阅读说明：本技术 一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法 (Method for detecting phosphorus flame retardant and degradation product thereof in human urine ) 是由 朱婷婷 邓臣 胡蓉 刘云浪 王金玲 陈建义 齐秀娟 谢林伸 于 2020-06-05 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法,包括样本预处理步骤、固相萃取的步骤、定容的步骤、液相色谱的步骤和标准曲线的绘制步骤。本发明提供了一种人体尿液中磷系阻燃剂及其部分降解产物的检测方法,从而为人体尿液中磷系阻燃剂的调查、风险评估等提供参考。该发明方法操作简单,过程简便,能够在尽可能节约试剂的同时达到最佳萃取效果,同时保证了较高的回收率和数据的准确性。(The invention discloses a method for detecting phosphorus flame retardants and degradation products thereof in human urine, which comprises the steps of sample pretreatment, solid-phase extraction, volume determination, liquid chromatography and standard curve drawing. The invention provides a method for detecting a phosphorus flame retardant and a partial degradation product thereof in human urine, thereby providing references for investigation, risk assessment and the like of the phosphorus flame retardant in the human urine. The method disclosed by the invention is simple to operate, the process is simple and convenient, the optimal extraction effect can be achieved while the reagent is saved as much as possible, and meanwhile, the higher recovery rate and the data accuracy are ensured.)

一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法

技术领域

本发明涉及磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法领域，特别是一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法。

背景技术

有机磷系阻燃剂(organophosphate flame retardants，OPFRs)因其低烟、低毒、高耐热性的特性被广泛应用于电子产品、泡沫、塑料和纺织品中。由于有机磷系阻燃剂主要通过添加方式而非化学键的方式加入到材料中，容易通过产品磨损、挥发和渗透的方式从处理后的材料中浸出，释放到各环境介质中，从而对人类和各生物体造成影响。研究学者们在生物体内和各环境介质均检出不同浓度的OPFRs。已有研究表明有机磷系阻燃剂会产生诸如生物毒性、潜在致癌性和神经毒性等多种毒性效应，降低机体的免疫力。例如TPHP(磷酸三苯基酯)会抑制人体血液中单核细胞羧酸酶酯活性，进而对人体免疫系统产生不良影响。TCP具有潜在的生物毒性和中枢神经毒性，可通过吞食和皮肤接触的方式进入人体产生毒害。TBOEP会对生物的内分泌系统产生干扰效应。因此针对OPFRs对人体健康的影响研究逐渐引起学者们的关注，而尿液由于其易收集，样本量大的特点，是应用最为广泛的一种人体健康监测材料。

人体尿液中有14种磷系阻燃剂和3种代谢产物，分别为磷酸三乙酯(TEP)，磷酸二乙酯(DEP)，磷酸三丙酯(TPP)，磷酸三丁酯(TBP)，磷酸三戊酯(TNP)、磷酸三辛酯(TEHP)、磷酸三间甲苯酯(TMCP)、、磷酸二苯甲苯酯(CDP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)、三苯基氧化膦(TPPO)和2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)、磷酸三苯基酯(TPHP)、间苯二酚四苯基磷酸酯(RDP)和磷酸三异丁酯(TIBP)14种磷系阻燃剂，双(2-丁氧乙基)-2-(3-羟丁氧基)乙基磷酸三酯(BHEPT)、双(2-丁氧乙基)-2-羟乙基磷酸三酯(BHP)、双(丁氧基乙基)磷酸酯(BBP)3种磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)磷系阻燃剂降解产物，在分析国内文献中关于人体尿液中磷系阻燃剂含量报道的基础上，利用磷酸三正丁酯-d₂₇(TBP-d₂₇)、三(2-丁氧乙基)磷酸酯-d₂₇(TBOEP-d₂₇)作为标准替代物内标指示物。

