阅读说明：本技术 一种即用型维生素b12检测载体及其制备方法 (Ready-to-use vitamin B12 detection carrier and preparation method thereof ) 是由 王舒乐 齐延林 张恒 于 2020-06-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种即用型维生素B12检测载体及其制备方法,该制备方法包括以下步骤：(1)将维生素B12测试培养基与塑形填充剂混合,装入载体容器后冻干；(2)将抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合,装入载体容器后冻干,获得位于维生素B12测试培养基固定层上的抗氧化阻隔层；(3)将已活化的维生素B12测试菌种分散于凝胶保护剂中,取菌悬液黏附于载体容器中并固定化干燥。本发明将精准定量的维生素B12测试菌种及维生素B12测试培养基溶液重塑于容器中,确保菌种及培养基的稳定性,无需菌种复壮及培养基称量、溶解、灭菌、分装等繁琐的制备过程,检测时只需加入维生素B12标准溶液或样品提取液即可完成实验,减少实验操作步骤,提高检测效率。(The invention discloses a ready-to-use vitamin B12 detection carrier and a preparation method thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) mixing vitamin B12 test medium with shaping filler, placing into carrier container, and lyophilizing; (2) mixing the antioxidant barrier solution with a shaping filler, filling the mixture into a carrier container, and freeze-drying to obtain an antioxidant barrier layer on a vitamin B12 test medium fixing layer; (3) dispersing activated vitamin B12 test strain in gel protectant, taking the strain suspension, adhering to carrier container, immobilizing and drying. According to the invention, the vitamin B12 test strain and the vitamin B12 test culture medium solution which are accurately and quantitatively remodeled in the container, so that the stability of the strain and the culture medium is ensured, the complicated preparation processes of strain rejuvenation, culture medium weighing, dissolving, sterilizing, subpackaging and the like are not needed, the experiment can be completed only by adding the vitamin B12 standard solution or the sample extracting solution during detection, the operation steps of the experiment are reduced, and the detection efficiency is improved.)

一种即用型维生素B12检测载体及其制备方法

技术领域

本发明属于水溶性维生素检测载体制备技术领域，具体涉及一种即用型维生素B12检测载体及其制备方法。

背景技术

国标中规定，微生物法是作为测定食品中维生素B12、叶酸、泛酸、生物素、维生素B6、烟酸等维生素的首选方法。微生物法实验前准备主要包括三大步骤：测试菌种的制备、试样/标准品的制备和培养基的配制。其中，测试菌种的制备需传代2~3代增强活力，耗费时间长，染菌几率大。而正确制备培养基是微生物实验室检测工作的基础，事关检测工作的准确性、可靠性。国标微生物法测定水溶性维生素的培养体系为10mL，试剂用量大，检测成本较高。

因微生物的营养需求范围大，维生素B12测试培养基中营养物质组分达28种以上，部分试剂组分含量极少，称量及配制的工作繁重。而商品化干粉合成培养基在一定程度上解决培养基繁琐的配制过程，但干粉培养基贮存条件较高，开封后干粉易吸潮结块变质，且国内现有的干粉培养基生产技术亦难以保证干粉物料的均质性及不同批次间的重复性。无论实验室自配培养基，亦或购买商品化的干粉合成培养基，均需经过称量、溶解、灭菌、分装的制备过程，培养基的制备过程中也常出现待测物质带入的污染风险，导致无法达到实验方法的检测效果。

中国发明专利CN201611094901公开一种用于微生物法定量检测维生素B12的微孔板、其试剂盒及其制备方法，美国发明专利US8357504B2公开一种微生物定量检测混合物中维生素的方法及试剂盒，上述发明专利方案中均提供了菌种、培养基、无菌水和标准品的制备方法，但仍存在以下问题：（1）测试菌种的制备使用脱脂奶粉培养菌种至凝乳状，菌种不易分离获得；（2）低真空室温的沸腾方式干燥菌种，易造成部分菌液喷出容器，导致容器中干燥菌量不一致；（3）微孔板上仅包含干燥菌种，使用时培养基需另外制备，培养基制备分装过程存在染菌风险。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种即用型维生素B12检测载体及其制备方法，本发明将精准定量的维生素B12测试菌种及维生素B12测试培养基溶液重塑于容器中，确保菌种及培养基的稳定性，无需菌种复壮及培养基称量、溶解、灭菌、分装等繁琐的制备过程，该载体容器中包含维生素B12测试培养基层、抗氧化阻隔层及干燥的维生素B12测试菌种，检测时只需加入维生素B12标准溶液或样品提取液即可完成实验，减少实验操作步骤，提高检测效率。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种即用型维生素B12检测载体的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，装入载体容器后冻干，获得维生素B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，装入载体容器以覆盖在已冻干的维生素B12测试培养基固定层上，冻干获得位于维生素B12测试培养基固定层上的抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的维生素B12测试菌种分散于凝胶保护剂中，取菌悬液黏附于载体容器中并固定化干燥，即得即用型维生素B12检测载体。

