阅读说明：本技术 一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂 (Immune checkpoint inhibitor for cancer treatment ) 是由 蒋可 于 2020-05-27 设计创作，主要内容包括：本发明保护一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂,特别地,本发明提供一种单克隆抗体,所述单克隆抗体为一种人源化单克隆抗体,其能够特异性地与ILDR2结合,并且能够十分有效地抑制其ILDR2免疫作用,具备抑制肿瘤进程的功能。(The present invention protects an immune checkpoint inhibitor for cancer therapy, and particularly provides a monoclonal antibody, which is a humanized monoclonal antibody, can specifically bind to ILDR2, can effectively inhibit ILDR2 immunization, and has a tumor progression inhibiting function.)

一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂

技术领域

本发明涉及免疫检查点抑制剂领域，特别地涉及一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂。

背景技术

靶向共抑制性免疫检查点的单抗，如PD-1和CTLA-4，已经在多种恶性肿瘤中表现出了临床活性，包括黑色素瘤，非小细胞肺癌，肾细胞癌，膀胱癌，头颈部鳞状细胞癌，MSI高结直肠癌，Merkel细胞癌和霍奇金淋巴瘤，并改变了医学肿瘤学实践。

特别地，免疫检查点抑制剂在黑色素治疗中取得了成功，获批治疗方案包括抗PD-1(nivolumab和pembrolizumab)，抗CTLA-4(ipilimumab)以及抗PD-1/CTLA-4联合治疗方案(nivolumab-ipilimumab)。

目前，专家们对“免疫检查点抑制剂”治疗各类恶性肿瘤的经验越来越丰富，更多的肿瘤病种纳入到了免疫治疗的范畴。同时，医学专家们还在不断探索其他肿瘤治疗方式与免疫治疗的联合应用模式，力争进一步提高恶性肿瘤的治疗疗效。但是，尽管免疫检查点抑制剂可以暂时重新激活CTL，增强肿瘤控制力，如果效应性记忆T细胞受损，那么临床反应可能会消退，引起获得性耐药或停药后肿瘤复发。

为解决上述技术问题，本发明提供一种全新的用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂，可以高效、无副作用的辅助治疗多种实体瘤及非实体瘤，以达到缓解疼痛、减缓病程和/或治愈的目的。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂，所述免疫检查点抑制剂为一种靶向人ILDR2的抗体。

进一步地，所述多肽功能片段包含轻链和重链；所述轻链包含CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述重链包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步地，所述抗体及其功能片段为抗人ILDR2嵌合抗体和/或其活性片段。

进一步地，所述抗体及其功能片段为抗人ILDR2人源化抗体和/或其活性片段。

进一步地，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

进一步地，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

进一步地，所述抗体包含选自人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任一Fc端的氨基酸序列。

进一步地，所述免疫检查点抑制剂的生产步骤包括：在培养基中和合适的培养条件下培养含有上述抗体的宿主细胞；从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收产生的抗体及其活性片段并与药学上可接受的载体制成免疫检查点抑制剂。

进一步地，所述免疫检查点抑制剂可以抑制癌症进程，所述癌症包括但不限于白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。

本领域公知，抗原结合功能区是指可以与目标分子如抗原发生特异性相互作用的区域，其作用具有高度选择性，识别一种目标分子的序列通常不能识别其他分子序列。

代表性的抗原结合功能区包括：抗体的可变区、抗体可变区的结构变构体、受体的结合域、配体结合域或酶结合域。

IgG是免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)的缩写，是血清主要的抗体成分，根据IgG分子中的r链抗原性差异，人IgG有四个亚型：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。

抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。

本发明的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、噬菌体展示系统、酵母、植物细胞、动物细胞。

药学上可接受的载体是指是指药学领域常规的免疫检查点抑制剂载体，包括但不限于稀释剂、赋形剂和水等；包括但不限于粘合剂如明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；包括但不限于促吸收剂如季铵化合物；包括但不限于表面活性剂如十六烷醇、十二烷基硫酸钠等。

