用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途
阅读说明：本技术 用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途 (Method for producing algal-derived agarotriose and use thereof as probiotic ) 是由 金京宪 陈勇秀 尹银珠 金东玄 俞素萝 赵庆纹 朴娜庭 于 2018-11-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途。更具体来说,本发明研究作为益生菌的琼胶三糖的特性,其通过益生菌微生物选择性地代谢,从而使琼胶三糖能够在食品和药品领域中用作抗癌剂或抗炎剂,并且使琼胶三糖能够在红藻衍生的多糖在未经预处理的情况下酶水解之后以最小损失经由高效纯化以高产率获得。(The present invention relates to a method for producing algal derived agarotriose and its use as probiotic. More specifically, the present invention studies the properties of agarotriose as a probiotic, which is selectively metabolized by probiotic microorganisms, thereby enabling agarotriose to be used as an anticancer agent or an anti-inflammatory agent in the fields of foods and pharmaceuticals, and enabling agarotriose to be obtained in high yield via high-efficiency purification with minimal loss after enzymatic hydrolysis of red algae-derived polysaccharides without pretreatment.)
技术领域
本发明涉及一种用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途。
背景技术
益生菌(Prebiotics)是指由肠道有益菌选择性地发酵以改善肠道菌群且有益于人体健康的物质。虽然最近已经报道了关于人类疾病与肠道菌群之间的相关性的研究，但已将肠道菌群认为是第二人类基因组，从而使得本领域中的研究已经迅速发展。特定来说，由于有研究结果报道，随着肠道有益菌群分布的增加，肥胖症、糖尿病和免疫功能得到改善，因此关于肠道菌群的研究已获得更多关注。
已经由动物实验预测了作为构成红藻的主要多糖的琼脂糖的水解产物的益生菌效果。作为向患有因高脂饮食诱发的肥胖症的大鼠口服投与琼胶寡糖混合物的结果，确认作为肠道有益菌的双歧杆菌的分布程度增加。此外，琼胶寡糖混合物促进肠道低分子量脂肪酸的合成，且诱导免疫和抗炎功能相关基因的表达。另外，确认在通过两种类型的内切型β-琼胶酶酶促反应从琼脂糖产生新琼寡糖混合物的情况下，双歧杆菌和乳酸杆菌在新琼寡糖混合物的碳源条件下生长。然而，在此实验中，由于双歧杆菌和乳酸杆菌的生长测试不是在缺少新琼寡糖混合物作为对照的条件下进行的，因此存在如下问题：无法确切地知道生长是由培养基中的其它碳源引起的还是由新琼寡糖的代谢引起的。另外，确认当向大鼠模型投与新琼寡糖混合物时，双歧杆菌和乳酸杆菌的分布程度增加。
如先前所描述，到目前为止，由于红藻衍生的寡糖的益生菌功能性研究已经使用了混合物而不是纯化的标准物质，因此根本不知道哪些有效指标成分会在实际上具有益生菌活性的同时在肠道菌群中产生变化。此外，不知道琼脂糖衍生的寡糖如何通过肠道有效益生菌微生物代谢。
同时，构成红藻的主要多糖是琼脂糖，且琼脂糖是3，6-脱水-L-半乳糖(在下文中称为‘3，6-AHG’)和D-半乳糖(在下文中称为‘D-Gal’)经由α-1，3-键和β-1，4-键交替地连接在一起的聚合物。先前的研究建立了用于产生具有抗龋、抗炎、美白和保湿功能的AHG的工艺。通过使用弱酸、乙酸或低浓度中性缓冲液、Tris-HCl缓冲液(pH7.4)预处理底物来获得琼胶寡糖(agarooligosaccharides)，且经由外切型β-琼胶酶II酶(exo-type β-agaraseII)促反应从琼胶寡糖中产生新琼二糖(neoagarobiose)。在这种情况下，存在如下缺点：琼胶三糖(agarotriose)也作为副产物产生，且为了将琼胶三糖降解成单糖AHG和半乳糖，需要引入一种称为琼胶降解β-半乳糖苷酶(agarolytic β-galactosidase，ABG)的额外酶。然而，经由各种文献，目前已知作为在先前研究中被视为用于产生AHG的副产物的寡糖的呈Gal-AHG-Gal形式的琼胶三糖，以促进身体的肠道功能中的有益菌且本身具有益生菌效果，但用于获得纯化的和纯的琼胶三糖的详细工艺技术在国内是未知的。
发明内容
技术问题
本发明的目的是通过研究肠道有效益生菌微生物对琼胶三糖的代谢来提供琼胶三糖作为药品或食品物质的用途。
本发明的另一目的是提供一种用于通过酶水解和纯化来制备琼胶三糖的方法。
技术解决方法
为了实现所述目的，本发明提供一种药品组合物，包含：由琼脂、琼脂糖、新琼六糖和琼胶三糖组成的群组中选出的一种或多种底物；平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株；以及双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株。
本发明还提供一种用于治疗癌症或炎性疾病的方法，所述方法包含：向个体投与治疗有效量的药品组合物。
本发明还提供一种食品组合物，包含：由琼脂、琼脂糖、新琼六糖和琼胶三糖组成的群组中选出的一种或多种底物；平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株；以及双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株。
本发明还提供一种用于制备琼胶三糖的方法，所述方法包含：使反应产物与SEQID NO：2或6的新琼二糖水解酶反应，其中所述反应产物通过使琼脂、琼脂糖或新琼六糖中的任何一种底物与SEQ ID NO：1或5的β-琼胶酶反应来获得；以及经由尺寸排阻柱从所得产物中纯化琼胶三糖。
有利效应
本发明具有如下效果：本发明可通过研究作为益生菌的琼胶三糖的特性来在药品和食品领域中用作抗癌或抗炎物质，所述益生菌通过例如拟杆菌和双歧杆菌的益生菌微生物选择性地代谢。
另外，本发明具有使琼胶三糖能够在红藻衍生的多糖在未经预处理的情况下酶水解之后以最小损失经由高效纯化以高产率获得的效果。
附图说明
图1示出用于经由酶促反应从琼脂糖中产生具有不同聚合度的寡糖、新琼二糖和AHG的示意性视图。
图2示出纯化多糖降解菌(S.degradans)2-40T衍生的内切型β-琼胶酶Aga16B、外切型β-琼胶酶Aga50D和α-新琼二糖水解酶SdNABH的重组蛋白的结果(A)、经由酶促反应从琼脂糖中产生具有不同聚合度的寡糖、新琼二糖和3，6-AHG的结果(B)，以及经由琼脂糖与平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)与新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的酶反应产物的尺寸排阻色谱来纯化糖的结果(C)。
