阅读说明：本技术 一种同时测定鸡蛋中7种色素的方法 (Method for simultaneously determining 7 pigments in eggs ) 是由 杨成 黄晴 沈晓芳 孙嵇成 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种同时测定鸡蛋中7种色素的方法,属于食品安全检测技术领域。所述方法是采用DQTP/Fe<Sub>3</Sub>O<Sub>4</Sub>有机共价骨架结构和磁性纳米复合材料,作为分散式磁性固相萃取吸附剂,以提取鸡蛋中的色素,再采用超高效液相色谱串联质谱UPLC-MS/MS法结合外标法测定鸡蛋中色素含量。本发明建立一种同时测定鸡蛋中核黄素、叶黄素、角黄素和苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ色素含量方法。叶黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的检出限均为0.2ug/kg,核黄素的检出限为0.2ug/kg。7种色素在加标量2～10ug/kg范围内,回收率为80.2～106.7％,相对标准偏差RSD为1.5～6.0％。(The invention discloses a method for simultaneously determining 7 pigments in eggs, and belongs to the technical field of food safety detection. The method adopts DQTP/Fe 3 O 4 Organic covalent skeleton structure and magnetic nano composite material as dispersive magnetic solid phase extractionAnd (3) taking an adsorbent to extract the pigment in the eggs, and determining the content of the pigment in the eggs by adopting an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry UPLC-MS/MS method in combination with an external standard method. The invention provides a method for simultaneously measuring the contents of riboflavin, lutein, canthaxanthin, Sudan red I, Sudan red II, Sudan red III and Sudan red IV pigments in eggs. The detection limits of lutein, canthaxanthin, Sudan red I, Sudan red II, Sudan red III and Sudan red IV are all 0.2ug/kg, and the detection limit of riboflavin is 0.2 ug/kg. The recovery rate of the 7 pigments is 80.2-106.7% within the range of adding standard amount of 2-10 ug/kg, and the relative standard deviation RSD is 1.5-6.0%.)

一种同时测定鸡蛋中7种色素的方法

技术领域

本发明涉及一种同时测定鸡蛋中7种色素的方法，属于食品安全检测技术领域。

背景技术

随着生活水平不断提高，人们对天然有机食材的追求正成为一种趋势。自然条件下散养 鸡所产的蛋，俗称“土鸡蛋”或“草鸡蛋”受到青睐，价格比普通鸡蛋高出1倍甚至几倍。 普通消费者主要通过蛋黄颜色区分土鸡蛋和普通鸡蛋，认为土鸡蛋的颜色更深。鸡蛋黄的颜 色来自于核黄素、叶黄素等色素物质。散养鸡有更多机会吃到富含叶黄素的树叶、种子等食 物，叶黄素是一种天然的类胡萝卜素物质，经代谢后在蛋黄中富集，使其呈现鲜艳桔黄色。 笼养鸡以吃人工饲料为主，叶黄素摄入偏低，产蛋周期也较短，蛋黄多呈浅黄色。为了迎合 消费者对蛋黄颜色的偏好，不少养殖户在饲料中添加加丽素红、苏丹红等色素，将笼养鸡蛋 黄的颜色变深，再冒充土鸡蛋高价销售。加丽素红的主要成分为角黄素，是一种人工合成的 类胡萝卜素，自然界中仅少量存在。角黄素几乎没有营养价值，过量摄入还可能对人的视力 造成影响。虽然加丽素红被允许在动物饲料中添加剂，但将其用于制造假土鸡蛋的行为属于 商业欺诈，严重损害了消费者知情权。苏丹红属偶氮系列染料，并非食品添加剂，其大多数 有致癌性。

