的氧化还原中心(参见图2)，即位点I_Q、I_F(用鱼藤酮)，III_Qi(用抗霉素A)和III_QO(用粘噻唑)。最后，在所有相关化合物(包括AOL)存在下，用已知量的H₂O₂(300nM的步幅)校准测定。在心脏线粒体不存在和NAD(P)H氧化酶(EC 1.6.3.3,5mU/mL,Sigma)和NADH(100μM)溶液的存在下，进行了AOL、AOX和Oltipraz对Amplex Red测定本身和NAD(P)H氧化酶ROS/H₂O₂的产生没有影响的对照实验。

结果

我们首先证实了AOX化合物是否直接影响从大鼠心脏分离的线粒体的氧化性磷酸化作用。这是通过使用目前经典的测氧描记法进行的(图19A)。首先用各种AOX浓度(20至100μM)孵育线粒体，然后添加呼吸底物(底物状态，黑色曲线)，然后加入饱和ADP浓度以获得最大的氧化性磷酸化率(耗氧量的斜率，灰色曲线)，最后加入苍术苷(ATR)，该物质抑制ADP/ATP转运蛋白，并在非磷酸化条件下产生线粒体泄漏速率(图19A)。图19B显示了用琥珀酸盐(+鱼藤酮)将电子馈送到呼吸链所获得的结果。选择该底物是因为它最能反映呼吸链的调节。结果表明，在“底物”状态和ATR状态(内膜质子泄漏速率)下，AOX引起最高达50μM的浓度增加，然后超过50μM的浓度减少。这些数据表明，浓度高于20μM时，AOX对氧化性磷酸化具有解偶联作用，并同时抑制氧化率。数据表明，在这些条件下，高浓度的AOX(高于20μM)对线粒体的氧化性磷酸化(即呼吸链活性和ATP合成两者)以及线粒体内膜完整性(添加ATR后测得的泄漏率)的影响。

图20显示了AOX对分离的大鼠心脏线粒体的磷酸化率(ATP合成率)的影响。结果证实，浓度低于20μM不会通过分离的线粒体改变ATP的合成。但是，较高的浓度确实会有效降低磷酸化率，并在60μM时完全消除其磷酸化率。

实施例10：AOX抑制线粒体的超氧化物/H₂O₂产生

如前所述，线粒体ROS产生高度依赖于线粒体的活性和条件。尽管我们在许多条件下测试了AOL对线粒体产生ROS的影响，但为清楚起见，我们选择在此仅介绍AOL的非常特异性的作用中最具代表性的结果。使电子传递到整个呼吸链的完整底物组合(即谷氨酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐)(图2A)的存在最能代表代谢活跃的细胞中的原位条件。此外，最大的线粒体ROS/H₂O₂产生并不会发生在高线粒体磷酸化的条件下，而是在电子转运体的高度还原(即，低或没有磷酸化)的条件下。这些条件在ATR的存在下得到满足，并且我们可以有效地验证在饱和ADP的条件下添加ATR会触发ROS的产生，其在最大磷酸化条件下处于检测限(结果未显示)。在这些条件下，ROS在呼吸链的不同位点产生(Orr et al.,2013.FreeRadic.Biol.Med.65：1047-1059；Quinlan et al.,2013.Redox Biol.1：304-312)(图2)。

我们设计了一系列抑制剂滴定法，以解释在最大ROS产生的条件下AOL对整个呼吸链的ROS产生的影响(图2E)。在存在底物组合而不存在复合物的特异性抑制剂的情况下，ROS的产生最多，并且主要来自于位点I_Q处的反向电子传递(图2A)。添加鱼藤酮(一种与I_Q催化位点特异性结合的复合物I的经典抑制剂)后，ROS产生急剧下降，并且几乎全部发生在位点III_QO处(图2B)。因此，添加鱼藤酮后ROS产生的减少(通过Amplex Red方法测量，图22)代表了复合物I的ROS产生的活性。

图21说明了在这些条件下测得的AOX浓度增加(从2.5至20μM)对ROS/H₂O₂产生的影响。从该图显示的结果可以清楚地看出，AOX以低于AOL所需浓度的浓度强烈地抑制复合物I的ROS产生(参见图3进行比较)。实际上，低至2.5μM的AOX浓度对位点I_Q处的ROS产生具有抑制作用，估算IC₅₀为约9.5μM(最低：-72.5272±68.64；最高：554.045±19.73；IC₅₀：9.46768±1.018；Hill系数：2.61579±0.5706)。