优选但不限定地，一种即用型维生素B12检测载体的制备方法，其包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取50~200μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃~-60℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1~3h，获得维生素B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取30~60μL覆盖在已冷冻固定的B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃~-60℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1~3h，获得维生素B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的维生素B12测试菌种分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在40~80%范围内，取1~10μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；

（4）维生素B12检测微孔板包装及贮存。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（1）（2）中，所述塑形填充剂组分包括：0.5~5wt%右旋糖酐5000~7500、1~10wt%聚乙二醇4000~8000及0.5~2wt%α-环状糊精，余量为水。

本发明使用的塑形填充剂可使培养基溶液冻干后提供‘骨架’，保证干燥的培养基疏松稳定的结构，利于复水时能快速完全溶解。

具体实现时，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃±3℃灭菌5~15min后迅速水浴冷却备用。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基与塑形填充剂混合体积比为（0.5~4）：1。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（2）中，所述抗氧化阻隔液组分包括：1~10wt%聚乙烯吡咯烷酮10k~40k、0.2~2wt%维生素E、0.5~3wt%抗坏血酸钠及0.001~0.05wt%谷胱甘肽，余量为水。

具体实现时，抗氧化阻隔液使用孔径为0.22~0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。因培养基成分中含有大量的糖及还原性组分，而且存在易吸潮及易氧化的问题，所以针对这两问题，本发明使用抗氧化阻隔液及分层冻干的隔绝保护方法，保证固定化培养基的稳定性。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂混合体积比为（0.5~2）：1。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述凝胶保护剂组分包括：1~10wt%甘露醇、0.05~0.5M氯化镁、0.2~5wt%牛奶酪蛋白、0.05~0.2wt%瓜尔胶/卡拉胶/黄原胶，余量为水。本发明使用的凝胶保护剂可保护冻干菌种经冷冻和干燥的胁迫条件依然保持较高的存活率，且保证菌种长期储存活力的稳定性。

具体实现时，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃±3℃灭菌5~15min后迅速水浴冷却备用。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述已活化的维生素B12测试菌种是维生素B12测试菌种菌粉或菌珠加入0.5~5mL维生素B12测试培养基中，再加入0.05~0.2ng/mL维生素B12标准溶液0.5~5mL进行活化获得，维生素B12测试菌种包含莱氏蔓士乳酸杆菌及其变异菌株、大肠杆菌及其变异菌株中的至少一种。

优选但不限定地，活化过程中，活化温度控制在37~42℃，活化时间为16~24h。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述固定化干燥程序为：预冻阶段为温度控制在-80℃~-60℃，保持1~3h；一次升华干燥阶段为温度控制在-60℃~-48℃，将真空度降至0.18~0.38mbar，达到最终真空度时间为7~12h；二次升华干燥阶段为-60℃~-48℃→0℃，真空度控制在0.18~0.38mbar，达到最终温度时间为 6~12h；解析干燥阶段为温度控制在27℃，真空度控制在0.010~0.020mbar，达到最终温度时间为6~12h。

因固定化培养基浓度较高，且糖类及蛋白质占比大，快速升温及抽真空均不利于培养基的固定化，因此分一次升华控制真空度，二次升华控制升温速度，以及解析使用接近常温及更低真空度，有利于残余水分的升华，保证菌种及培养基的干燥性。

作为本发明的所述即用型维生素B12检测载体的制备方法的一种实施方式，步骤（4）所述包装及贮存是指将已固定维生素B12培养基及维生素B12测试菌种的载体容器用铝箔袋密封保存，并在其中放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。

