阅读说明：本技术 一种检测人体干尿滤纸片中多种有机酸的定量检测方法 (Quantitative detection method for detecting multiple organic acids in human body dry urine filter paper sheet ) 是由 邬智刚 朱文漓 叶尚宇 于 2020-06-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种同步定量检测人体干尿滤纸片中多种有机酸含量的方法。该方法使用滤纸片收集尿液,经过洗脱、纯化、采用液相色谱与质谱联用方法对目标有机酸进行同步定性定量分析。本发明方法具有如下优点：1.本发明采用滤纸片收集尿液标本,降低样本的保存和运输条件,对样本的运输、保存无特殊需求,样本保存时间长,可以很好的扩大该检测方法的适用范围。通过邮寄的方式收集样本进行检测,利于大规模商业化使用该检测方法；2.本发明提供的人尿液中有机酸代谢产物检测方法具有灵敏度高、精确度高、重复性好以及检测速度快的优点,适用于功能性评估特定营养素的需求,在此基础上创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。(The invention relates to a method for synchronously and quantitatively detecting the contents of various organic acids in a human body dry urine filter paper sheet. The method uses a filter paper sheet to collect urine, and performs synchronous qualitative and quantitative analysis on target organic acid by eluting, purifying and adopting a liquid chromatography-mass spectrometry combined method. The method of the invention has the following advantages: 1. the invention adopts the filter paper sheet to collect the urine specimen, reduces the storage and transportation conditions of the specimen, has no special requirements on the transportation and storage of the specimen, has long storage time of the specimen, and can well expand the application range of the detection method. Samples are collected by mailing for detection, so that the detection method is beneficial to large-scale commercial use; 2. the method for detecting the organic acid metabolites in the human urine has the advantages of high sensitivity, high accuracy, good repeatability and high detection speed, is suitable for functionally evaluating the requirements of specific nutrients, and is the best choice for improving the symptoms of patients by establishing a personalized treatment scheme on the basis.)

一种检测人体干尿滤纸片中多种有机酸的定量检测方法

技术领域

本发明涉及生化检测技术领域，尤其涉及一种同步定量检测人体干尿滤纸片中多种有机酸含量的方法。

背景技术

有机酸是身体基本代谢过程中产生的一大类化合物。它们来自膳食蛋白质，脂肪和碳水化合物，被身体用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。尿液有机酸测试选择的代谢物，可以作为异常代谢的重要诊断指标。代谢失衡是一种常见且普遍的疾病，可能是许多慢性疾病的基础，例如疲劳，胃肠功能障碍，肌肉/关节问题，情绪障碍和头痛。这些疾病通常对长期治疗和持续改善有抵抗力。有机酸分析传统上可以用于早期检测/排除或监测代谢障碍。尿液样本可用于评估肠道，肝脏和神经系统健康以及能量代谢和营养缺乏。

蛋白质、脂肪和碳水化合物，作为人体主要的食物被用于产生细胞能量并提供细胞功能所必需的营养。但食物中同时也应该包括其它必要的营养素，只有在这些必要营养素的帮助下食物才能转化为能量和营养被人体吸收。当食物代谢时，某些必要营养素的缺乏会导致能量生成和营养吸收的通路受阻，同时产生的有机酸代谢产物就会排入尿液中。因此通过尿液中有机酸的测定可以评估个体能量代谢情况和特定的营养素是否缺乏。对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明特定的代谢通路被阻碍，该代谢通路所必需的营养素水平较低。尿液有机酸测试有助于理解营养素代谢的执行方式，并确定代谢周期可能存在不平衡的地方。举例说明，B族维生素，特别是B1(硫胺素)，B3(烟酸)和B5(泛酸)，为所有体细胞的能量通路提供必需的辅助因子。当食物被代谢时，在需要维生素B参与的步骤中形成特定化合物。这些步骤发生在碳水化合物代谢中，其中形成丙酮酸和乳酸。这些化合物水平升高的说明这个反应的辅助酶活力低，因此需要增加B族维生素，特别是硫胺素和泛酸。在增加这些必需营养素的摄入后，反应的通路重新被打通，细胞的能量产生效率恢复。几乎身体系统的每个环节都需要酶辅助因子，这些辅助因子如维生素或矿物质的缺乏会广泛影响的身体功能，包括免疫，内分泌，肌肉骨骼和代谢系统。

对于测量的许多有机酸，尿中异常高的水平通常表明分解该化合物所需的营养素水平较低。在此基础上，功能性评估特定营养素的需求，创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。