图3示出在大肠杆菌中表达之后纯化肠道微生物平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)DSM17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)和BpGH50(BACPLE_01683)和新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的每一重组酶的结果(A)和进行酶促反应实验的结果(B)。
图4示出经由平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)与来自琼脂糖底物的新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的酶促反应来产生琼胶三糖和AHG的结果。
图5示出使用生物栅C(A：AHG、B：NeoDP2、C：AgaDP3、D：NeoDP4、E：AgaDP5、F：NeoDP6、G：葡萄糖、H：半乳糖、I：2FL)培养作为具有相应纯化的糖作为碳源的益生菌微生物的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697菌株的结果。
图6示出分析长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC15697菌株的琼胶三糖发酵曲线的结果(A：将AgaDP3、NeoDP2和半乳糖用作底物的结果；B：细胞密度和作为底物的乙酸和乳酸)。
图7示出使用长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697菌株的粗酶溶液的琼胶三糖(A)和新琼二糖(B)的降解实验结果。
图8示出在克隆长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697菌株的四个β-半乳糖苷酶编码基因(Blon_2016、Blon_2123、Blon_2334和Blon_2416)并且从大肠杆菌中产生和纯化重组蛋白之后进行酶促反应的结果(A：凝胶照片；B：TLC结果；C：琼胶三糖底物的相应酶的β-半乳糖苷酶比活性)。
图9示出作为属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)(A：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 17930；B：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC15702)的其它菌株的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC 17930和长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC15702菌株对琼胶三糖的发酵能力的实验结果。
图10示出两歧双歧杆菌(B.bifidum)DSM20082和柏之叶双歧杆菌(B.kashiwanohense)DSM21854菌株对琼胶三糖的发酵能力的实验结果(A：两歧双歧杆菌(B.bifidum)DSM20082；B：柏之叶双歧杆菌(B.kashiwanohense)DSM 21854)。
图11示出琼胶三糖对人工胃液的稳定性测试结果(A：将TLC结果示出为图表；B：HPLC结果)。
图12示出肠道微生物平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135和长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697对琼脂糖的代谢途径。
图13示出从琼脂糖中产生和分离琼胶三糖的工艺的示意性视图(A：经由酸处理和酶糖化产生琼胶三糖的工艺；B：经由酶糖化产生和纯化AHG、D-Gal和琼胶三糖的工艺)。
图14示出经由两步酶促反应从琼脂糖中产生琼胶三糖和使用尺寸排阻柱纯化琼胶三糖的结果(A：TLC结果；B：HPLC结果)。
图15是示出经由平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)的酶促反应从琼脂糖中产生的新琼四糖与新琼二糖的比率的HPLC定量分析结果。
图16示出使用尺寸排阻柱来分析每一部分的分离程度的差异的TLC结果。
图17示出使用HPLC KS-802糖柱来测量琼胶三糖的产率和纯度的结果。
具体实施方式
本发明的发明人通过经由内切型β型琼胶酶和新琼二糖水解酶反应从作为构成红藻的主要碳水化合物的琼脂糖中产生琼胶三糖，使用尺寸排阻色谱(size-exclusionchromatography)技术仅纯分离和纯化酶促反应产物当中的琼胶三糖，并且测试益生菌双歧杆菌对琼胶三糖的发酵能力来证明琼胶三糖的益生菌效果。另外，由于通过双歧杆菌对琼胶三糖的发酵所产生的新琼二糖可由来自作为肠道微生物的平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)的新琼二糖水解酶降解成半乳糖和3，6-AHG，且AHG是具有结肠癌预防和抗炎效果的生物活性物质，因此确认了琼胶三糖不仅可预期具有益生菌活性，而且还可预期具有例如经由肠道微生物的代谢的抗癌和抗炎的生物活性。
因此，本发明提供一种药品组合物，包含：由琼脂、琼脂糖、新琼六糖和琼胶三糖组成的群组中选出的一种或多种底物；平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株；以及双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株。
平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株可包含平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)DSM 17135菌株。
双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株可包含长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC 17930、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15702、两歧双歧杆菌(B.bifidum)DSM 20082、柏之叶双歧杆菌(B.kashiwanohense)DSM 21854等。
本发明的药品组合物的特征在于通过平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株和双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株将底物最终降解成3，6-AHG。
更具体来说，3，6-AHG通过分别源自平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)DSM17135菌株的SEQ ID NO：1的β-琼胶酶(beta-agarase)和SEQ ID NO：2的新琼二糖水解酶(neo-agarobiose hydrolase)以及源自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697菌株的SEQ ID NO：3或4的β-半乳糖苷酶(beta-galactosidase)而从底物中降解。
β-琼胶酶是源自平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135的酶，且将琼脂、琼脂糖或新琼六糖用作底物，以将底物降解成新琼四糖和新琼二糖，且可由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示。