本发明的单克隆抗体特别是RCA-2933能够很好地特异性与ILDR2结合，并且能够十分有效地抑制其ILDR2免疫作用，具有用于抑制白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤的癌症进程。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。

实施例1：获得新型ILDR2嵌合抗体

小鼠免疫使用6至8周龄雌性BALB/c小鼠作为实验动物(购自上海加科生物科技股份有限公司)，首次免疫使用50μg人ILDR2蛋白(购自北京义翘神州生物技术有限公司)与完全福氏佐剂充分混合形成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠腹腔，每隔2周进行加强免疫，加强免疫使用25μg人ILDR2蛋白与不完全福氏佐剂充分混合形成乳液，按0.5ml/只注射量注射小鼠腹腔，加强免疫3次，末次免疫一周后，取小鼠静脉血并分离血清，用ELISA法测定获得抗体的效价，选择效价高的小鼠细胞制备杂交瘤制备单脾细胞悬液。

取对数生长的骨髓瘤细胞(SP2/0)，不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10的比例混合在一起，在离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm离心8分钟后弃上清，将细胞沉淀均匀后置于40℃水浴中预热，向细胞沉淀中加入预热至40℃的PEG-4000 1ml，出现颗粒后，一分钟内加25ml预热至40℃的不完全培养基以终止PEG-4000作用。室温静置，加入2ml HAT培养基，轻吹沉淀细胞使其悬浮，混匀后补充HAT培养基至离心管内的脾细胞浓度达到2×10⁶/ml，将上述脾细胞悬浮液分装至96孔板上，培养并观察杂交瘤细胞生长情况，待细胞面积长至孔底面积1/2以上时，吸出上清液样品供抗体检测。

筛选杂交瘤培养上清液的抗人ILDR2抗体。具体地，步骤一、用碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被人ILDR2(购自北京索莱宝科技有限公司，BIOSS)，包被量100μL每孔，之后用缓冲液洗涤3次后。步骤二、用含1％BSA的缓冲液阻断并于25℃孵育1小时，阻断量300μL/孔，孵育完成后缓冲液洗涤3次，分别向1-90号孔中加入100μL上清液样品(S1-S85)以及阳性血清(对照，CK1-5)，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次。步骤三、每孔加入100μL以比例1/10000稀释在含1％BSA缓冲液里的抗小鼠IgG抗体，所述抗小鼠IgG抗体被辣根过氧化物酶标记，25℃孵育1小时，缓冲液洗涤5次。步骤四、每孔加入100μL比色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，30℃显色10min后终止显色反应，在酶标仪上读取450nm处的吸光度，根据OD450nm的强弱选取能够分泌人ILDR2结合抗体的阳性克隆。

将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先按照说明书使用RNAprep Pure试剂盒(Tiangen)提取细胞mRNA。之后使用QuantScript RT试剂盒(Tiangen)合成cDNA第一链。将逆转录产生的cDNA第一链用于后续PCR反应，将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中，挑取单克隆进行DNA测序，测序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

经过PCR扩增得到抗体轻链可变区和抗体重链可变区，排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1氨基酸序列如SEQ ID NO:1；CDR-L2氨基酸序列如SEQ ID NO:2、CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；重链的三个互补决定区CDR-H1氨基酸序列如SEQ ID NO:4、CDR-H2氨基酸序列如SEQ ID NO:5、CDR-H3氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；抗体轻链恒定区氨基酸序列来源自鼠源IgVH4-21*07、抗体重链恒定区序列序列鼠源IgVH2-09*01，轻链全长序列为将抗体轻链可变区和轻链恒定区连接即得；重链全长序列为将抗体重链可变区和重链恒定区连接即得，将上述可变区序列及恒定区序列分别克隆到真核细胞表达载体LRET-713(载体骨架pEGFP-N1)中。将抗体轻链及抗体重链表达载体转染293F细胞系(购自上海复祥生物科技)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的表达培养基中，细胞密度为150×10⁵细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为42.13μg/mL，加入线性聚乙烯亚胺至终浓度为60μg/mL。将上述混合物放入细胞培养箱120rpm，37℃培养1小时，之后向培养液中加入新鲜培养基至终体积为20倍转染体积，继续培养5～6天后收集上清。