我国是鸡蛋的生产和消费大国，鸡蛋的质量安全关乎民生也影响市场稳定。鸡蛋中各种 内源性和外源性色素能在一定程度上反映出鸡蛋的品质和安全风险。国内外对鸡蛋中色素类 物质的检测开展大量的研究，如焦广睿等人建立了蛋黄中类胡萝卜素类着色剂的 HPLC-MS/MS检测方法，刘俊等人建立了禽蛋中的苏丹红检测方法，何康昊等人建立了检测 蛋黄中角黄素和虾青素的高效液相色谱法。上述方法的局限性在于检测的目标物比较单一或 较少，无法同时对蛋黄中多种色素物质进行定性和定量分析，从而区别天然营养物质和人工 添加色素。

发明内容

针对以上问题，利用磁性共价有机骨架化合物作为分散式固相萃取剂，对鸡蛋中7种色 素，分别是叶黄素、核黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ具有较好的吸附萃取能力，并利用高效液相色谱三重四级串联质谱法建立了一种同时检测鸡蛋中7种 色素的方法。通过优化检测条件和实际样品的检测验证此方法的有效性和准确性。与相关文 献报道的方法比较，此方法不仅操作简单，特异性强，对于鸡蛋中色素的检测有着重要的意 义，也为色素的检测提供了新的思路。

分散式磁性固相萃取是用本身具备磁性的材料或用经磁性物质(如Fe₃O₄、Fe₂O₃)修饰 的材料作为萃取的吸附剂，将磁性吸附剂直接加入到含有目标分析物的样品溶液中，萃取吸 附后通过外加磁场的作用将吸附剂与样品基质分离的一种固相萃取技术。是在分散固相萃取 基础上的改进和提升，除具有分散固相萃取的所有优点外，还避免了离心或过滤的程序，操 作更加便捷。磁性吸附剂作为分散式磁性固相萃取的核心和关键，也是该技术得以应用的前 提。

Fe₃O₄和Fe₂O₃磁性纳米颗粒吸附量小，没有功能基团。复合磁性纳米材料为分散式磁 性固相萃取提供了广阔的应用空间。共价有机骨架(COFs)是由有机亚单元之间的强共价键 构成的二维或三维结晶多孔结构。COFs具有许多独特的性质，如可调节的孔隙率，超大的比 表面积和良好的化学和热稳定性。本专利将一种COF(DQTP)磁化，制备磁性COF纳米材 料(DQTP/Fe₃O₄)，作为分散式磁性固相萃取吸附剂，并应用于鸡蛋中7种色素检测的样品预处理方法。

本发明的第一个目的是提供一种提取鸡蛋中色素的预处理方法，所述方法是采用DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料作为分散式磁性固相萃取吸附剂，以提取鸡蛋中的色素；所述DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料是通过采用DQTP对Fe₃O₄磁性纳米材料进行表面修饰制备得到的。其中，DQTP是由2,6-二氨基蒽醌(DQ)和1,3,5-三甲基间苯三酚(TP)制备得到。

在本发明一种实施方式中，采用共沉淀法制备DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料；反应条件为： 水浴加热；DQTP和Fe₃O₄磁性纳米材料的质量比为(1-5)：(1-2)；温度分别为80-90℃。

在本发明一种实施方式中，所述预处理方法是将DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料加入到待测样 品，吸附15-30min后，采用磁铁吸附DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料；再采用甲醇洗脱DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料上的色素。

在本发明一种实施方式中，所述色素包括叶黄素、核黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红 Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ中的一种或多种。

本发明的第二个目的是提供一种检测鸡蛋中色素含量的方法，所述方法是采用上述预处 理方法处理鸡蛋样品，再采用超高效液相色谱串联质谱UPLC-MS/MS法结合外标法测定鸡蛋 中色素含量。

在本发明一种实施方式中，超高效液相色谱的色谱柱型号为PhenomenexKinetexF5(2.6 μm，100×3.0mm)。

在本发明一种实施方式中，超高效液相色谱的流动相为：流动相A：体积百分数0.1％(v/v) 的甲酸/水溶液；流动相B：0.1％(v/v)的甲酸/乙腈溶液；洗脱条件为：0-2min，20％A+80％B；2-4.5min，100％B；4.6-6.6min 20％A+80％B。