β-琼胶酶不仅可经由在酶的编码区之前和之后的区而且还可经由DNA片段来进行转录和转化，所述片段与包含个别编码片段之间的中间序列的多肽的产生相关联。另外，作为具有酶的取代、缺失、转座、添加等中的一个或多个的变体蛋白质的具有琼脂、琼脂糖或新琼六糖的水解活性蛋白质也包含在本发明的酶的范围中，并且优选地包含与SEQ ID NO：1中所列举的氨基酸序列具有80％或超过80％、85％或超过85％、90％或超过90％、93％或超过93％、94％或超过94％、95％或超过95％、96％或超过96％、97％或超过97％、98％或超过98％和99％或超过99％的序列一致性的氨基酸序列。
β-琼胶酶可从平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135培养物的上清液中分离与纯化，且可使用基因工程重组技术、人工化学合成方法等从除平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135之外的菌株中产生和分离。当使用基因工程重组技术时，所述β-琼胶酶可由转化的大肠杆菌的培养物产物的上清液或上清液流体替代，但技术不特别限于此。根据具体示范性实施例，β-琼胶酶可从用包含对β-琼胶酶进行编码的基因的核酸序列的重组载体转化的大肠杆菌或其培养物中获得。
新琼二糖水解酶是源自平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135的酶，且将新琼四糖或新琼二糖用作底物，以将底物降解成琼胶三糖、半乳糖或3，6-脱水-L-半乳糖，且可由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示。
新琼二糖水解酶不仅可经由在新琼二糖水解酶的编码区之前和之后的区而且还可经由DNA片段来进行转录和转化，所述片段与包含个别编码片段之间的中间序列的多肽的产生相关联。另外，作为具有酶的取代、缺失、转座、添加等中的一个或多个的变体蛋白质的具有琼脂、琼脂糖或新琼六糖的水解活性的蛋白质也包含在本发明的酶的范围中，并且优选地包含与SEQ ID NO：2中所公开的氨基酸序列具有80％或超过80％、85％或超过85％、90％或超过90％、93％或超过93％、94％或超过94％、95％或超过95％、96％或超过96％、97％或超过97％、98％或超过98％和99％或超过99％的序列一致性的氨基酸序列。
新琼二糖水解酶可从平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135培养物的上清液中分离与纯化，且可使用基因工程重组技术、人工化学合成方法等从除平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135之外的菌株中产生和分离。当使用基因工程重组技术时，所述新琼二糖水解酶可由转化的大肠杆菌的培养物产物的上清液或上清液流体替代，但技术不特别限于此。根据具体示范性实施例，新琼二糖水解酶可从用包含对新琼二糖水解酶进行编码的基因的核酸序列的重组载体转化的大肠杆菌或其培养物中获得。
β-半乳糖苷酶是源自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC15697且将琼胶三糖降解成新琼二糖和半乳糖的酶，是从Blon_2016、Blon_2334基因中产生的蛋白质，且可由SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列表示。
β-半乳糖苷酶不仅可经由在酶的编码区之前及之后的区而且还可经由DNA片段来进行转录和转化，所述片段与包含个别编码片段之间的中间序列的多肽的产生相关联。另外，作为具有酶的取代、缺失、转座、添加等中的一个或多个的蛋白质变体的具有琼胶三糖的水解活性的蛋白质也包含在本发明的酶的范围中，并且优选地包含与SEQ ID NO：3或4中所公开的氨基酸序列具有80％或超过80％、85％或超过85％、90％或超过90％、93％或超过93％、94％或超过94％、95％或超过95％、96％或超过96％、97％或超过97％、98％或超过98％和99％或超过99％的序列一致性的氨基酸序列。
β-半乳糖苷酶可从长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697培养物的上清液中分离与纯化，且可使用基因工程重组技术、人工化学合成方法等从除长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697之外的菌株中产生和分离。当使用基因工程重组技术时，所述β-半乳糖苷酶可由转化的大肠杆菌的培养物产物的上清液或上清液流体替代，但技术不特别限于此。根据具体示范性实施例，β-琼胶酶可从用包含对β-琼胶酶进行编码的基因的核酸序列的重组载体转化的大肠杆菌或其培养物中获得。
在本说明书中，“蛋白质”和“多肽”可互换地使用。
在本发明中，多肽与另一序列具有具体比例的序列一致性(例如80％、85％、90％、95％或99％)的事实意味着当两个序列进行比对时，氨基酸残基在比较序列时的比例彼此相同。比对和百分比同源性或一致性可通过使用本领域中公开已知的任何合适的软件程序中所描述的那些文献(例如，文献[现代分子生物学实验指南[CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(F.M.奥斯贝等人(版)，1987年，增刊30第7.7.18节)]来确定。优选程序的实例包含：GCG累积程序、FASTA(皮尔逊等人，1988年美国科学院院刊85：2444-2448)和BLAST(BLAST手册，阿特舒尔等人，美国国立生物技术信息中心，国立医学图书馆(NCIB NLMNIH)，马里兰州，贝塞斯达，阿特舒尔等人，1997年，NAR25：33893402)。另一优选比对程序是ALIGNPlus(科学和教育软件，PA)，并且优选地是使用基本参数的比对程序。另一可获得的序列软件程序是序列软件包6.0版(遗传学计算机组，威斯康星州麦迪逊，威斯康星大学)中可获得的TFASTA数据搜索程序。
如本文中所使用，术语“重组”在与细胞、核酸、蛋白质或载体结合使用时指示细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或改变原始核酸或蛋白质进行了改性，或指示细胞源自由此改性的细胞。也就是说，例如，重组细胞表达未在原始(非重组)形式的细胞内发现的基因，或替代地，重组细胞表达在表达时异常地表达或根本未表达的原始基因。
在本说明书中，“核酸”涵盖单链或双链DNA和RNA以及其化学变体。“核酸”和“多核苷酸”在本申请案中可互换地使用。由于遗传密码简并，因此可使用一个或多个密码子，以便对具体氨基酸进行编码，且本发明涵盖对具体氨基酸序列进行编码的多核苷酸。
将核酸序列***到细胞中的术语“引入”是指“转染(transfection)”或“转化”或“转换(transduction)”，且包含将核酸序列整合到真核细胞或原核细胞中的参考，且在这种情况下，核酸序列整合到细胞的基因组(例如染色体、质体、色素体或线粒体DNA)中，且由此转化为自主复制子或被瞬时表达。
本发明的药品组合物将琼脂、琼脂糖、新琼六糖或琼胶三糖代谢成具有抗炎和抗癌活性的3，6-AHG，且由此可用于预防或治疗癌症或炎性疾病。
如本文中所使用，术语“预防”是指通过向个体投与本发明的药品组合物来抑制或延缓癌症或炎性疾病的发病的所有动作。
如本文中所使用，术语“治疗”是指通过向个体投与本发明的药品组合物来改善或有益地改变癌症或炎性疾病的症状的所有动作。