优选但不限定地，所述载体类型包括：微孔板（200~450μL）、离心管（300~5000μL）、培养试管（1mL~10mL）。

需要说明的是，步骤（1）中所述的维生素B12测试培养基配制浓度为2倍浓缩培养基。根据容器体积及检测方法所需培养体积，可适当浓缩或稀释培养基进行进一步固定化。于本发明中，对于测试培养基并没有特别的限定，测试培养基可以包括国标法内提供的测试培养基，商品化已有的测试培养基，但不局限于此，只要满足测试培养基内不含有待测组分，且能够满足测试菌种对待测组分浓度的生长具有相关性的均可使用。

一种即用型维生素B12检测载体，其通过任一上述的即用型维生素B12检测载体的制备方法制得。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：

本发明提供的一种即用型维生素B12检测载体，适用于微生物法定量检测维生素B12，微孔板中已预先固定化维生素B12测试菌种及维生素B12测定用培养基，检测维生素B12时，该载体容器中包含维生素B12测试培养基层、抗氧化阻隔层及干燥的维生素B12测试菌种，只需加入维生素B12标准溶液或样品提取液，即可完成实验，省去菌种及培养基制备的繁琐过程，也减少添加菌种及培养基的实验操作步骤，提高检测效率。

本发明的即用型维生素B12检测载体中包含维生素B12测试培养基层、抗氧化阻隔层及干燥的维生素B12测试菌种。本发明干燥菌种及固体培养基兼具结构稳定性高和复水性佳的优点，可实现大批量培养基及菌种的固定化，检测维生素B12时，只需加入维生素B12标准溶液或样品提取液即可完成实验，无需菌种及培养基制备的繁琐过程，也省去添加菌种及培养基的实验步骤，提高微孔板法检测维生素B12的实验效率。

经本发明技术方案的制备的即用型维生素B12检测载体，干燥菌种存活率≥92%，批次内微孔板变异系数<5%；且采取抗氧化阻隔液覆盖培养基分层固定化，有效防止培养基吸潮及氧化褐变等问题，干燥固体测试培养基复水即溶，培养效果与液体培养基基本无差异。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1

一种即用型维生素B12检测微孔板的制备方法及应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取95μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取35μL覆盖在已冷冻固定的B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的莱氏蔓士乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在80%范围内，取5μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；

（4）维生素B12检测微孔板包装及贮存。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基，1L维生素B12测试培养基含：无维生素酸水解酪蛋白30.0 g，葡萄糖80.0 g，天门冬酰胺0.4 g，醋酸钠40.0 g，抗环血酸8.0 g，L-胱氨酸0.8 g，DL-色氨酸0.8 g，硫酸腺嘌呤40.0 mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0mg，黄嘌呤40.0 mg，核黄素2.0 mg，盐酸硫胺素2.0 mg，生物素20.0 μg，烟酸4.0 mg，p-氨基苯甲酸4.0 mg，泛酸钙2.0 mg，盐酸吡哆醇4.0 mg，盐酸吡哆醛8.0 mg，盐酸吡哆胺1.60mg，叶酸400.0 μg，磷酸二氢钾2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.8 g，氯化钠40.0mg，硫酸亚铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）4.0 g，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅121℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B12测试培养基。

其中，步骤（1）（2）所述塑形填充剂组分包括：4wt%右旋糖酐5000、4wt%聚乙二醇8000及1wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：2wt%聚乙烯吡咯烷酮10k、1wt%维生素E、0.5wt%抗坏血酸钠及0.002wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。

其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：2wt%甘露醇、0.05M氯化镁、0.2wt%牛奶酪蛋白及0.05wt%黄原胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将莱氏蔓士乳酸杆菌菌珠加入0.5mL维生素B12测试培养基中，再加入0.1ng/mL维生素B12标准溶液0.5mL，活化温度42℃，活化时间为16h。

其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为： -80℃，保持1.5h；一次升华干燥阶段为-60℃，将真空度降至0.28mbar，达到最终真空度时间为7h；二次升华干燥阶段为-60℃→0℃，真空度控制在0.28 mbar，达到最终温度时间为 12h；解析干燥阶段最终温度为27℃，真空度控制在0.011mbar，达到最终温度时间为 12h。

其中，步骤（4）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B12测试培养基及莱氏蔓士乳酸杆菌的微孔板用铝箔袋密封保存，并在其中放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。

进行维生素B12 定量检测实验时，取300μL维生素B12标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。

经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B12检测微孔板中固定化的干燥莱士蔓氏乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的94%。