实施例11：AOX不清除NAD(P)H氧化酶的的非线粒体超氧化物/H₂O ₂ 产生

使用用于测量线粒体的ROS/H₂O₂的过氧化物酶-Amplex Red系统，在体外进一步测试了AOX的作用机理，该系统实际上是通过将Amplex Red氧化为荧光试卤灵来测量H₂O₂的出现(图22)。在不存在线粒体的情况下，通过向测定中添加代替的产生H₂O₂的系统，可以测试AOX对这种非线粒体超氧化物/H₂O₂产生的影响。这是通过使用商用NAD(P)H氧化酶(该酶在添加的NAD(P)H存在下产生H₂O₂)，并测量Amplex Red至试卤灵的还原来进行。我们比较了AOX的浓度增加(10μM至100μM)与AOL和Oltipraz的浓度增加的影响(图22A)。给出的结果表明，尽管在这些条件下AOL和AOX均对ROS的测量没有全局影响，但Oltipraz不断减少了该测定中测量的ROS量。因此，这些结果表明Oltipraz抑制NAD(P)H氧化酶或用作中度(较差)的自由基清除剂并结合过氧化物/H₂O₂(其在过氧化物酶测定中是不能用的)，但在所有情况下均抑制非线粒体(模仿胞质)超氧化物/H₂O₂产生。它们还排除了AOX和AOL对NAD(P)H氧化酶或对过氧化物酶活性的任何影响。这些结果证实AOX和AOL不会干扰测量系统，也不会直接与H₂O₂相互作用。有趣的是，这些结果还表明AOX和AOL不会抑制NADP(H)氧化酶的ROS/H₂O₂产生，NADP(H)氧化酶是细胞中一种(如果不止一种)主要的非线粒体ROS/H₂O₂产生者。图22B的方案概括了AOX和AOL对线粒体和NAD(P)H氧化酶的ROS/H₂O₂产生的作用模式的不同信息。

在对从大鼠心脏中分离的线粒体进行测试时，AOL有效降低了线粒体ROS/H₂O₂产生(在分离的线粒体中，H₂O₂是由线粒体超氧化物歧化酶还原ROS产生的)。但是，此处给出的结果清楚地表明AOX不能用作为抗氧化剂或自由基清除剂。尽管抗氧化剂是通常的ROS/H₂O₂清除剂，但AOX表现出对复合物I中的位点I_Q的ROS的形成具有选择性，这表明AOX不是简单地与超氧自由基相互作用，而是特异性地阻止了它们在复合物I中的形成。因此，在这方面，AOX通过防止ROS形成并因此更有效地保护线粒体免受其自身ROS的侵害，似乎成为一类全新的氧化性应激保护剂的成员。我们在这里还显示了一些证据，表明AOX仅与线粒体相互作用，而不会影响胞质中氧自由基的形成，因此不会影响细胞内信号传导。

鱼藤酮或神经毒素MPP+对复合物I活性的抑制作用与啮齿动物和人类的帕金森病有关，表明功能失调的复合物I、ROS产生与神经变性之间存在联系(Langston et al.,1983.Science.219(4587)：979-980；Betarbet et al.,2000.Nat.Neurosci.3(12)：1301-1306)。相比之下，比较分析显示，来自位点I_Q而不是位点I_F的最大超氧化物/H₂O₂产生与不同脊椎动物的种的最大寿命之间存在反比关系(Lambert et al.,2007.Aging Cell.6(5):607-618；Lambert et al.,2010.Aging Cell.9(1):78-91)。因此，来自位点I_Q或位点I_F的超氧化物/H₂O₂产生的选择性调节剂将提供独特的机会来探究线粒体ROS产生在正常和病理过程中的推定作用(Orr et al.,2013.Free Radic.Biol.Med.65:1047-1059)。

这些结果有效地证明了AOX不是自由基清除剂；否则，其对ROS测量的影响会与超氧化物/H₂O₂的起源(线粒体或非线粒体)无关。尽管其机理尚待研究，但此处提供的证据表明AOX化合物特异性干扰线粒体复合物I，并选择性抑制来自复合物I的泛醌结合位点(位点I_Q)的超氧化物产生。

总而言之，AOX性质似乎代表了在寻找细胞中ROS/H₂O₂产生的特异性线粒体靶向调节剂方面的突破。AOX在ROS产生的上游起作用，因此确保了比经典的抗氧化剂更高的保护作用。