如本文中所使用，‘有效量’是指能够显现抗癌效果或抑制炎症的化合物的量。
癌症可以是结肠癌、***、乳癌、胃癌、肝癌等。
如本文中所使用，‘抗炎效果’或‘抗炎活性’是指对炎症的抑制，且炎症是活体组织对某一刺激的防御反应中的一个，并且是指涉及三种情况的复杂损伤：组织退化、循环障碍和渗出和组织增生。更具体来说，炎症是先天免疫的一部分，且人类先天免疫识别病原体中具体存在的细胞表面图案。吞噬细胞将具有这种表面的细胞识别为异物并攻击病原体。如果病原体突破身体的物理屏障，那么就会出现炎性反应。炎性反应是为已经侵入伤口部位的微生物形成不利环境的非特异性防御动作。在炎性反应中，当伤口出现或外部致病源进入身体时，在初始阶段负责免疫反应的白细胞聚集并且表达细胞因子。因此，胞内细胞因子的表达水平是炎性反应激活的指标。
炎性疾病包含例如水肿的一般炎性症状，且可包含炎性肠病、腹膜炎、骨髓炎、蜂窝组织炎、胰脏炎、创伤性休克、支气管性哮喘、过敏性鼻炎、囊性纤维化、急性支气管炎、慢性支气管炎、急性毛细支气管炎、慢性毛细支气管炎、骨关节炎、痛风、脊柱关节病、强直性脊柱炎、赖特尔综合征、牛皮癣性关节病、肠病性脊柱炎、青少年关节病、青少年强直性脊柱炎、反应性关节病、感染性关节炎、感染后关节炎、淋病性关节炎、结核性关节炎、病毒性关节炎、真菌性关节炎、梅毒性关节炎、莱姆病、与‘血管炎综合征’相关联的关节炎、结节性多动脉炎、过敏性血管炎、葛雷克氏肉芽肿病、风湿性多肌痛、关节软骨细胞动脉炎、钙结晶沉积性关节病、假性痛风、非关节性风湿病、滑囊炎、腱鞘炎、上髁炎(网球肘)、神经性关节病(neuropathic ioint disease；或称为‘夏科氏关节病’)、关节血肿(hemarthrosic)、过敏性紫癜、肥大性骨关节病、多中心性网状组织细胞增生症、脊柱侧凸(scoliosis)、血色沉着病、血红蛋白病、高脂蛋白血症、低丙球蛋白血症、家族性地中海热(familialMediterranean fever)、***、全身性红斑狼疮、回归热、多发性硬化、败血症、败血性休克、急性呼吸窘迫综合征、多器官功能障碍综合征、慢性阻塞性肺病(chronicobstructive pulmonary disease)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、急性肺损伤(acute lung injury)、支气管肺发育不良(broncho-pulmonary dysplasia)、2型糖尿病、动脉硬化、阿尔茨海默型老年痴呆、家族性寒冷型自身炎症性综合征(familial coldautoinflammatory syndrome)、穆-韦综合征(Muckle-Wells syndrome)、新生儿多系统炎性疾病(neonatal mutisystem inflammatory disease)、慢性婴儿神经性皮肤关节综合征(chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome)、成人斯蒂尔病(adult-onset Still′s disease)、接触性皮炎、***(hydatidiform mole)、PAPA综合征、坏疽性脓皮病和痤疮(syndrome of pyogenic arthritis，pyoderma gangrenosum，andacne)、高免疫球蛋白D综合征(hyperimmunoglobulin d syndrome)、隐热蛋白相关周期性综合征(cryopyrin-associated periodic syndrome)等。
本发明的药品组合物可还包含药学上可接受的载剂。
药学上可接受的载剂包含通常在医学领域中使用的载剂和媒介物，且其具体实例包含离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清蛋白)、缓冲液物质(例如各种磷酸、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和的植物脂肪酸的部分甘油酯混合物)、水、盐或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐)、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类底物、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚芳酯、蜡、聚乙二醇、毛料等，但不限于此。
此外，除了前述成分之外，本发明的药品组合物还可另外包含润滑剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。
作为一个方面，本发明的药品组合物可以适用于口服或非肠道投与的各种剂型配制和使用。
用于口服投与的制剂的非限制性实例包含糖锭剂(troches)、锭剂(lozenge)、片剂、水悬浮液、油悬浮液、制备的粉末、颗粒剂、乳剂、硬胶囊、软胶囊、糖浆剂、酏剂等。
为了配制用于口服投与的本发明的药品组合物，可使用粘合剂，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、胶淀粉(Amylopectin)、纤维素(Cellulose)或明胶(Gelatin)；赋形剂，例如磷酸二钙(Dicalciumphosphate)；崩解剂，例如玉米淀粉或甘薯淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁(Magnesium stearate)、硬脂酸钙(Calcium stearate)、硬脂酰富马酸钠(Sodiumstearyl fumarate)或聚乙二醇蜡(Polyethylene glycol wax)等，且还可使用甜味剂、芳香剂、糖浆剂等。
此外，在胶囊的情况下，除了上述物质之外，还可进一步使用例如脂肪油的液体载剂。
用于非肠道投与的制剂的非限制性实例包含注射剂、栓剂、呼吸吸入粉、气溶胶喷雾、口腔喷雾剂、口腔清洁剂、牙膏、软膏、涂敷粉末、油、乳膏等。
为了配制用于非肠道投与的本发明的药品组合物，可使用无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂、外用药剂等，且作为非水溶剂和悬浮液，可使用丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油、例如油酸乙酯的可注射酯等。
此外，更具体来说，当将本发明的药品组合物配制成注射剂时，可将本发明的药品组合物与稳定剂或缓冲液在水中混合，以制备成溶液或悬浮液，然后将其配制成例如安瓿(ampoule)或小瓶(vial)的单位剂型。此外，当将本发明的药品组合物配制成气溶胶时，可将喷射剂等与添加剂混合以使水分散型浓缩物或湿粉末分散。
此外，当将本发明的药品组合物配制成软膏、乳膏等时，可使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌等作为载剂来配制药品组合物。
本发明的药品组合物的药学上有效的量和有效剂量可根据配制方法、投与模式、投与方案和/或投与途径等而变化，且可根据包含要经由本发明的药品组合物的投与实现的反应的类型和程度、组合物所投与至的个体的类型、年龄、体重和一般健康状况、疾病的症状或严重程度、性别、饮食、***、在对应个体中同时或在不同时间使用的药物、其它组合物的成分等的各种因素和医学领域中所熟知的类似因素而变化，且所需治疗的有效剂量可由本领域的普通技术人员容易地确定并开处方。本发明的药品组合物可每日投与一次或若干次。因此，剂量并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