实施例2

一种即用型维生素B12检测微孔板的制备方法及应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取150μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-70℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取50μL覆盖在已冷冻固定的B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-70℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的莱氏蔓士乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在40%范围内，取2.5μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；

（4）维生素B12检测微孔板包装及贮存。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基，1L维生素B12测试培养基含：无维生素酸水解酪蛋白30.0 g，葡萄糖80.0 g，天门冬酰胺0.4 g，醋酸钠40.0 g，抗环血酸8.0 g，L-胱氨酸0.8 g，DL-色氨酸0.8 g，硫酸腺嘌呤40.0 mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0mg，黄嘌呤40.0 mg，核黄素2.0 mg，盐酸硫胺素2.0 mg，生物素20.0 μg，烟酸4.0 mg，p-氨基苯甲酸4.0 mg，泛酸钙2.0 mg，盐酸吡哆醇4.0 mg，盐酸吡哆醛8.0 mg，盐酸吡哆胺1.60mg，叶酸400.0 μg，磷酸二氢钾2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.8 g，氯化钠40.0mg，硫酸亚铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）4.0 g，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅121℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B12测试培养基。

其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂组分包括：2wt%右旋糖酐7500、2wt%聚乙二醇4000及0.8wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为1：1。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：5wt%聚乙烯吡咯烷酮40k、0.5wt%维生素E、2wt%抗坏血酸钠及0.05wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.22μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为1：1。

其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.1M氯化镁、0.5wt%牛奶酪蛋白及0.15wt%瓜尔胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃灭菌5min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（3）所述的菌种活化方式是指将莱氏蔓士乳酸杆菌菌珠加入2mL维生素B12测试培养基中，再加入0.05ng/mL维生素B12标准溶液2mL，活化温度40℃，活化时间为14h。

其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为-70℃，保持1.5h；一次升华干燥阶段为-60℃，将真空度降至0.28mbar，达到最终真空度时间为10h；二次升华干燥阶段为-60℃→0℃，真空度控制在0.28 mbar，达到最终温度时间为 12h；解析干燥阶段最终温度为27℃，真空度控制在0.011mbar，达到最终温度时间为 10h。

其中，步骤（4）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B12测试培养基及莱氏蔓士乳酸杆菌的微孔板用铝箔袋密封保存，并在其中放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。

进行维生素B12 定量检测实验时，取300μL维生素B12标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。

经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B12检测微孔板中固定化的干燥莱士蔓氏乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的92%。

实施例3

一种即用型维生素B12检测微孔板的制备方法及应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取50μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-60℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取30μL覆盖在已冷冻固定的B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-60℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的莱氏蔓士乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在60%范围内，取2.5μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；

（4）维生素B12检测微孔板包装及贮存。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基，1L维生素B12测试培养基含：无维生素酸水解酪蛋白30.0 g，葡萄糖80.0 g，天门冬酰胺0.4 g，醋酸钠40.0 g，抗环血酸8.0 g，L-胱氨酸0.8 g，DL-色氨酸0.8 g，硫酸腺嘌呤40.0 mg，盐酸鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0mg，黄嘌呤40.0 mg，核黄素2.0 mg，盐酸硫胺素2.0 mg，生物素20.0 μg，烟酸4.0 mg，p-氨基苯甲酸4.0 mg，泛酸钙2.0 mg，盐酸吡哆醇4.0 mg，盐酸吡哆醛8.0 mg，盐酸吡哆胺1.60mg，叶酸400.0 μg，磷酸二氢钾2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.8 g，氯化钠40.0mg，硫酸亚铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）4.0 g，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅121℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B12测试培养基。

其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂组分包括：4wt%右旋糖酐6000、8wt%聚乙二醇6000及1.5wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为4：1。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：8wt%聚乙烯吡咯烷酮20k、0.8wt%维生素E、1wt%抗坏血酸钠及0.005wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。

其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：3wt%甘露醇、0.08M氯化镁、2wt%牛奶酪蛋白及0.05wt%瓜尔卡拉胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（3）所述的菌种活化方式，将莱氏蔓士乳酸杆菌菌珠加入5mL维生素B12测试培养基中，再加入0.15ng/mL维生素B12标准溶液5mL，活化温度40℃，活化时间为18h。