目前已有少数学者开展了尿液中OPFRs的研究，但是现有的尿液中OPFRs的检测方法目标物少，而同时研究尿液中OPFRs及其代谢产物的检测方法则更少。中国专利公开号CN105699527A公开了血清中溴系阻燃剂和磷系阻燃剂含量的检测方法可供参考，该专利申请文件中，血清中磷系阻燃剂含量的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：

(1b)将待测血清与硅藻土混合，加入内标指示物，然后加入第一有机溶剂提取血清中的溴系阻燃剂，充分提取后得到提取液；

(2b)将步骤(1b)得到的提取液浓缩后，转移至固相萃取柱上进行净化，用第二有机溶剂将磷系阻燃剂从固相萃取柱上洗脱出来，收集洗脱液后进行浓缩；将浓缩后的洗脱液转移至复合氧化铝-硅胶柱进行进一步净化，用第二有机溶剂再次洗脱，将再次洗脱出的洗脱液定容；

(3b)配制含有步骤(1b)中所述内标指示物的磷系阻燃剂标准溶液，然后将步骤(2b)定容后的溶液和含有内标指示物的磷系阻燃剂标准溶液用气相色谱-质谱仪进行测定，基于内标法进行数据处理和定量分析后，获得血清中磷系阻燃剂的含量。

该检测方法能够很好地检测血清中磷系阻燃剂，为新型污染物的人体暴露风险评估提供了有效的方法手段。

但是目前还没有进行人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法，毕竟人体尿液比人体血清更易获得。

因此建立一套较为完整的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法，对于保障居民身体健康和区域生态环境安全，制定符合国情和地方的有机磷系阻燃剂的污染控制策略和消除措施，有着重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的是针对目前尚无人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测的好的方法，需要制定符合国情和地方的有机磷系阻燃剂的污染控制策略和消除措施，提供一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法。

本发明为实现其目的所采用的技术方案是：一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法，包括以下步骤：

步骤S1、样本预处理步骤；该步骤中将人体尿液样本加入标准替代物，混匀待测；

步骤S2、固相萃取的步骤；该步骤中对经过预处理的人体尿液样本进行固相萃取，获得洗脱液；

步骤S3、定容的步骤；该步骤中，对洗脱液进行定容；

步骤S4、液相色谱的步骤；该步骤中采用三重四极杆液质联用仪检测；

步骤S5、标准曲线的绘制步骤。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：在所述的样本预处理步骤中，取人体尿液样本0.5-1ml。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：所述的固相萃取的步骤包括：

步骤S201、活化柱子；在固相萃取装置上将MCX萃取小柱安装好后，将与人体尿液样本用量相同的甲醇加入小柱，让溶液自然滴落，待溶液与小柱内物质持平，再加入同样多的超纯水进行同样的操作；

步骤S202、上样和富集；将已加入标准替代物的人体尿液样本过已活化好的小柱，流出液弃去；

步骤203、淋洗；用与人体尿液样本用量相同的含有8‰甲酸的超纯水淋洗小柱；

步骤S204、干燥和洗脱；淋洗后，打开调节阀，用真空泵抽吸10-30min；保证固相萃取小柱干燥；对干燥后的小柱，用与人体尿液样本用量相同的甲醇和乙腈混合物洗脱，甲醇和乙腈混合物中甲醇和乙腈的体积比为3比7，洗脱液先浸泡柱子1-5分钟，再使洗脱液自然低落，收集洗脱液。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：所述的上样和富集步骤中，固相萃取小柱活化后，人体尿液样应立即过柱，过柱过程中应使小柱的水在其下端形成滴流，不能形成连续的液柱。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：所述的定容步骤中，用超纯水将洗脱液定容至0.5-1mL。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：所述的液相色谱的步骤中：

色谱条件：使用Agilent 1260系列液相色谱用于目标化合物的分离，色谱柱为；柱温35℃；进样量10μL，流动相为甲醇(A)和0.005mol/L的乙酸铵溶液(B)，流动相流速为250μL/min；