本发明的药品组合物的投与途径和投与模式可彼此独立，投与方法不受特别限制，且投与途径和投与模式可遵循任意的投与途径和投与模式，只要所述投与途径和投与模式使药品组合物能够到达所靶向的对应部位即可。药品组合物可以口服或非肠道方式投与。
非肠道投与可使用例如静脉内投与、腹膜内投与、肌内投与、经皮投与、皮下投与等，还可使用用于将药品组合物施用或喷射到疾病部位上或吸入药品组合物的方法，但方法并不限于此。
本发明的药品组合物可优选地口服投与或通过注射投与。
本发明还提供一种用于治疗癌症或炎性疾病的方法，所述方法包含：向个体投与治疗有效量的药品组合物。
如本文中所使用，术语“个体”是指包含哺乳动物的所有动物，哺乳动物包含大鼠、牲畜、人类等。
在用于治疗本发明的癌症或炎性疾病的方法中，对药品组合物的剂量、投与途径、投与模式等的描述与上文关于药品组合物所描述的内容相同。另外，癌症或炎性疾病的类型也与上文关于药品组合物所描述的内容相同。
本发明还提供一种食品组合物，包含：由琼脂、琼脂糖、新琼六糖和琼胶三糖组成的群组中选出的一种或多种底物；平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)菌株；以及双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株。
可将食品组合物制备成通过胶囊化、粉化、悬浮液等制备的食品制剂。
由于食品剂型可每日服用，因此食品剂型可被预期预防或缓解癌症或炎性疾病且非常有用。
食品类型不受特别限制，且包含例如乳制品、典型意义上的健康食品等。
本发明还提供一种用于制备琼胶三糖的方法，所述方法包含：
使反应产物与SEQ ID NO：2或6的新琼二糖水解酶反应，其中所述反应产物通过使琼脂、琼脂糖或新琼六糖中的任何一种底物与SEQ ID NO：1或5的β-琼胶酶反应来获得；以及
经由尺寸排阻柱从所得产物中纯化琼胶三糖。
在常规工艺(图13的A)的情况下，其中酶水解在弱酸预处理之后进行，在中和工艺中产生大量的盐，且当使用低浓度中性缓冲液时，预处理反应需要在高温(170℃)下进行，从而使得需要高温和高压反应器。此外，琼胶三糖的制造产率因集中于提高3，6-AHG的制造产率而相当低，且特定来说，用于预处理的乙酸产生难闻的气味。由于这些原因，在将琼胶三糖用作益生菌物质时可能存在问题。因此，用于制备本发明的琼胶三糖的方法通过以下方法来解决上述问题。
首先，通过应用通常在琼胶三糖的产生期间产生作为琼胶三糖的前驱体的新琼四糖的β-琼胶酶来省略预处理工艺，且在温和条件下经由两步酶促反应(也就是说，内切型β-琼胶酶、新琼二糖水解酶)获得高产率的琼胶三糖、3，6-AHG和D-Gal。
其次，在琼胶三糖的纯化期间，经由使用聚合度的差异的尺寸排阻生物P2凝胶柱(Size exclusion Bio-P2 Gel column)，使用尺寸排阻色谱技术分离单糖和三糖，从而获得高纯度琼胶三糖(图13的B)。由于这种纯化工艺使用水作为流动相，而不使用对人体有害的有机溶剂，且在纯化工艺期间几乎没有琼胶三糖损失，因此所述纯化工艺得的优点是可获得纯化的高产率琼胶三糖。
β-琼胶酶将琼脂、琼脂糖或新琼六糖中的任何一种底物降解成新琼二糖和新琼四糖，所述新琼二糖和新琼四糖是新琼寡糖，可使用源自上述平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)DSM 17135菌株的SEQ ID NO：1的β-琼胶酶，或可使用SEQ ID NO：5的耐热琼胶酶，所述耐热琼胶酶将琼脂或琼脂糖用作底物，以将底物降解成新琼四糖和新琼六糖。
耐热琼胶酶可源自多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T，但不特别限于此。
耐热琼胶酶可从多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T培养物产物的上清液中分离和纯化，且可使用基因工程重组技术、人工化学合成方法等从除多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T之外的菌株中产生和分离。当使用基因工程重组技术时，所述耐热琼胶酶可由转化的大肠杆菌的培养物产物的上清液或上清液流体替代，但技术不特别限于此。
琼脂、琼脂糖或新琼六糖中的任何一种底物与β-琼胶酶的反应可在30℃到60℃的温度条件下以0rpm到200rpm进行5分钟到12小时。
新琼二糖水解酶将新琼二糖和新琼四糖降解成3，6-AHG、D-Gal和琼胶三糖，且可使用源自上述平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135的SEQ ID NO：2的新琼二糖水解酶，或可使用源自多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T的SEQ ID NO：6的α-新琼二糖水解酶。
多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T衍生的α-新琼二糖水解酶可从多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T的培养物产物的上清液或上清液流体中分离与纯化，且可使用基因工程重组技术、人工化学合成方法等从除多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T之外的菌株中产生和纯化。
β-琼胶酶的反应产物与新琼二糖水解酶的反应可在25℃到45℃的温度条件下以0rpm到200rpm进行30分钟到12小时。
在获得由新琼二糖水解酶产生的单糖3，6-AHG和D-Gal以及三糖琼胶三糖之后，可使用尺寸排阻柱来获得具有高纯度和高产率的纯化的琼胶三糖。
在下文中，将经由根据本发明的实例更详细地描述本发明，但本发明的范围不受下文中所提出的实例限制。
实施本发明的方式
<实例1>通过β-琼胶酶降解琼脂糖的实验
进行酶促反应以产生处于不同聚合度下的琼脂衍生的寡糖，包含来自作为构成红藻的主要碳水化合物的琼脂糖的琼胶三糖。首先，将1％(w/v)浓度的琼脂糖用作底物来进行Aga16B的酶促反应，所述Aga16B是多糖降解菌(S.degradans)2-40T衍生的内切型琼胶酶。在这种情况下，酶促反应在50℃和200rpm下进行2小时。
作为酶促反应的结果，产生新琼四糖(DP4)和新琼六糖(DP6)(图2的B)。
经由下一步酶、多糖降解菌(S.degradans)2-40T衍生的新琼二糖水解酶(SdNABH)和作为底物的反应产物的酶促反应来产生琼胶三糖(DP3)、琼胶五糖(DP5)和3，6-AHG。SdNABH酶促反应在30℃和200rpm下进行2小时。
另外，经由Aga50D、多糖降解菌(S.degradans)2-40T衍生的外切型琼胶酶和作为底物的Aga16B反应产物的酶促反应来产生二糖体新琼二糖(DP2)。Aga50D酶促反应在30℃和200rpm下进行2小时。
接下来，作为源自肠道微生物平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135的内切型β-琼胶酶的BpGH16A(BACPLE_01670)的酶促反应条件如下：酶加载量：每克琼脂糖8毫克的BpGH16A；缓冲液：20毫摩尔Tris-HCl(pH7.0)；以及反应温度和时间：40℃和2小时。
新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的酶促反应条件如下：酶加载量：每克新琼二糖4毫克的BpGH117；缓冲液：20毫摩尔Tris-HCl(pH7.0)；以及反应温度和时间：40℃和2小时。