实施例12：AOX特异性地抑制线粒体ROS产生但不抑制胞质ROS产生

材料与方法

人非小细胞癌细胞系H460和A549获自ATCC。将细胞培养在由DMEM(GIBCO)、10％FBS(GIBCO)和100单位的青霉素和100μg/mL链霉素(GIBCO)组成的生长培养基中。将细胞保持在75-cm²的T瓶或175-cm²的T瓶(BD Biosciences)中，并置于37℃、95％湿度和5％CO₂的恒温箱(型号3100系列，Forma Scientific，Marietta，OH)中。每隔一天更新细胞培养基。每2至3天，使用0.25％的胰蛋白酶溶液(Gibco)将H460和A549培养物从培养瓶中分离，并进行继代培养。在继代培养时，所有培养物保持在80-90％的汇合。

细胞毒性筛选通过磺酰罗丹明B比色测定法进行。将A549和H460细胞(2.10³)接种在96孔板上，粘附后，细胞于5至500μM的AOL或AOX或对照的二甲基亚砜(DMSO)中孵育。根据Vichai(Vichai et al.,2006.Nat.Protoc.1(3):1112-6)，在48小时处理的磺酰罗丹明B(SRB)测定后评估了细胞毒性。

细胞迁移测定在Transwells(Corning Inc.，孔径为8.0-μm)中进行。为了进行迁移测定，将无血清培养基中的2.10⁴细胞添加到上部孔中。将含有10％FBS的培养基添加到下部孔中。16小时后通过滤膜迁移的细胞用0.2％结晶紫染色并使用Image J软件计数。

使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software，Inc.)进行统计分析。结果表示为n个独立实验的平均值±SEM值。各组之间的比较是通过单因素ANOVA和posteriori Dunnett检验进行的。在适当的情况下，使用未配对的学生t检验或Mann-Whitney检验。差异为p＜0.05被认为是显著的。

结果

AOX对培养细胞无细胞毒性

对两种癌细胞系(H460和A459)在较大浓度范围(0至500μM)进行AOX的细胞毒性的测试。结果示于图23。

积极地，当浓度低于100μM时，未观察到显著的毒性，而细胞活力仅对于更高浓度的AOX突然下降(图23A)。通过在半对数图上绘制这些结果(图23B)，我们可以计算出高剂量AOX毒性的IC₅₀为134.8±0.3μM。这些结果表明，即使对于高浓度(100μM)，AOX对培养的细胞也没有有害作用。

AOX对癌细胞呼吸没有影响

使用经典的氧描记法评估AOX(0至40μM)对癌细胞的作用，并与姐妹分子AOL的作用进行比较。

已经连续测量了H460静息细胞的耗氧量，并向制剂中注入了浓度不断增加的AOL和AOX(0至40μM)(图24)。可以看出，使用AOX或AOL的H460细胞的耗氧率没有变化，表明线粒体活性和细胞能量代谢没有细胞内扰动。这些结果证实了AOL和AOX对细胞功能没有有害作用。

AOX对癌细胞转移活性的影响

细胞迁移的Transwell测试已用于该测定，并且在两种不同浓度的AOX(5和10μM)存在下测量了H460癌细胞的迁移，并与作为胞质ROS产生的阳性对照的100μM N-乙酰半胱氨酸(NAC)的作用进行了比较(图25)。

图25A显示了针对不同测定条件的下隔室中染色细胞的照片。结果显示在直方图中(图25B)，并证明了AOX不会诱导转移活性，因为穿过膜的细胞数量在对照和AOX条件下是相当的。相比之下，在NAC(一种靶向细胞溶质ROS的典型的细胞渗透性自由基清除剂)的存在下，我们观察到转移活性的大幅增加。

这些结果清楚地表明，AOX作为线粒体ROS产生的抑制剂的作用不会干扰胞质ROS产生。

结论

当直接应用于分离的线粒体时，高浓度(20μM以上)的AOX对线粒体功能有一些不利影响，这可能是由于分子的质子化作用引起的，它会用作弱酸并干扰线粒体膜电位。但是，可以观察到，在即使高浓度也不会触发线粒体功能障碍的完整细胞中，无法达到这些条件。