实施例2：检测抗人ILDR2嵌合单抗

检测实施例1获得的抗人ILDR2嵌合单抗(以下简称Anti-ILDR2-M)与其抗原结合的动力学常数，利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。具体地，将Anti-ILDR2-M溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并偶联到CM芯片上，之后用1M乙醇胺封闭。在结合阶段，将不同浓度的Anti-ILDR2-M以30μL/min的速度注入3min，在解离阶段，用PBS缓冲溶液以30μL/min的速度注入10min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore3000软件进行分析计算。Anti-ILDR2-M的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表1所示。

表1.Anti-ILDR2-M与其抗原结合的动力学常数

测定Anti-ILDR2-M的体内中和活性。具体地，选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠(购自广东省医学实验动物中心)。随机分成三组，每组10只，按3三个剂量水平0.5nmol/kg,5nmol/kg，50nmol/kg分别给予各组Anti-ILDR2-M(静脉注射，单次给药)。给药一小时后，给每只小鼠皮下注射人10μg ILDR2，注射2小时后，对各小鼠进行眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样约45分钟左右至凝血，离心获取血清样品，采用ELISA试剂盒(CCK)按说明书测定血清中小鼠CCK的浓度，结果显示，Anti-ILDR2-M能够抑制人ILDR2刺激小鼠分泌的CCK的水平，基本能将小鼠CCK水平降低至未刺激状态。

测定Anti-ILDR2-M的在大鼠体内的药代动力学研究，具体地，选用6-8周龄雌性SD大鼠(购自广东省医学实验动物中心)。随机分成三组，每组5只，各组分别给予10nmol/kgAnti-ILDR2-M(静脉注射，单次给药)。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。ELISA测定血清中Anti-ILDR2-M，测试结果表明，单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的Anti-ILDR2-M的药代参数如下：半衰期t1/2为512小时；药时曲线下面积AUClast为52139nM.hr；估算零浓度C0为496nM；表观分布容积Vd为121mL/Kg；清除率CL为0.193mL/hr/kg；平均驻留时间MRTlast为168小时。

实施例3：制备新型人源化ILDR2抗体

人源化形式的抗人ILDR2抗体参考Molecule Immunol的制备方法制备，在Germline数据库中选取与Anti-ILDR2-M非CDR区匹配最好的人源化模板，其中重链可变区的模板为人源IgVH4-28*03，轻链可变区的模板为人源IGKV1-16*02，将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人模板的CDR区得到人源化抗体重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，得到人源化抗体轻链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。通过序列比对选择适合位点进行回复突变，获得的重链可变区氨基酸序列(VH)及轻链可变区氨基酸序列(VL)如表2所示。

表2.重链可变区氨基酸序列及轻链可变区氨基酸序列

VH	SEQ ID NO
		ORI	SEQ ID NO:7
RCA-2931	SEQ ID NO:9
		RCA-2932	SEQ ID NO:10
RCA-2933	SEQ ID NO:11
		RCA-2934	SEQ ID NO:12
VL	SEQ ID NO
		ORI	SEQ ID NO:8
RCA-2931	SEQ ID NO:13
		RCA-2932	SEQ ID NO:14
RCA-2933	SEQ ID NO:15
		RCA-2934	SEQ ID NO:16

将人源化的抗人ILDR2单抗的重链可变区(SEQ ID NO：9-12)与人抗体IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:17)连接，分别得到对应的重链全长序列。将人源化的抗人ILDR2单抗的轻链可变区(SEQ ID NO：13-16)与人抗体Kappa轻链的恒定区(SEQ ID NO:18)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将上述所有重链全长序列与轻链全长序列组合得到人源化抗体全长序列，经酶切连接入LRET-713(载体骨架pEGFP-N1)载体中。