如图2的C中所示出，可经由源自肠道微生物平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135的琼脂降解相关的酶的反应组合从琼脂糖中产生琼胶三糖和3，6-AHG。作为通过TLC(薄层色谱)分析反应产物的结果，经由BpGH16A(BACPLE_01670)酶促反应从琼脂糖底物(泳道1)中产生新琼四糖(DP4)作为主要产物(泳道2)。其后，经由BpGH117(BACPLE_01671)酶促反应产生琼胶三糖和3，6-AHG(泳道2)。即使在两个酶同时反应时，也主要以与在两个酶顺序地反应时相同的方式产生琼胶三糖和3，6-AHG(泳道3)。
<实例2>平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)和BpGH50(BACPLE_01683)与新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的重组和酶促反应实验
如图3中所示出，在平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的GH50家族酶BpGH50(BACPLE_01683)的情况下，未显现β-琼胶酶活性。
<实例3>经由平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)DSM 17135衍生的内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)与新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的酶促反应从琼脂糖底物中产生琼胶三糖和AHG的实验
通过尺寸排阻柱色谱来纯化经由相应纯化的重组酶Aga16B、Aga50D和SdNABH的反应产生的处于不同聚合度下的寡糖、新琼二糖和3，6-AHG。在这种情况下，将葡聚糖凝胶G-10用作尺寸排阻柱色谱的柱树脂。
如图4中所示出，经由内切型β-琼胶酶BpGH16A(BACPLE_01670)与新琼二糖水解酶BpGH117(BACPLE_01671)的反应从琼脂糖中产生琼胶三糖和3，6-AHG。
<实例4>通过使用生物栅C，采用相应纯化的糖作为碳源来培养益生菌微生物长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697菌株的实验
为了证明琼脂衍生的糖的益生菌效果，将包含琼胶三糖的每种纯化的糖用作单一碳源来监测作为双歧杆菌的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697菌株的细胞生长。在这种情况下，作为培养组合物，使用10克/升的细菌蛋白胨、5克/升的酵母提取物、2克/升的K2HPO4酸酐、5克/升的乙酸钠酸酐、2克/升的柠檬酸三元NH4、0.2克/升的七水合硫酸镁、0.05克/升的硫酸锰、1毫升/升的吐温80(聚山梨醇酯80)、0.5克/升的半胱氨酸和5克/升的每种纯化的糖，且在37℃下进行培养。
如图5中所示出，确认了长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697菌株仅选择性地发酵各种纯化的糖当中的琼胶三糖。
<实例5>长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC15697菌株的琼胶三糖发酵曲线的分析
为了监测发酵产物，在试管条件下培养长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC 15697菌株。
如图6中所示出，长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697在浓度为5克/升琼胶三糖的碳源下将琼胶三糖降解成半乳糖和新琼二糖，且半乳糖在细胞中发酵以产生乙酸。新琼二糖在细胞外分泌和积聚，而不再在细胞中降解。
<实例6>使用长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697菌株的粗酶溶液的琼胶三糖和新琼二糖的降解实验
为了确认琼胶三糖的代谢途径，对长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC 15697菌株的粗酶溶液进行实验。为此目的，通过使在琼胶三糖条件下培养的长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.infantis)ATCC15697的培养溶液离心(14,000rpm，5分钟，4℃)来分离细胞和培养基。通过对上清液进行硫酸铵沉淀来获得胞外粗酶。另外，对于包含胞内粗酶的无细胞提取物，通过使细胞重新悬浮在20毫摩尔Tris-HCl缓冲液中，然后通过超声处理使细胞裂解并且使裂解物离心来获得上清液粗酶。在粗酶实验期间，使用2毫克/毫升的粗酶和2毫克/毫升的琼胶三糖作为底物，来在30℃和200rpm的酶促反应条件下，在20毫摩尔Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中将进行反应2小时。
如图7中所示出，确认了在包含胞内粗酶的无细胞提取物中发生了将琼胶三糖降解成半乳糖和新琼二糖的β-半乳糖苷酶反应。此外，确认了未显现粗酶对新琼二糖的活性。
<实例7>长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC15697菌株的四个β-半乳糖苷酶编码基因(Blon_2016、Blon_2123、Blon_2334和Blon_2416)的重组蛋白产生和酶促反应实验
为了确认哪种酶基因具有降解琼胶三糖的活性，在克隆长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697的所有四个β-半乳糖苷酶之后，通过在大肠杆菌中过量表达四个β-半乳糖苷酶且纯化每一酶蛋白质来测试酶活性。
如图8中所示出，确认了两个酶基因Blon_2016和Blon_2334的蛋白质显现活性。
<实例8>属于长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的其它菌株对琼胶三糖的发酵能力的实验
为了确认琼胶三糖是否对除长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697菌株、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 17930、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.infantis)ATCC 15702、两歧双歧杆菌(B.bifidum)DSM 20082和柏之叶双歧杆菌(B.kashiwanohense)DSM 21854之外的益生菌微生物也具有益生菌效果，在琼胶三糖单一碳源条件下进行培养。
如图9和图10中所示出，所有的四个益生菌微生物以与长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)ATCC 15697相同的方式将琼胶三糖代谢且将琼胶三糖降解成半乳糖和新琼二糖，然后通过发酵半乳糖来产生乙酸。
<实例9>琼胶三糖对人工胃液的稳定性测试
为了测试琼胶三糖是否可在无需降解的情况下到达肠道，使琼胶三糖每次都在人工胃液中反应，然后使用TLC和HPLC来确认琼胶三糖是否降解。
如图11中所示出，确认在37℃下反应3小时之后，剩下80％或超过80％的琼胶三糖。