因此，这些结果表明，对于超过100μM的浓度，即，远远超过治疗处理中的潜在循环浓度，AOX对培养的细胞没有毒性作用。已经证实，在这些条件下，AOX对细胞呼吸和能量代谢没有影响。

与增加了癌细胞转移活性的N-乙酰半胱氨酸(NAC)相比，AOX对癌细胞的转移活性没有作用，这证实了AOX对线粒体ROS抑制的特异性，也证实AOX对胞质ROS产生没有影响。

实施例13：AOX在心血管疾病：肺动脉高压中的作用

本研究旨在为肺动脉高压提供一种新的替代治疗方法。该疾病的特征是肺动脉压升高和肺动脉重塑，导致肺血管阻力增加，右心室肥大，右心衰竭并最终导致死亡。

比较AOX和AOL对肺内动脉收缩力的作用

为了解决AOX的作用的问题，在不存在或存在AOL或AOX的情况下，使用5-羟色胺或内皮素对肺内动脉由激动剂引起的收缩进行了等距张力测量。

材料与方法

将一级肺动脉(IPA1)分成外径为1.5-2mm的短管状段，并用于等距收缩测量。将动脉环安装在隔离的器官浴系统中，该系统包含37℃的Krebs溶液(包含118.4mM NaCl、4.7mMKCl、1.2mM MgSO₄、25mM NaHCO₃、1.2mM KH₂PO₄、2.5mM CaCl₂和11.1mM D-葡萄糖，用NaOH调节至pH 7.4)，并且连续吹入15％O₂/5％CO₂。对动脉环施加0.8到1g的初始载荷。使组织在Kreb溶液中平衡1小时，然后每15分钟洗一次。应用高KCl溶液(80mM)以获得用于标准化后续收缩响应的参考收缩。

然后通过构建针对5-羟色胺(5HT，10^-4至10^-8M)或内皮素(ET-1，10^-7至10^-10M)的累积浓度-响应曲线(CCRC)来测试对不同激动剂的收缩响应。当指示时，将AOL或AOX预孵育30分钟，然后在药物存在下构建针对激动剂的CCRC。通过从Kreb溶液中用等摩尔量的KCl代替NaCl，可以获得高钾溶液。通过检查由10μM氨甲酰胆碱在0.3μM Phe诱导的预收缩肺动脉环上引起的松弛来测试每个环的内皮功能。使用与IOX软件(EMKA Technologies，巴黎，法国)连接的传感器系统评估了被动和主动的机械性能，以便于数据采集和分析。

结果

收缩取决于5-羟色胺(5HT)或内皮素(ET-1)的浓度，最大收缩率用100μM 5HT和0.1μM ET-1测量。

AOL可以放松由高达5.10^-5M的5-羟色胺诱导的收缩，但对内皮素诱导的收缩没有影响(图26A)。

在含有10μM AOX的浴中孵育的环上观察到相同的响应模式(图26B)。但是，使用较高浓度的AOX可以放松由10^-4M 5-羟色胺诱导的收缩。

结论

这些数据进一步证实线粒体在肺脉管生理中起主要作用，并且表明AOX在减轻肺动脉收缩性以及因此在预防和/或治疗肺动脉高压方面比AOL具有更大的功效。

AOL对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

材料与方法

基于对DNA合成期间5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)掺入的测量，使用比色免疫测定试剂盒(Roche Applied Science,Indianapolis,Ind.,美国)测定肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖。

将分离的PASMC接种在96孔培养板上补充有10％胎牛血清(FCS)且密度为5.103细胞/孔/100μL的培养基中。将培养板置于37℃、空气中CO₂为5％的加湿培养箱中。48小时后，使细胞在补充有1％胰岛素-转铁蛋白-硒的无血清培养基中停止生长48小时。在此阶段结束时，将PASMC在含有以下任何一种的培养基中孵育24小时：

-0.2％FCS(对照条件)；

-0.2％FCS+10、20、60或100μM AOL；

-0.2％FCS+100μM 5HT(5-羟色胺)；

-0.2％FCS+100μM 5HT+10、20、60或100μM AOL；

-10％FCS；

-10％FCS+10、20、60或100μM AOL。

每种条件进行三次重复测试。然后将10μL BrdU(100μM)添加到培养基中，并将细胞在37℃下再孵育2小时。然后根据制造商的说明，使用比色法分析DNA的合成。通过在ELISA读取器(Spectrostar/nano；BMG Labtech，Champigny-sur-Marne，法国)中在380nm的波长和490nm的参考波长下测量样品的吸光度来确定新合成的BrdU DNA。