发明人前期已开发一种人体尿液样本中多种有机酸代谢产物的定量检测方法。而该方法由于样本为人体尿液，存在保存、运输条件要求较高的问题，为解决该问题，发明人进一步开发了一种使用人体干尿滤纸片的定量检测方法，该方法采用干尿滤纸片保存样本，降低了样本的保存和运输条件，对样本的运输、保存没有特殊需求，可以很好的扩大该检测方法的适用范围。通过比较，干尿滤纸片保存的样本仍具有与尿液样本相当的检测灵敏度、重复性，且该方法的检测速度快，检测批量大等优点，能高效的对有机酸代谢产物进行精确的定量检测，具有良好的科研和商业应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种使用干尿片作为样本采集、保存和运输方式的高效液相色谱联用串联质谱技术检测人体尿液中多种有机酸代谢产物的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

步骤1、采用滤纸片收集尿液标本，晾干后置专用干燥袋进行保存和运输；

步骤2、对干尿片进行洗脱处理，得到的洗脱后尿液样本测定肌酐含量用以确定尿液浓度，并获得用以测定有机酸的尿液样本；

步骤3、尿液样本与内标液混合后通过有机溶剂将目标有机酸萃取纯化，氮气吹干后溶于水中，然后用强阴离子交换柱纯化，有机溶剂洗脱后氮气吹干，溶于水中得到待测样本；

步骤4、测样本通过液相色谱与质谱联用检测，得到有机酸的种类和含量。

进一步的，上述步骤1所述滤纸片包括但不限于新华1号，新华3号和Whatman 903号滤纸；

进一步的，上述步骤1中所述尿液样本为人体晨尿；

进一步的，上述步骤1中所述干尿片制备方式为将一定量人体新鲜晨尿滴到定量滤纸片上，使尿液分布均匀，滤纸片晾干后密封保存备用。

进一步的，上述步骤2中所述的干尿片洗脱处理所用溶剂包括水、PBS、生理盐水，优选洗脱溶剂为生理盐水。

进一步的，上述步骤3萃取所用的有机溶剂包括乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷和叔丁基甲醚，优选的有机萃取溶剂为乙酸乙酯。更进一步的，所述的有机萃取溶剂为乙酸乙酯；

进一步的，上述步骤3中强阴离子交换柱的洗脱溶剂为甲醇或丙酮(加2％甲酸)。

进一步的，上述步骤4具体包括以下步骤：

步骤A：称取有机酸标准品，用甲醇溶解，得到不同浓度的标准液；

步骤B:量取上述甲醇定容后的内标液，将其分别加入步骤A得到的标准液中，用超纯水定容后离心，取上清液作为待测标准液；

步骤C：将步骤B得到的待测标准液和步骤3得到的待测样本通过液质联用检测，得到有机酸代谢产物的种类及含量。

进一步的，所述有机酸代谢产物包括乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、柠檬酸，顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸。

采用有机溶剂萃取和强阴离子交换柱纯化处理人体尿液中的上述有机酸代谢产物，利用高效液相色谱将20种有机酸代谢产物分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述有机酸代谢产物的含量。

进一步的，上述步骤C液质联用检测的液相色谱条件为：

色谱柱为键合相色谱柱，进样量为5-50μL，流动相包括A和B，其中A为水溶液，B为混合溶液，流动相的流速为0.1-2.0mL/min；流动相的梯度(以体积百分比计)：0-1min,A:30-100％,B:70-0％；

1.1-5min,A:10-60％,B:90-60％；

5.1-9min,A:0-50％,B:100-50％；

9.1-11min,A:50-100％,B:50-0％；

11.1min,A:30-100％,B:70-0％。

更进一步的，上述键合相色谱柱为C18或C8等键合相色谱柱，规格为50-150mm×2.1-4.6mm,1.8-5μm。

更进一步的，液相色谱条件中，流动相A为1-10mmol/L的乙酸铵水溶液+0.1％-1％甲酸的纯水，流动相B为乙腈甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇的质量比为9-1:1-9。

进一步的，上述液质联用检测的质谱条件为：ESI离子源，负离子MRM扫描，雾化气流速为5-10L/min，气帘气流速为5-20L/min，离子源电压为2000-4500V，离子源温度为200-400℃。