在本发明一种实施方式中，所述质谱条件为：采用电喷雾离子源、正离子扫描模式；离 子源温度550℃；气帘气体30psi；毛细管电压5500V；雾化气压力55psi；辅助气压力都 55psi。

本发明的第三个目的是提供一种上述方法在蛋类产品品质检测方面的应用。

本发明的第四个目的是提供一种DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料在分离或提取色素方面的应 用；所述DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料是通过采用DQTP对Fe₃O₄磁性纳米材料进行表面修饰制 备得到的。

本发明的有益效果：

本发明建立一种同时测定鸡蛋中核黄素、叶黄素、角黄素和苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹 红Ⅲ、苏丹红Ⅳ色素含量的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)方法。7种色素在浓度1～ 20ug/L范围内线性关系良好，相关系数r²≥0.998。叶黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、 苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的检出限均为0.2ug/kg，核黄素的检出限为0.2ug/kg。7种色素在加标 量2～10ug/kg范围内，回收率为80.2～106.7％，相对标准偏差(RSD)为1.5～6.0％。该方 法准确、快速(预处理和检测总时间仅需40min)、高效，可用于鸡蛋中内、外源色素的定 性、定量分析。

附图说明

图1为7种色素的提取离子色谱图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用 于限制本发明。

实施例1：磁性DQTP/Fe₃O₄纳米材料的制备方法

将3mL含17mg 2,6-二氨基蒽醌(DQ)的DMF溶液的试管，置于90℃水浴锅内。10mg1,3,5-三甲基间苯三酚(TP)用DMF配成10mg/L，加入0.05mL 6mol/L乙酸溶液充分超声 均匀后，用移液枪吸取1mL缓慢逐滴加入到DQ的热溶液中，过程控制在1h。TP溶液完全 加入后，用脱脂棉花塞住试管口，混合溶液继续90℃水浴3h。生成物在去离子水和丙酮内 分别浸泡24h置换未反应的配体，并真空干燥得到DQTP。将80mg FeCl₃·6H₂O和50mg FeSO₄·7H₂O分散在20mL纯水中。加入70mg合成好的DQTP在80℃下超声分散，制备悬 浊液。逐滴加入30％氨水将pH调节至10，然后在80℃下继续搅拌30min。最后将所得材料 冷却至室温并用纯水和乙醇洗涤，所制得的DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料，外部磁场吸附收集。

实施例2：一种提取鸡蛋中7种色素的预处理方法

应用实施例1制备得到的DQTP/Fe₃O₄磁性纳米材料作为分散式磁性固相萃取吸附剂，以 萃取吸附鸡蛋中的色素，具体步骤如下：

将10mg DQTP/Fe₃O₄加入到10mL样品溶液中，将混合物匀速振荡20min后，使用磁铁吸附DQTP/Fe₃O₄，并用纯水洗涤两次；然后，加入2mL色谱纯甲醇，通过旋涡振荡10min 洗脱DQTP/Fe₃O₄上的分析物，并通过0.22μm过滤膜除去颗粒杂质。

实施例3：一种检测鸡蛋中7种色素含量的方法

应用实施例2的预处理方法萃取吸附鸡蛋中的色素，再结合UPLC-MS/MS和外标法对鸡 蛋中的色素含量进行定量分析，具体步骤如下：

1、建立标准曲线：

(1)配制标准储备液：分别准确称取适量、叶黄素、核黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ标准品各2mg，置于10mL容量瓶中，再用乙腈溶解并定容至刻 度，配制成浓度为200mg/L的标准储备液，等待上机；