结果

如图27所示，AOL成功地抑制了高浓度FCS(10％)或在更多的生理条件下，即0.2％FCS和100μM 5HT的存在下诱导的增殖。

结论

这些数据表明，AOL在预防和/或治疗肺动脉高压方面具有潜在作用。

实施例14：AOX在心血管疾病：蒽环类药物的心脏毒性中的作用

本研究旨在评估AOX在蒽环类药物的心脏毒性模型中的作用。这是通过将蒽环类药物衍生的抗癌药与AOX一起施用于10周龄的大鼠14至17天来评估的。

材料与方法

该研究是在10周大的Sprague-Dawley大鼠上进行的，在收集心脏进行分析之前，经腹膜内施用14至17天的不同治疗。为了遵守动物实验中的“三个R原理”，尽可能限制测试组的数量，特别是通过将实验集中在仅一种蒽环类分子即多柔比星(Doxorubicine)上，并通过比较AOL与仅一种替代的保护分子即右雷佐生(Dexrazoxane)的作用。

在实验结束时，将被治疗的大鼠的心脏移出，并在Langendhorf系统中灌注这些心脏后进行详尽的心脏功能研究，以确定受多柔比星影响的心脏功能以及AOX治疗是否有效。

该研究包括5个不同的组，每组8只大鼠：

1-对照组。大鼠仅接受溶媒(由5％DMSO+95％NaCl 0.9％组成)，每天两次(早晨和晚上)，共17天；

2-Doxo组。大鼠接受3mg/kg(经腹腔)剂量的多柔比星，从第3天开始，每两天一次(早晨)。对于每隔一次的注射，大鼠仅接受溶媒。

3-Dexra组。大鼠用30mg/kg(经腹腔)剂量的右雷佐生(参考保护剂)，同时用3mg/kg(经腹腔)剂量的多柔比星治疗(根据法国地区卫生局“ARS”在2011年建议的剂量比)，从第3天起每两天，持续14天。对于每隔一次的注射，大鼠仅接受溶媒。

4-AOX组。大鼠接受AOX和多柔比星治疗：

ο4mg/kg(经腹腔)AOX，早晨和晚上，持续72小时，然后首次注射多柔比星；

ο多柔比星注射日(基于Doxo组)：4mg/kg(经腹腔)AOL与多柔比星一起注射，90分钟后，以4mg/kg(经腹腔)的剂量第二次注射AOL；

ο非多柔比星注射日：4mg/kg(经腹腔)AOL，早晨和晚上。

5-AOX/Carv/Enal组。与上述AOX组的大鼠相似的方式治疗大鼠。AOX注射补充了用于心脏功能不全的经典疗法(卡维地洛(Carvediol)，一种β受体阻滞剂，剂量为1mg/kg，和依那普利(Enalapril)，一种血管扩张剂，剂量为0.5mg/kg)。

实施例15：AOX在自身免疫疾病：硬皮病中的作用

本研究旨在测试AOX对硬皮病患者的成纤维细胞的作用。硬皮病是一种慢性全身性自身免疫性疾病，其特征在于胶原蛋白合成增加，小血管损伤，T淋巴细胞激活和改变的***产生。

材料与方法

将健康供体和硬皮病患者的成纤维细胞在完全DMEM培养基(10％FCS，1％抗生素)的烧瓶中培养。粘附6小时后，将细胞清除血清过夜。

临时制备了AOX。称重AOX，并以5mg/mL溶解在DMSO中。将该储备溶液用DMSO进一步稀释至最终浓度为10和5mM。将AOX在完全DMEM培养基中进一步稀释，以达到40μM、20μM和10μM的最终浓度。

使培养的细胞与40μM、20μM和10μM的AOX接触。使对照细胞与补充有DMSO(0.2％)和N-乙酰半胱氨酸(3mM)的完全DMEM培养基接触。细胞在常氧条件下(37℃，20％O₂)和低氧条件下(37℃，1％O₂)孵育6或24小时。

对于MMP-1、MIP和MCP分泌分析，收获培养上清液，等分并保存在-20℃下以备施用。根据制造商的说明，通过ELISA(Abcam)对MMP-1进行定量。MCP-1和MIP-1α的浓度通过CBA(Cytometric Bead Array，Biolegend)进行定量。