其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为 -60℃，保持1.5h；一次升华干燥阶段为-48℃，将真空度降至0.28mbar，达到最终真空度时间为12h；二次升华干燥阶段为-48℃→0℃，真空度控制在0.28 mbar，达到最终温度时间为 12h；解析干燥阶段最终温度为27℃，真空度控制在0.011mbar，达到最终温度时间为 10h。

其中，步骤（4）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B12测试培养基及莱氏蔓士乳酸杆菌的微孔板用铝箔袋密封保存，并在其中放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。

进行维生素B12 定量检测实验时，取200μL维生素B12标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。

经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B12检测微孔板中固定化的干燥莱士蔓氏乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的93%。

实施例4

一种即用型维生素B12检测微孔板的制备方法及应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取130μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得B12测试培养基固定层；

（2）将抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，取50μL覆盖在已冷冻固定的B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定1h，获得B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层；

（3）将已活化的莱氏蔓士乳酸杆菌分散于凝胶保护剂中，菌悬液透光率控制在50%范围内，取3μL菌悬液黏附于微孔中并固定化干燥；

（4）维生素B12检测微孔板包装及贮存。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基，1L维生素B12测试培养基含：无维生素酸水解酪蛋白24.0 g，无水D-葡萄糖80.0 g，无水乙酸钠40.0 g， L-胱氨酸0.4 g，DL-色氨酸0.4g，腺嘌呤40.0 mg，鸟嘌呤40.0 mg，尿嘧啶40.0 mg，黄嘌呤2.0 mg，核黄素4.0 mg，盐酸硫胺素4.0 mg，生物素20.0 μg，烟酸4.0 mg，对氨基苯甲酸400.0 μg，泛酸钙400.0 μg，叶酸200.0 μg，磷酸二氢钾2.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，硫酸镁0.8 g，氯化钠40.0 mg，硫酸亚铁40.0 mg，硫酸锰40.0 mg，聚山梨糖单油酸酯（吐温80）4.0 g，溶解于去离子水或蒸馏水中，使用微波炉或电热炉加热助溶完全后，通过高压灭菌锅121℃灭菌5min，并及时水浴冷却（以防加热过度），获得维生素B12测试培养基。

其中，步骤（1）（2）所述的塑形填充剂组分包括：5wt%右旋糖酐5000、10wt%聚乙二醇4000及0.5wt%α-环状糊精，余量为水，塑形填充剂使用高压灭菌锅121℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（1）所述的维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，混合体积比为3：1。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液组分包括：5wt%聚乙烯吡咯烷酮20k、1.2wt%维生素E、1.5wt%抗坏血酸钠及0.05wt%谷胱甘肽，余量为水，抗氧化阻隔液使用孔径为0.45μm的无菌滤膜过滤除菌备用，为了达到有效过滤，应事先将滤膜用无菌水润湿。

其中，步骤（2）所述的抗氧化阻隔液与塑形填充剂充分混合，混合体积比为2：1。

其中，步骤（3）所述的凝胶保护剂组分包括：4wt%甘露醇、0.2M氯化镁、3wt%牛奶酪蛋白及0.1wt%瓜尔卡拉胶，余量为水，凝胶保护剂使用高压灭菌锅121℃灭菌10min后迅速水浴冷却备用。

其中，步骤（3）所述的菌种活化方式，将莱氏蔓士乳酸杆菌菌珠加入5mL维生素B12测试培养基中，再加入0.15ng/mL维生素B12标准溶液5mL，活化温度40℃，活化时间为18h。

其中，步骤（3）所述的固定化干燥，冻干程序为：预冻阶段为 -80℃，保持1h；一次升华干燥阶段为-60℃，将真空度降至0.32mbar，达到最终真空度时间为12h；二次升华干燥阶段为-60℃→0℃，真空度控制在0.32 mbar，达到最终温度时间为 12h；解析干燥阶段最终温度为27℃，真空度控制在0.011mbar，达到最终温度时间为 10h。

其中，步骤（4）所述的微孔板包装及贮存，将已固定维生素B12测试培养基及莱氏蔓士乳酸杆菌的微孔板用铝箔袋密封保存，并在其中放置无菌干燥剂及抗氧剂，置于≤8℃环境下贮存。