根据所述结果，首先确认了琼胶三糖是新型红藻衍生的益生菌和由益生菌选择性地发酵的物质。琼胶三糖可通过来自海洋衍生的多糖降解菌(S.degradans)2-40T或肠道微生物衍生的平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)的琼胶酶和NABH的酶促作用产生(图12)。琼胶三糖由益生菌双歧杆菌的ABC转运蛋白相关基因转运到细胞内，且由胞内β-半乳糖苷酶降解成半乳糖和新琼二糖，且半乳糖用于乙酸发酵。此外，新琼二糖可通过来自肠道微生物平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)的新琼二糖水解酶在肠道中降解成半乳糖和3，6-AHG。由于将AHG称为具有结肠癌预防效果和抗炎功能性的生物活性物质，因此琼胶三糖不仅可显现益生菌活性，而且还可因经由通过肠道微生物双歧杆菌和平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)代谢而产生的AHG而显现结肠癌预防和抗炎生物活性(图12)。
<实例10>产生BACPLE_01670和NABH重组酶
使用pET21a载体将平常拟杆菌(Bacteroides plebeius)衍生的β-琼胶酶水解酶BACPLE_01670基因引入到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中。为了预培养(pre-culture)引入基因的重组大肠杆菌，在50毫升锥形管中，在含有100微克/毫升的氨苄青霉素(ampicillin)的10毫升LB液体培养基中将重组大肠杆菌在37℃下培养9小时。其后，在将10毫升的预培养溶液接种于具有相同培养基组合物的1升的主培养溶液中之后，当光密度值(Optical density spectroscope)显示为生长到中期指数步骤(OD 0.4到0.6)时，向所述主培养溶液中加入0.1毫摩尔异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，且通过在16℃下诱导16小时来表达胞内蛋白质。其后，将细胞培养溶液转移到500毫升试管中，且在4℃下以10,000rpm使其离心30分钟，然后获得细胞。为了预防蛋白质变性，再次释放收集在30毫升的Tris缓冲液(20毫摩尔Tris-HCl，pH 7.0)中的细胞，且使用超声波仪(sonicator)使细胞裂解(cell lysis)。其后，在4℃下以16,000rpm使细胞离心1小时。使用HisTrap柱(5毫升，通用电气医疗集团)纯化蛋白质，然后使用SDS-PAGE凝胶来确认每种纯化的蛋白质的尺寸。使用脱盐柱去除用于蛋白质纯化的盐(咪唑)。通过BCA分析方法来量化盐被去除的重组蛋白的浓度。
接下来，使用pET21a载体将多糖降解菌(Saccharophagus degradans)2-40T衍生的α-新琼二糖水解酶NABH基因引入到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，且如上文所描述一般制备重组蛋白。
<实例11>BACPLE_01670与NABH的酶促反应
在BACPLE_01670酶促反应期间，将1％(w/v)浓度琼脂糖用作底物，且在50℃和100rpm的条件下，在20毫摩尔Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中进行反应10小时。
将BACPLE_01670酶促反应产物新琼四糖和新琼二糖用作底物来进行NABH酶促反应，且在37℃和100rpm的条件下进行酶促反应10小时。
通过TLC分析每一步骤中的酶促反应之后的反应产物。对于TLC分析条件，将1微升的酶促反应产物加载到硅胶板上作为固定相，将呈3∶1∶1(v/v/v)的正丁醇：乙醇：水作为流动相溶剂洗脱1小时，然后使用乙醇中的10％的硫酸和乙醇中的0.2％的1，3-二羟基萘使其显色。
如图14的A中所示出，琼脂糖经由内切型β-琼胶酶BACPLE_01670的酶促反应降解成新琼寡糖，且在这种情况下，主要产物是对应于作为聚合度(degree ofpolymerization，DP)的DP2和DP4的新琼二糖和新琼四糖。其后，经由α-琼胶酶新琼二糖水解酶(NABH)的酶促反应，从DP4中产生三糖琼胶三糖和3，6-AHG，且从DP2中产生D-半乳糖和3，6-AHG。
<实例12>BACPLE_01670酶促反应产物的HPLC分析
在BACPLE_01670酶促反应期间产生的物质是新琼四糖(DP4)和新琼二糖(DP2)(图14的B)。其中，制造琼胶三糖的前驱体是新琼四糖，且DP4产物越多，可获得的琼胶三糖越多。为了确定DP4相对BACPLE_01670的收率，使用HPLC KS-802尺寸排阻柱来计算收率。
如图15中所示出，关于BACPLE_01670的反应产物，获得了相对1克的琼脂糖得到0.795克的新琼四糖(每克琼脂糖0.795克新琼四糖)和0.205克的新琼二糖(每克琼脂糖0.205克新琼二糖)的结果。
<实例13>使用尺寸排阻柱(生物凝胶P2柱)分离DP3(琼胶三糖)和DP1(3，6-AHG，D-Gal)
从实例10和实例11中获得的最终反应产物是3，6-AHG和D-Gal以及琼胶三糖，且使用糖分离柱将其中的3，6-AHG和D-Gal与琼胶三糖分离。使用机器AKTAprime(通用电气医疗集团)。对于用于分离糖的流动相，通过使经过三次处理的蒸馏水(Distilled water)以0.3毫升/分钟的流动速率流动来将柱稳定10分钟，然后用2毫升埃彭道夫管转移在注射2毫升的反应产物之后流过柱的1毫升的溶液，并经由TLC进行分析。TLC分析条件与实例11中的那些条件相同。
如图16中所示出，可确认的是，作为通过TLC分析部分收集的样品的结果，分离DP3(琼胶三糖)和DP1(3，6-AHG，D-Gal)。
<实例14>通过酶糖化对琼脂糖中琼胶三糖的产率和纯度进行HPLC定量分析并通过尺寸排阻柱进行分离
在由TLC确认实例13中通过糖分离柱获得的琼胶三糖之后，收集具有高纯度的琼胶三糖的部分。将第55号到第61号部分收集在15毫升锥形管中，并且进行搅拌和充分混合。其后，经由HPLC KS-802柱，通过对7毫升的部分进行取样来分析产率和纯度。
如图17中所示出，确认了从1克的琼脂糖中获得0.4克的琼胶三糖(每克琼脂糖0.4克NAB)，且约90.2％的样品是琼胶三糖。
工业适用性
本发明可基于琼胶三糖的益生菌特性而在食品和药品领域中用作抗癌或抗炎剂。
<110> 高丽大学校产学协力团
<120> 琼胶三糖的产生方法和其作为益生菌的用途
<130> X18U13C0184
<150> KR10-2017-0153350
<151> 2017-11-16
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 316
<212> PRT
<213> 平常拟杆菌 DSM 17135
<400> 1
Met Lys Arg Lys Leu Phe Thr Ile Cys Leu Ala Ser Leu Gln Phe Ala
1 5 10 15
Cys Ala Ala Glu Asn Leu Asn Asn Lys Ser Tyr Glu Trp Asp Ile Tyr
20 25 30
Pro Val Pro Ala Asn Ala Gly Asp Gly Met Val Trp Lys Leu His Pro
35 40 45
Gln Ser Asp Asp Phe Asn Tyr Ile Ala Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys
50 55 60
Glu Phe Tyr Ala Lys Trp Thr Asp Phe Tyr His Asn His Trp Thr Gly
65 70 75 80
Pro Ala Pro Thr Ile Trp Gln Arg Asp His Val Ser Val Ser Asp Gly
85 90 95