质谱条件：电喷雾电离源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；离子源电离模式：Positive；

毛细管电压为3500V，雾化器压力为45psi，载气为高纯氮气，载气温度为330℃，流速为9.5L/min，用多反应监测模式(MRM)检测，分析物的浓度均配制为500μg/L；通过总离子流图和相应的质谱图结果确定每种化合物的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能(CE)和去簇电压(DP)。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：所述的标准曲线的绘制步骤中：

实验中仪器分析所用的目标物标样包含14种磷系阻燃剂和3种代谢产物，分别为磷酸三乙酯(TEP)，磷酸二乙酯(DEP)，磷酸三丙酯(TPP)，磷酸三丁酯(TBP)，磷酸三戊酯(TNP)、磷酸三辛酯(TEHP)、磷酸三间甲苯酯(TMCP)、磷酸二苯甲苯酯(CDP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)、三苯基氧化膦(TPPO)和2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)、磷酸三苯基酯(TPHP)、间苯二酚四苯基磷酸酯(RDP)和磷酸三异丁酯(TIBP)14种磷系阻燃剂，双(2-丁氧乙基)-2-(3-羟丁氧基)乙基磷酸三酯(BHEPT)、双(2-丁氧乙基)-2-羟乙基磷酸三酯(BHP)、双(丁氧基乙基)磷酸酯(BBP)3种磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)磷系阻燃剂降解产物，利用磷酸三正丁酯-d₂₇(TBP-d₂₇)、三(2-丁氧乙基)磷酸酯-d₂₇(TBOEP-d₂₇)作为标准替代物，磷酸三甲酯-C₁₃(TMP-C₁₃)作为内标，配制2、5、10、50、100、500μg/L浓度的目标物标准曲线。

进一步的，上述的人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法中：还包括方法空白步骤；该步骤处理样品时，每批实验***一个空白样，用超纯水代替样品，进行与样品完全相同的处理步骤，并进行上机测定。

本发明提供了一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法，通过对人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的定量检测，制定环境污染控制策略和消除措施。

本发明提供了一种人体尿液中磷系阻燃剂及其部分降解产物的检测方法，从而为人体尿液中磷系阻燃剂的调查、风险评估等提供参考。该发明方法操作简单，过程简便，能够在尽可能节约试剂的同时达到最佳萃取效果，同时保证了较高的回收率和数据的准确性。

下面结合具体实施例对本发明作较为详细的描述。

具体实施方式

实施例1，本实施例是一种人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的检测方法，通过对人体尿液中磷系阻燃剂及其降解产物的定量检测，制定环境污染控制策略和消除措施。包括以下步骤：

(1)样品预处理：取1mL尿液加入标准替代物，混匀待测；

(2)固相萃取：对经过预处理的尿液进行固相萃取，步骤如下：

a.活化柱子：在固相萃取装置上将MCX萃取小柱安装好后，将1mL甲醇加入小柱，让溶液自然滴落，待溶液与小柱内物质持平，再加入1mL超纯水进行同样的操作。

b.上样和富集将已加入标准替代物的1mL尿液过已活化好的小柱，流出液弃去。此步骤需要注意的是，固相萃取小柱活化后，尿液应立即过柱，过柱过程中应使小柱的水在其下端形成滴流，不能形成连续的液柱。

c.淋洗用1mL含有8‰甲酸的超纯水淋洗小柱

d.干燥和洗脱：淋洗后，打开调节阀，用真空泵抽吸约15min左右，保证固相萃取小柱干燥。对干燥后的小柱，用1mL甲醇/乙腈，体积比为3比7，洗脱液先浸泡柱子2分钟，再使洗脱液自然低落，收集洗脱液