实施例4：检测人源化ILDR2单抗

检测实施例3获得人源化ILDR2单抗(测试组编号：ORI、RCA-2931、RCA-2932、RCA-2933、RCA-2934)与其ILDR2抗原结合的动力学常数，利用仪器光学表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。具体地，将待检测人源化ILDR2单抗分别溶于的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.0)中并注入偶联到CM芯片上，之后用1M乙醇胺封闭。在结合阶段，将不同测试组的人源化ILDR2单抗以30μL/min的速度注入3min，在解离阶段，用PBS缓冲溶液以30μL/min的速度注入10min，结合动力学常数和解离动力学常数通过Biacore3000软件来进行分析计算。人源化ILDR2单抗的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数如表3所示。

表3.人源化ILDR2单抗与其抗原结合的动力学常数

测定人源化ILDR2单抗在大鼠体内的药代动力学研究，具体地，选用6-8周龄雌性SD大鼠(购自广东省医学实验动物中心)。随机分成五组(编号测试组1、测试组2、测试组3、测试组4、测试组5，每组10只)，测试组1给予10nmol/kg RCA-2931(静脉注射，单次给药)；测试组2给予10nmol/kg RCA-2932(静脉注射，单次给药)；测试组3给予10nmol/kg RCA-2933(静脉注射，单次给药)；测试组4给予10nmol/kg RCA-2934(静脉注射，单次给药)；测试组5给予10nmol/kg Anti-ILDR2-M(静脉注射，单次给药)。分别在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、2小时、3小时、6小时、9小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时眼眶采血并不予抗凝，室温放置血样45分钟至凝血后，离心获得血清样品，血清样品冷冻于-80℃待测。

单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的Anti-ILDR2-M(ORI组)的药代参数如下：半衰期t_1/2为512小时，药时曲线下面积AUC_last为52139nM.hr，估算零浓度C0为496nM，表观分布容积Vd为121mL/Kg，清除率CL为0.193mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为168小时。

单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的RCA-2931的药代参数如下：半衰期t_1/2为487小时，药时曲线下面积AUC_last为46139nM.hr，估算零浓度C0为486nM，表观分布容积Vd为119mL/Kg，清除率CL为0.181mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为176小时。

单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的RCA-2932的药代参数如下：半衰期t_1/2为502小时，药时曲线下面积AUC_last为51132nM.hr，估算零浓度C0为523nM，表观分布容积Vd为124mL/Kg，清除率CL为0.197mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为201小时。

单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的RCA-2933的药代参数如下：半衰期t_1/2为462小时，药时曲线下面积AUC_last为47141nM.hr，估算零浓度C0为456nM，表观分布容积Vd为101mL/Kg，清除率CL为0.173mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为179小时。

单次静脉注射的剂量为10nmol/kg的RCA-2934的药代参数如下：半衰期t_1/2为490小时，药时曲线下面积AUC_last为48593nM.hr，估算零浓度C0为398nM，表观分布容积Vd为116mL/Kg，清除率CL为0.177mL/hr/kg，平均驻留时间MRT_last为181小时。

由结果可见，人源化ILDR2单抗与其抗原结合能力强，其中以测试组RCA-2933、RCA-2934与抗原结合能力更为突出，RCA-2931、RCA-2932结合能力弱于RCA-2933、RCA-2934但是优于ORI租，人源化ILDR2单抗在大鼠体内的药代动力学接近嵌合抗体。