Phe Leu Lys Ile Arg Ala Ser Arg Pro Glu Asp Val Pro Leu Lys Lys
100 105 110
Val Val Ser Gly Pro Asn Thr Lys Glu Leu Pro Gly Thr Tyr Thr Gly
115 120 125
Cys Ile Thr Ser Lys Thr Arg Val Lys Tyr Pro Val Tyr Val Glu Ala
130 135 140
Tyr Ala Lys Leu Ser Asn Ser Thr Met Ala Ser Asp Val Trp Met Leu
145 150 155 160
Ser Pro Asp Asp Thr Gln Glu Ile Asp Ile Ile Glu Ala Tyr Gly Gly
165 170 175
Asp Arg Asp Gly Gly Gly Tyr Gly Ala Asp Arg Leu His Leu Ser His
180 185 190
His Ile Phe Ile Arg Gln Pro Phe Lys Asp Tyr Gln Pro Lys Asp Ser
195 200 205
Gly Ser Trp Tyr Lys Asp Asp Lys Gly Thr Leu Trp Arg Asp Asp Phe
210 215 220
His Arg Val Gly Val Phe Trp Lys Asp Pro Phe Thr Leu Glu Tyr Tyr
225 230 235 240
Val Asp Gly Glu Leu Val Arg Thr Ile Ser Gly Lys Asp Ile Ile Asp
245 250 255
Pro Asn Asn Tyr Thr Gly Gly Thr Gly Leu Val Lys Asp Met Asp Ile
260 265 270
Ile Ile Asn Met Glu Asp Gln Ser Trp Arg Ala Val Lys Gly Leu Ser
275 280 285
Pro Thr Asp Glu Glu Leu Lys Asn Val Glu Asp His Thr Phe Leu Val
290 295 300
Asp Trp Ile Arg Val Tyr Thr Leu Val Pro Glu Glu
305 310 315
<210> 2
<211> 402
<212> PRT
<213> 平常拟杆菌 DSM 17135
<400> 2
Met Arg Lys Ile Ile Phe Ala Ala Gly Met Met Ser Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Cys Gly Asn Thr Gly Asn Thr Gln Thr Ile Ala Val Asp Asp Thr Gln
20 25 30
Asn Tyr Asp Glu Arg Lys Ala Asp Ser Leu Gly Ile Pro Lys Gly Asn
35 40 45
Lys Leu Ser Ala Ala Met Lys Arg Ala Met Lys Trp Glu Asn His Asp
50 55 60
Asn Lys Trp Phe Phe Glu Tyr Lys Met Glu Pro Leu Lys Gly Asp Leu
65 70 75 80
Ala Tyr Glu Glu Gly Val Val Arg Arg Asp Pro Ser Ala Met Leu Lys
85 90 95
Ile Gly Asp Thr Tyr Tyr Val Trp Tyr Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Thr
100 105 110
Gln Gly Phe Ala Gly Asp Ile Glu Lys Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp
115 120 125
Arg Cys Asp Ile Trp Tyr Ala Thr Ser Lys Asp Gly Leu Thr Trp Lys
130 135 140
Glu Gln Gly Ile Ala Val Lys Arg Gly Glu Lys Gly Ala Tyr Asp Asp
145 150 155 160
Arg Ser Val Phe Thr Pro Glu Val Met Glu Trp Lys Gly Lys Tyr Tyr
165 170 175
Leu Cys Tyr Gln Ala Val Lys Ser Pro Tyr Thr Val Arg Val Lys Asn
180 185 190
Thr Ile Gly Met Ala Cys Ala Asp Ser Pro Glu Gly Leu Trp Thr Lys
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Thr Asp Lys Pro Val Leu Glu Pro Ser Asp Thr Gly Glu Trp Glu Gly
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His Lys Val His Asp Pro Cys Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Lys Phe Tyr
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Arg Ser Ala Asp Ala Glu Lys Glu Pro Thr Glu Ile Leu Arg Trp Gly
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Ser Thr Trp Thr Leu Gln Thr His Thr Ala Lys Gly Glu Ser Lys Glu
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Arg Lys
<210> 3
<211> 691
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌婴儿亚种 ATCC 15697
<400> 3
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1 5 10 15
Pro Arg Ile Trp Tyr Gly Gly Asp Tyr Asn Pro Asp Gln Trp Pro Glu
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Glu Val Trp Asp Glu Asp Val Ala Leu Met Gln Gln Ala Gly Val Asn
35 40 45
Leu Val Ser Val Ala Ile Phe Ser Trp Ala Lys Leu Glu Pro Glu Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Asp Val Cys Gln Pro Gly Ala Arg Gln His Trp Arg Ala Thr Ser
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<213> 多糖降解菌 2-40
<400> 6
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