(3)定容：样品固相萃取结束后，对洗脱液进行定容。步骤为用超纯水将洗脱液定容至1mL。

(4)液相色谱-三重四极杆液质联用仪检测：仪器具体条件如下：

色谱条件：使用Agilent 1260系列液相色谱用于目标化合物的分离，色谱柱为；柱温35℃；进样量10μL，流动相为甲醇(A)和0.002mol/L的乙酸铵溶液(B)，流动相流速为250μL/min。梯度见表1。

表1流动相梯度洗脱(％是体积百分比)

时间/min	甲醇(A)/％	乙酸铵溶液(B)/％
			0	30	70
2	60	40
			9	100	0
14	95	5
			15	30	70

质谱条件：

电喷雾电离源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；离子源电离模式：Positive；

毛细管电压为3500V，雾化器压力为45psi，载气为高纯氮气，载气温度为330℃，流速为9.5L/min，用多反应监测模式(MRM)检测，分析物的浓度均配制为500μg/L。通过总离子流图和相应的质谱图结果确定每种化合物的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能(CE)和去簇电压(DP)，每种分析物离子及碰撞见表2。

表2 ESI-MS/MS时间、监测离子、输入电压、碰撞能

(5)标准曲线的绘制：实验中仪器分析所用的目标物标样包含14种磷系阻燃剂和3种代谢产物，分别为磷酸三乙酯(TEP)，磷酸二乙酯(DEP)，磷酸三丙酯(TPP)，磷酸三丁酯(TBP)，磷酸三戊酯(TNP)、磷酸三辛酯(TEHP)、磷酸三间甲苯酯(TMCP)、、磷酸二苯甲苯酯(CDP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)、三苯基氧化膦(TPPO)和2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)、磷酸三苯基酯(TPHP)、间苯二酚四苯基磷酸酯(RDP)和磷酸三异丁酯(TIBP)14种磷系阻燃剂，双(2-丁氧乙基)-2-(3-羟丁氧基)乙基磷酸三酯(BHEPT)、双(2-丁氧乙基)-2-羟乙基磷酸三酯(BHP)、双(丁氧基乙基)磷酸酯(BBP)3种磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)磷系阻燃剂降解产物，在分析国内文献中关于人体尿液中磷系阻燃剂含量报道的基础上，利用磷酸三正丁酯-d₂₇(TBP-d₂₇)、三(2-丁氧乙基)磷酸酯-d₂₇(TBOEP-d₂₇)作为标准替代物，磷酸三甲酯-C₁₃(TMP-C₁₃)作为内标，配制2、5、10、50、100、500μg/L浓度的目标物标准曲线。

(6)方法空白：处理样品时，每批实验***一个空白样，用超纯水代替样品，进行与样品完全相同的处理步骤，并进行上机测定，确保实验过程环境中无待测组分的干扰。

具体的，本实施例中可以采用下面的具体步骤：

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种人体尿液中有机磷系阻燃剂及其部分降解产物的检测方法，其具体步骤如下：

S1、样品预处理：取1mL尿液加入标准替代物，混匀后的样品进行固相萃取；

S2、固相萃取：对经过预处理的尿液进行固相萃取，步骤如下：

S201活化柱子：在固相萃取装置上将MCX萃取小柱(Waters公司OasisMCX)安装好后，将1mL甲醇(德国默克，色谱纯)加入小柱，让溶液自然滴落，待溶液与小柱内物质持平，再加入1mL超纯水进行同样的操作。在活化过程中需要注意的是在甲醇活化前先湿润一段时间，以便让溶剂与柱中的吸附剂充分接触，使吸附剂上的官能团展开；接着用超纯水平衡，除去活化剂为上样创造适宜的溶剂环境，整个过程使柱床处于湿润和活化状态备用。

S202上样和富集将已加入标准替代物的1mL尿液过已活化好的小柱，流出液弃去。此步骤需要注意的是，固相萃取小柱活化后，尿液应立即过柱，过柱过程中应使小柱的水在其下端形成滴流，不能形成连续的液柱。同时应使样品时刻浸没小柱填充物。萃取过程，柱子不能进入气泡，进入气泡会使目标化合物的固定相不能很好地吸附，影响富集效率，一旦进入气泡，需要重新活化柱子。