实施例5人源化ILDR2单抗的药效研究

检测抗人ILDR2人源化单抗(RCA-2933)对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用。实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景，北京百奥赛图基因生物技术有限公司提供)。小鼠适应环境后，取9只小鼠，每只小鼠右腋下注射H22肿瘤细胞，注射部位发生癌变，小鼠肿瘤生长明显，切片结果证明试验成功，模型构建完成，小鼠荷瘤，观察肿瘤生长，记录体重，按肿瘤体积分组，每组3只小鼠，S1,S2,S3(体积最大，约等于150mm³)；S4,S5,S6(体积中等，约等于120mm³)；S7,S8,S9(体积中等，约等于100mm³)；S3,S6,S9设置为溶媒对照组(注射等体积生理盐水)，S1,S4,S7给药剂量为50nmol/kg，S2,S5,S8给药剂量为20nmol/kg，腹腔注射，每周给药2次，连续给药4周。自给药之日起，每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b²)/2，结果如表4所示。

表4.肿瘤体积测定表

由表4可见，抗人ILDR2人源化单抗(RCA-2933)具有抗肿瘤活性，显著抑制了接种H22肿瘤细胞的小鼠移植瘤的生长，其中，RCA-2931针对大体积或中等体积肿瘤的抑制效果更为显著。

检测抗人ILDR2人源化单抗(RCA-2932)对接种于小鼠肿瘤移植物的生长抑制作用。实验材料选用人8周龄雌性小鼠(C57BL/6背景，北京百奥赛图基因生物技术有限公司提供)。小鼠适应环境后，取9只小鼠，每只小鼠右腋下注射H22肿瘤细胞，注射部位发生癌变，小鼠肿瘤生长明显，切片结果证明试验成功，模型构建完成，小鼠荷瘤，观察肿瘤生长，记录体重，按肿瘤体积分组，每组3只小鼠，A1,A2,S3(体积最大，约等于150mm³)；A4,A5,S6(体积中等，约等于120mm³)；A7,A8,S9(体积中等，约等于100mm³)；S3,S6,S9设置为溶媒对照组(注射等体积生理盐水)，A1,A4,A7给药剂量为50nmol/kg，A2,A5,A8给药剂量为20nmol/kg，腹腔注射，每周给药2次，连续给药4周。自给药之日起，每周测量1次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积＝(a x b²)/2，结果如表5所示。

表5.肿瘤体积测定表

由表4可见，抗人ILDR2人源化单抗(RCA-2932)具有抗肿瘤活性，显著抑制了接种H22肿瘤细胞的小鼠移植瘤的生长，其中，RCA-2932针对中等体积或小体积肿瘤的抑制效果更为显著。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 杭州伽南企业管理有限公司

<120> 一种用于癌症治疗的免疫检查点抑制剂

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR1-L

<400> 1

Gln Ala Gln Arg Val Lys His Gly Arg Cys His Ala Gln

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR2-L

<400> 2

Gln Trp Glu His Thr Ala Arg

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR3-L

<400> 3

Ala Arg Phe Ser Gly Asn Glu Leu Trp Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR1-H

<400> 4

Cys Asn Ser Asp Arg Tyr Met Glu Met

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR2-H

<400> 5

Asp Glu Phe Val Trp Gln Arg

1 5

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> CDR3-H

<400> 6

Ser Ser Leu Arg Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gln Val Ala Trp Val Gln Trp Gln Leu Pro Lys Trp Ser Ile Val Ser

1 5 10 15

Asp Lys Phe Tyr Ser Cys Thr Asp Tyr Cys Asn Ser Asp Arg Tyr Met

20 25 30

Glu Met Trp Glu Trp Val Phe Ala Leu Glu His Gly Gln Ala Asn His

35 40 45

Phe Cys Asp Glu Phe Val Trp Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile

50 55 60

Thr Met Arg Asp Gly Arg Asn Asn Ser Asp Ala Arg Ser Arg Val Gly

65 70 75 80

Thr Lys Ala Ala Ile Ile Gly Trp Pro Val Gly Trp Cys Trp Ala Trp

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Ser Leu Arg Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

100 105 110

Cys Ala Arg Val Thr Val Ser Ser Phe Ser

115 120

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Arg Ile Thr Ala Cys Arg Asp Leu

1 5 10 15

Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Cys Gln Ala Gln Arg Val Lys His