进一步的，在电喷雾负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，目标物的离子对监测如下：乙二酸(m/z 145.2—83.1)、辛二酸(m/z 173.2—111.2)、乙基丙二酸(m/z131.1—87.1)、乳酸(m/z 89.1—43.1)、丙酮酸(m/z 87.1—43.1)、β-羟基丁酸(m/z103.1—59.1)、柠檬酸(m/z 191.1—87.1)、顺式乌头酸(m/z 173.1—85.1)、异柠檬酸(m/z191.1—73.1)、α-酮戊二酸(m/z 145.1—101.1)、α-酮异戊酸(m/z 115.1—115.1)、α-酮异己酸(m/z 129.2—129.2)、α-酮-β-甲基戊酸(m/z 129.2—129.2)、琥珀酸(m/z 117.1—73.0)、富马酸(m/z 115.1—71.0)、苹果酸(m/z 133.1—115.0)、羟甲基戊二酸(m/z117.1—59.0)、黄尿酸(m/z 204.2—160.1)、β-羟基异戊酸(m/z 117.1—73.1)和甲基丙二酸(m/z 117.1—73.1)。内标：D3-甲基丙二酸(m/z 120.1—73.1)、D3-乙基丙二酸(m/z134.1—87.1)、D4-柠檬酸(m/z 195.1—87.1)。

与已有技术相比，本发明的优势在于：

1、本发明采用滤纸片收集尿液标本，降低样本的保存和运输条件，对样本的运输、保存没有特殊需求，样本保存时间长，可以很好的扩大该检测方法的适用范围，符合我国幅员辽阔、人口众多、地区发展不平衡的特点，通过邮寄的方式收集样本进行检测，有利于大规模的商业化使用该检测方法。

2、本发明提供的人体尿液中有机酸代谢产物的检测方法具有灵敏度高、精确度高、重复性好以及检测速度快的优点，适用于功能性评估特定营养素的需求，在此基础上创建个性化治疗方案是改善患者症状的最佳选择。

附图说明

图1：标准品原液与标准品干滤纸片总离子流色谱图对比。

图2：同一尿液样本与干尿片检测总离子流色谱图对比。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，但不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例都属于本发明保护的范围。

实施例1滤纸片的筛选。

研究样本：取自健康志愿者中段晨尿，每份10ml。

样本处理：

①同一份尿样分成3份，每份1ml，取2份使用巴氏滴管均匀加入3cm×7cm大小滤纸片上；另取配制好的混合标准品2份，每份1m，取1份使用巴氏滴管均匀加入3cm×7cm大小滤纸片上。然后在避光、室温环境中干燥3-6h。干燥后的滤纸单独封存入不透光自封袋中待用。优先选用Whatman 903滤纸和新华3号滤纸。

②干燥纸尿片卷好后放入2.5ml注射器中，加入2ml生理盐水，浸泡15min后3000rpm常温离心5min收集洗脱液。通过称重法确认收集洗脱液体积，用以后续校准浓度。

③取各洗脱尿液样本100μl，洗脱混合标准品液100μl，液体尿液样本和液体混合标准品各取100ul，加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，与内标液混合，加入活化后的强阴离子交换柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1mL，共计2mL洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

仪器：

API 4000三重四级杆质谱仪(Applied Biosystem公司)；Agilent液相色谱系统(配自动进样器)；十万分之一天平；色谱柱(C18)；氮吹仪；高速台式冷冻离心机；冻干机；固相萃取柱；可调移液器；玻璃仪器、烧杯、量筒等。

试剂耗材：

色谱纯甲醇；乙腈；甲酸；乙酸铵；乙酸乙酯；氨水。

标准品：

乙二酸、辛二酸、乙基丙二酸、乳酸、丙酮酸、β-羟基丁酸、柠檬酸，顺式乌头酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、α-酮异戊酸、α-酮异己酸、α-酮-β-甲基戊酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸、羟甲基戊二酸、黄尿酸、β-羟基异戊酸和甲基丙二酸，内标D3-甲基丙二酸、D3-乙基丙二酸、D4-柠檬酸购于Sigma-Aldrich。