S203淋洗用1mL含有8‰甲酸的超纯水淋洗小柱

S204干燥和洗脱：淋洗后，打开调节阀，用真空泵抽吸约15min左右，保证固相萃取小柱干燥。对干燥后的小柱，用1mL甲醇/乙腈，体积比为3比7，洗脱液先浸泡柱子2分钟，再使洗脱液自然低落，收集洗脱液。

S3定容：样品固相萃取结束后，对洗脱液进行定容。步骤为用超纯水将洗脱液定容至1mL。

S4液相色谱-三重四极杆液质联用仪检测：仪器具体条件如下：

色谱条件：使用Agilent 1260系列液相色谱用于目标化合物的分离，色谱柱为；柱温35℃；进样量10μL，流动相为甲醇(A)和0.005mol/L的乙酸铵溶液(B)，流动相流速为250μL/min。梯度见表1。

质谱条件：

电喷雾电离源(ESI)；多反应监测模式(MRM)；离子源电离模式：Positive；离子喷雾电压：

毛细管电压为3500V，雾化器压力为45psi，载气为高纯氮气，载气温度为330℃，流速为9.5L/min，用多反应监测模式(MRM)检测，分析物的浓度均配制为500μg/L。通过总离子流图和相应的质谱图结果确定每种化合物的母离子和子离子，并根据响应情况优化碰撞能(CE)和去簇电压(DP)，每种分析物离子及碰撞见表2。

S5标准曲线的绘制：实验中仪器分析所用的目标物标样包含14种磷系阻燃剂和3种代谢产物，分别为磷酸三乙酯(TEP)，磷酸二乙酯(DEP)，磷酸三丙酯(TPP)，磷酸三丁酯(TBP)，磷酸三戊酯(TNP)、磷酸三辛酯(TEHP)、磷酸三间甲苯酯(TMCP)、、磷酸二苯甲苯酯(CDP)、磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)、三苯基氧化膦(TPPO)、2-乙基己基二苯基磷酸酯(EHDPP)、磷酸三苯基酯(TPHP)、间苯二酚四苯基磷酸酯(RDP)和磷酸三异丁酯(TIBP)14种磷系阻燃剂，双(2-丁氧乙基)-2-(3-羟丁氧基)乙基磷酸三酯(BHEPT)、双(2-丁氧乙基)-2-羟乙基磷酸三酯(BHP)、双(丁氧基乙基)磷酸酯(BBP)3种磷酸三(2-丁氧基乙基)酯(TBOEP)磷系阻燃剂降解产物，在分析国内文献中关于人体尿液中磷系阻燃剂含量报道的基础上，利用磷酸三正丁酯-d₂₇(TBP-d₂₇)、三(2-丁氧乙基)磷酸酯-d₂₇(TBOEP-d₂₇)作为标准替代物，磷酸三甲酯-C₁₃(TMP-C₁₃)作为内标，配制2、5、10、50、100、500μg/L浓度的目标物标准曲线。本实施例目标物保留时间、工作曲线方程、相关系数参考表3。

表3本实施例目标物保留时间、工作曲线方程、相关系数

S6方法空白：处理样品时，每批实验***一个空白样，用超纯水代替样品，进行与样品完全相同的处理步骤，并进行上机测定，确保实验过程环境中无待测组分的干扰。

本实施例的方法操作简单，减少了杂质的干扰，过程简便，缩短了实验周期，减少了实验人员的工作量，能够在尽可能节约试剂的同时达到最佳萃取效果，同时保证了较高的回收率和数据的准确性。

以上显示和描述了本发明的主要特征、基本原理和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书的描述只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围内所附的权利要求书及其等效物界定。