进行维生素B12 定量检测实验时，取390μL维生素B12标准曲线溶液或样品提取液加入至微孔中，置于37℃恒温培养箱内避光培养，即完成实验操作。

经活菌计数，上述方法制备的即用型维生素B12检测微孔板中固定化的干燥莱士蔓氏乳酸杆菌活性菌种数，为所添加菌液中菌种总数的93%。

对比例1

该对比例与实施例1相比，缺少塑形填充剂及抗氧化阻隔液的使用，直接取76μL分装入微孔中，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B12测试培养基固定层，无抗氧化阻隔层的固定，其余条件与实施例1相同。

对比例2

该对比例与实施例1相比，缺少步骤（2）的抗氧化阻隔层，将维生素B12测试培养基与塑形填充剂充分混合，取95μL分装入微孔中，确保溶液体积浸满微孔底部，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B12测试培养基固定层，无抗氧化阻隔层的固定，其余条件与实施例1相同。

对比例3

该对比例与实施例1相比，缺少塑形填充剂的使用。取76μL维生素B12测试培养基分装入微孔中，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B12测试培养基固定层。取24μL抗氧化阻隔液覆盖在已冷冻固定的维生素B12测试培养基表面上，确保溶液体积足够完全覆盖培养基固定层，再置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定2h，获得维生素B12测试培养基固定层与抗氧化阻隔层，其余条件与实施例1相同。

对比例4

该对比例与实施例1相比，不同在于步骤（1）（2）所述的培养基固定化，将维生素B12测试培养基、塑形填充剂与抗氧化阻隔液按38:24:30的体积比混合均匀后，取150μL分装入微孔中，并置于-80℃无菌冷冻设备中迅速冷冻固定4h，获得维生素B12测试培养基固定层，其余条件与实施例1相同。

对比例5

该对比例与实施例1相比，无培养基固定层及抗氧化阻隔层，仅仅将5μL莱士蔓氏乳酸杆菌菌悬液固定化于微孔板中，缺少步骤（1）和步骤（2）的实施，其余条件与实施例1相同。

将依照实施例1-4与对比例1-4制备的维生素B12检测微孔板进行测试，对其结构稳定性、颜色变化、复溶性、培养基成分损失率进行比较，其测试方法为：

（1）固定化培养基结构稳定性

对实施例1-4及对比例1-4制备的维生素B12检测微孔板进行培养基冻干结构分析，考察冻干培养基形状、有无喷瓶、有无塌陷、有无吸潮等主要指标。

（2）固定化培养基颜色变化的测定

将实施例1-4及对比例1-4制备的维生素B12检测微孔板用铝箔袋密封，并置于37℃、50±10%RH的环境下放置7天后，观察培养基有无发生褐变。

（3）固定化培养基复溶性

对实施例1-4及对比例1-4制备的维生素B12检测微孔板，使用移液枪移取300μL 的25~30℃水至微孔中，吹打10~15次后观察溶解情况。

（4）固定化培养基成分损失率的测定

将实施例1及对比例1-5制备的微孔板用铝箔袋密封，并置于37℃、50±10%RH的环境下放置7天。于实施例1-2及对比例1-4制备的维生素B12检测微孔中，加入300μL的0.09ng/mL维生素B12标准溶液；于实施例3制备的维生素B12检测微孔中，加入200μL的0.09ng/mL维生素B12标准溶液；于实施例4制备的维生素B12检测微孔中，加入390μL的0.09ng/mL维生素B12标准溶液；于对比例5制备的干燥莱士蔓氏乳酸杆菌微孔中，加入150μL的现配1倍维生素B12测试培养基，再加入150μL的0.18 ng/mL维生素B12标准溶液，均置于37℃恒温温箱培养48h后，计算固定化测试培养基成分损失率。

固定化培养基成分损失率=（现配培养基培养OD值-实验例培养OD值）/现配培养基培养OD值×100%。

以上实施例及对比例制备的维生素B12检测微孔板评价结果如下表1所示：

由上表1可见，本发明使用塑形填充剂、抗氧化阻隔剂及分层冻干方式固定化维生素B12测试培养基，固定化培养基成分损失率均<5%，相比于对比例1-4，在培养基冻干结构及成分的稳定性方面具有突出的优势。

即用型维生素B12检测微孔板精密度测定

实施例1-4制备的即用型维生素B12检测微孔板检测0.015、0.045、0.09ng/mL维生素B12标准品，对6个平行微孔进行检测，结果如下表2所示：

由上表2可见，本申请实施例1-4制备的即用型维生素B12检测微孔板，6个平行孔间的变异系数均＜5%，表明微孔板孔间精密度高。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种即用型维生素B12检测载体及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。