方法：

色谱条件：流动相A：0.5％v/v甲酸+5mM乙酸铵水溶液；流动相B：0.5％v/v甲酸甲醇溶液。色谱柱型号：XSelect HSS T3Column(

3.5μm,2.1mm X 100mm)，采用梯度洗脱方式。流速为0.3ml/min，柱温为45℃，进样量为10μl。

质谱条件：电喷雾电离负离子检测模式，采用多反应监测的扫描模式。喷雾电压为4kV；碰撞气为；离子源雾化气为；加热辅助气为；去溶剂温度为。监测的目标物如下：乙二酸(m/z 145.2—83.1)、辛二酸(m/z 173.2—111.2)、乙基丙二酸(m/z 131.1—87.1)、乳酸(m/z 89.1—43.1)、丙酮酸(m/z 87.1—43.1)、β-羟基丁酸(m/z 103.1—59.1)、柠檬酸(m/z191.1—87.1)、顺式乌头酸(m/z 173.1—85.1)、异柠檬酸(m/z 191.1—73.1)、α-酮戊二酸(m/z 145.1—101.1)、α-酮异戊酸(m/z 115.1—115.1)、α-酮异己酸(m/z 129.2—129.2)、α-酮-β-甲基戊酸(m/z 129.2—129.2)、琥珀酸(m/z 117.1—73.0)、富马酸(m/z115.1—71.0)、苹果酸(m/z 133.1—115.0)、羟甲基戊二酸(m/z 117.1—59.0)、黄尿酸(m/z 204.2—160.1)、β-羟基异戊酸(m/z 117.1—73.1)和甲基丙二酸(m/z 117.1—73.1)。内标：D3-甲基丙二酸(m/z 120.1—73.1)、D3-乙基丙二酸(m/z 134.1—87.1)、D4-柠檬酸(m/z 195.1—87.1)。分别对各个目标的去簇电压，碰撞电压等条件进行最优设定，以达到最佳的稳定性和灵敏度。

标准品配制：

分别准确称取标准品从10mg到400mg，分别置于10ml的容量瓶中，加入甲醇溶液，配制成浓度分别为1-100mg/ml的标准品母液；分别从以上标准品母液中移取10μl加入同一离心管中，再加入甲醇800ml，得到浓度为10-1000μg/mL混合标准品溶液，然后用甲醇将浓度等倍逐级稀释6个梯度；配制成成梯度的混合标准液。

称取内标品，加入完全溶解得到浓度为4mg/ml的内标溶液。然后用甲醇将内标溶液的浓度稀释至100ug/ml，配制得到内标工作溶液。

实验结果显示，Whatman903号滤纸较其他滤纸拥有更好的洗脱效率，洗脱率均在大于100％±20％范围之内，能满足检测需求。

实施例2洗脱条件的筛选。

研究样本：取自健康志愿者中段晨尿，每份10ml。

样本处理：

①同一份尿样分成10份，每份1ml，取1份使用巴氏滴管均匀加入3cm×7cm大小滤纸片上。然后在避光、室温环境中干燥3-6h。干燥后的滤纸单独封存入不透光自封袋中待用。优先选用新华3号滤纸。

②8份干燥纸尿片卷好后放入2.5ml注射器中，按下表中条件进行洗脱处理，之后3000rpm常温离心5min收集洗脱液。通过称重法确认收集洗脱液体积，用以后续校准浓度。

③取各洗脱尿液样本100μl，液体尿液样本100ul，加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，与内标液混合，加入活化后的强阴离子交换柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1mL，共计2mL洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

④本实施例中试剂和仪器设备同实施例1。

经过实验结果比较，发现使用2ml洗脱液在60℃下静置30min，能取得最佳洗脱效率。

实施例3干尿滤纸片放置稳定性。

干尿滤纸片样本室温和4℃放置下的稳定性测试。

取5份尿液样本，按本发明所述方法制作成为各15份干尿滤纸片。分别于干燥环境中，在室温和4℃条件下放置0、48小时、7天、14天、30天和60天后按本发明所述方法分别测定所有20种有机酸的含量。要求与0点测定值相比，准确度在100±25％范围内，认为该时间点靶标物稳定。本实施例中试剂和仪器设备同实施例1。

结果显示样本放置于4℃下60天后，20个有机酸均保持稳定。表明4℃时，干尿滤纸片可保存至少60天。

结果显示样本放置于室温下60天后，20个有机酸均保持稳定。表明室温下干尿滤纸片至少可放置60天。

实施例4尿液与干尿片检测结果比对。

研究样本：取自10位健康志愿者中段晨尿，每份10ml。

样本处理：

①同一份尿样分成2份，每份1ml，取1份使用巴氏滴管均匀加入3cm×7cm大小滤纸片上。然后在避光、室温环境中干燥3-6h。干燥后的滤纸单独封存入不透光自封袋中待用。优先选用新华3号滤纸。

②每份干燥纸尿片卷好后放入2.5ml注射器中，加入2ml洗脱液，60℃下静置30min。之后3000rpm常温离心5min收集洗脱液。通过称重法确认收集洗脱液体积，用以后续校准浓度。

③取洗脱尿液样本100μl，液体尿液样本100ul，加入100μl乙酸乙酯萃取，氮气吹干后溶于水中，与内标液混合，加入活化后的强阴离子交换柱中，甲醇(2％甲酸)洗脱2次，每次1mL，共计2mL洗脱液，加热60℃的条件下用氮吹仪挥发干，溶于水中，0.22μm滤膜过滤后进样。

④本实施例中试剂和仪器设备同实施例1。

实验结果如下表所示。