对于MMP1、胶原蛋白和CCl2表达分析，将细胞用胰蛋白酶分离并用PBS洗涤。然后将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液中，并根据制造商的说明(Nucleospin RNA Plus，Macherey Nagel)进行RNA提取。将1μg RNA逆转录(GoScript，Promega)，然后稀释10倍，在BioRad CFX384 PCR仪中进行SYBR Green qPCR(SYBR qPCR Premix Ex Taq，Takara)。MMP-1、Col1A2和CCl2的引物用于测量感兴趣的基因；Ppia、RPLP0和EEF1A1的引物用于测量参考基因。

实施例16：与Oltipraz相反，AOX选择性抑制位点I_Q处的ROS产生

材料与方法

从大鼠心脏中分离出新鲜的线粒体，然后测量线粒体悬浮液的蛋白质量，然后用Amplex Red和辣根过氧化物酶(HRP)进行荧光分析，以测定响应于外源添加的递增浓度的AOL、AOX和Oltipraz的H₂O₂产生。

线粒体ROS/H₂O₂产生的两个主要位点是通过使用琥珀酸盐(呼吸复合物2的能量底物)和已知的呼吸链抑制剂的组合分别靶向，即，对于位点I_Q，单独使用10mM琥珀酸盐(CCCP作为阳性对照)，以及对于位点III_Q外，使用10mM琥珀酸盐、4μM鱼藤酮和2.5μM抗霉素A(粘噻唑为阳性对照)。这些“反应”溶液被设计为主要从链中的单个位点形成ROS/H₂O₂产生的最大速率(Quinlan et al.,2013.Redox Biol.1:304-12)。

为了进行测量，在不存在或存在浓度增加(从0到80μM)的AOL、AOX或Oltipraz情况下，将50μM Amplex Red试剂和20μg/ml HRP的工作溶液混合成96孔板(Greiner 96F底部)的相应孔中的反应缓冲液。每孔添加线粒体至终浓度为0.125mg/mL即可启动测定。每个微孔板孔的合适总体积为200μL。

将板在黑暗中于室温孵育20-25分钟。在CLARIOstar读板仪(BMG LABTECH GmbH，德国)上读取终点荧光值之前，先进行两次轨道式振荡(100rpm–3秒)。实际上，H₂O₂以1：1的化学计量比与Amplex Red反应，生成荧光化合物试卤灵，通过以下光学设置(激发波长为546-20nm；发射波长为600-40nm；增益：750)进行分析。

另外，在实验缓冲液中制备了浓度范围为0至5μM的H₂O₂标准曲线，该缓冲液的组成为(以mM为单位)：140蔗糖、100KCl、1EGTA、20MgCl₂、10KH₂PO₄和1g/L(w/v)基本不含脂肪酸的BSA(pH 7.2)。

结果

图28说明了在这些条件下测得的AOL、AOX和Oltipraz的浓度增加(从0至80μM)对ROS/H₂O₂产生的影响。

从图28A的结果清楚地看出，AOL和AOX以低至2.5μM的浓度强烈地抑制复合物I的ROS产生。相反，相同浓度以及最高达80μM的Oltipraz对位点I_Q处的ROS产生仅显示出较差的抑制作用。

图28B进一步表明，这三种化合物都没有对复合物III的ROS产生的抑制作用。

总之，这些结果清楚地表明，与Oltipraz相反，AOL和AOX是线粒体ROS产生的位点I_Q的选择性抑制剂。

实施例17：AOX类似物抑制线粒体的超氧化物/H₂O₂产生

材料与方法

响应于各种AOX类似物的外源添加，使用与实施例16中上述相同的方案来测量ROS/H₂O₂产生。即，在不存在或存在浓度增加(1至25μM)的8种化合物(Cp1、Cp2、Cp3、Cp4、Cp5、Cp6a、Cp8、Cp9a)的情况下，将50μM Amplex Red试剂和20μg/mL HRP的工作溶液混合成96孔板(Greiner 96F底部)的相应孔中的反应缓冲液。每孔添加线粒体至终浓度为0.125mg/mL即可启动测定。每个微孔板孔的合适总体积为200μL。

结果

图29A和图29B说明了在这些条件下测得的AOX类似物的浓度增加(2.5至25μM)对ROS/H₂O₂产生的影响。

从这些图中呈现的结果清楚地表明，AOX类似物相对于复合物III选择性地抑制了复合物I的ROS产生。