(2)UPLC-MS/MS测定：

将标准储备液自动进样到超高效液相色谱串联质谱仪，采用UPLC-MS/MS测定绘制标准 曲线；

色谱柱为PhenomenexKinetexF5柱(2.6μm，100×3.0mm)，流动相A：0.1％的甲酸/水溶液； 流动相B：0.1％的甲酸/乙腈溶液；流速：0.45mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃，液相色 谱梯度洗脱程序见表1。

表1液相色谱梯度洗脱程序

电喷雾离子源(ESI)、正离子扫描模式；离子源温度550℃；气帘气体30psi；毛细管电压5500V；雾化气压力55psi；辅助气压力都55psi。多反应监测、去簇电压及碰撞能量见表2。

表2质谱参数

7种色素的提取离子色谱图见图1。在检测目标物中，叶黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹 红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的极性较弱，核黄素的极性较强。如图1所示，在方法条件下3min 之内，极性差异较大的7种色素物质全部出峰，且峰形良好，易于定性、定量。

(3)线性关系、检出限的确定

以进样浓度为横坐标，以峰面积的响应值为纵坐标绘制标准曲线。以信噪比3:1作为最 低检出限(LOD)，结果见表3。如表3所示，7种色素在浓度1～20ug/L范围内线性关系良好， 相关系数r²≥0.998。叶黄素、角黄素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ的检出限 均为0.2ug/kg，核黄素的检出限为0.2ug/kg。

表3标准曲线与线性相关性

2、一种检测鸡蛋中7种色素含量的方法

应用实施例2的预处理方法萃取吸附鸡蛋中的色素，再结合UPLC-MS/MS对鸡蛋中的色 素含量进行定量分析，具体步骤如下：

(1)样品预处理：将10mg DQTP/Fe₃O₄加入到10mL样品溶液中，将混合物匀速振荡20min后，使用磁铁吸附DQTP/Fe₃O₄，并用纯水洗涤两次；然后，加入2mL色谱纯甲醇， 通过旋涡振荡10min洗脱DQTP/Fe₃O₄上的分析物，并通过0.22μm过滤膜除去颗粒杂质， 待用；

(2)采用UPLC-MS/MS进行检测：将经步骤(1)预处理得到的样品溶液自动进样到超高效液相色谱串联质谱仪，采用UPLC-MS/MS分析，外标法定量；

色谱柱为PhenomenexKinetexF5(2.6μm，100×3.0mm)，流动相A：0.1％的甲酸/水溶液； 流动相B：0.1％的甲酸/乙腈溶液；流速：0.45mL/min；进样量：5μL；柱温：40℃，液相色 谱梯度洗脱程序见表1。

电喷雾离子源(ESI)、正离子扫描模式；离子源温度550℃；气帘气体30psi；毛细管电压电压5500V；雾化气压力55psi；辅助气压力都55psi。多反应监测、去簇电压及碰撞能量见表2。

(3)回收率及精密度

取鸡蛋样品，按照步骤(1)和(2)的方法提取、测定，得到7种色素物质的本底值。再向样品中分别加入4μg、10μg、20μg的7种色素标准品，制备加标浓度2ug/kg、5ug/kg、10ug/kg的样品，进行回收率和精密度试验。每个含量水平6个重复取平均值，计算回收率(参照下述公式1)和精密度，结果见表4。如表4所示，7种色素加标量在2～10ug/k浓度 范围内，回收率为80.2～106.7％，相对标准偏差RSD为1.5～6.0％。

对比例1：替换色谱柱

将实施例3中的色谱柱更换成ACQUITYHSS C18柱(1.8μm，150×1.0mm)、ACQUITYHSS T3柱(1.8μm，150×1.0mm)和ACQUITYBEH C18柱(1.7μ m，100×2.1mm)，结果发现这三根柱子不能将7种色素明显分离，分离效果不及PhenomenexKinetexF5柱(2.6μm，100×3.0mm)。

表4精密度与回收率(n＝6)

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的 人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应 该以权利要求书所界定的为准。