20 25 30

Gly Arg Cys His Ala Gln Trp Tyr Gln Ala Arg Lys Thr Gln Asn Leu

35 40 45

Leu His Arg Glu Ile Trp Gln Trp Glu His Thr Ala Arg Ser Glu Ile

50 55 60

Ile His Phe Ala Asn Met Pro Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Tyr Thr

65 70 75 80

Asn Ala Val Cys Tyr Asn Glu Val Ser Cys Gln Gly Val Cys Ala Arg

85 90 95

Phe Ser Gly Asn Glu Leu Trp Asp Gln Ala Cys Asp Gly Ser Tyr His

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VH RCA-2931

<400> 9

Gln Val Ala Trp Val Gln Ile Gln Leu Pro Lys Trp Ser Ile Val Ser

1 5 10 15

Asp Lys Phe Tyr Ser Cys Thr Asp Tyr Cys Asn Ser Asp Arg Tyr Met

20 25 30

Glu Met Trp Glu Trp Val Phe Ala Leu Glu His Gly Gln Ala Asn His

35 40 45

Phe Cys Asp Glu Phe Val Trp Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile

50 55 60

Thr Met Arg Asp Gly Arg Asn Ser Ser Asp Ala Arg Ser Arg Val Gly

65 70 75 80

Thr Lys Ala Trp Ile Ile Gly Trp Pro Val Gly Trp Cys Trp Ala Trp

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

100 105 110

Cys Ala Arg Val Thr Val Ser Ser Phe Ser

115 120

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VH RCA-2932

<400> 10

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1 5 10 15

Asp Lys Phe Tyr Ser Asn Thr Asp Tyr Cys Asn Ser Asp Arg Tyr Met

20 25 30

Glu Met Trp Glu Trp Val Phe Ala Leu Glu His Gly Gln Ala Asn His

35 40 45

Phe Cys Asp Glu Phe Val Trp Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile

50 55 60

Thr Met Arg Asp Gly Arg Asn Asn Ser Asp Ala Arg Ser Arg Val Gly

65 70 75 80

Thr Lys Ala Ala Ile Ser Gly Trp Pro Val Gly Trp Cys Trp Ala Trp

85 90 95

Gly Ala Gly Ser Ser Leu Arg Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

100 105 110

Cys Ala Arg Val Thr Val Ser Ser Phe Ser

115 120

<210> 11

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VH RCA-2933

<400> 11

Gln Val Ala Trp Val Gln Trp Gln Leu Pro Lys Trp Ser Ile Arg Ser

1 5 10 15

Asp Lys Phe Tyr Ser Cys Thr Asp Tyr Cys Asn Ser Asp Arg Tyr Met

20 25 30

Glu Met Trp Glu Trp Val Phe Ala Leu Glu Leu Gly Gln Ala Asn His

35 40 45

Phe Cys Asp His Phe Val Trp Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile

50 55 60

Thr Met Arg Asp Gly Arg Asn Asn Ser Asp Ala Arg Ser Arg Val Gly

65 70 75 80

Thr Lys Ala Ala Ile Ile Gly Trp Pro Val Gly Trp Cys Glu Ala Trp

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Gly Ala Gly Ser Ser Leu Arg Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

100 105 110

Cys Ala Arg Val Thr Val Ser Ser Phe Ser

115 120

<210> 12

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VH RCA-2934

<400> 12

Gln Val Ala Trp Ser Gln Trp Gln Leu Pro Lys Trp Ser Ile Val Ser

1 5 10 15

Asp Lys Phe Tyr Ser Cys Thr Asp Tyr Cys Asn Ser Asp Arg Leu Met

20 25 30

Glu Met Trp Glu Trp Val Phe Ala Leu Glu His Gly Gln Ala Asn His

35 40 45

Phe Cys Asp Glu Phe Val Trp Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly Thr Ile

50 55 60

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65 70 75 80

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Gly Ala Gly Ser Tyr Leu Arg Ser Asp Arg Asn Asp Pro Met Trp Ala

100 105 110

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<210> 13

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VL RCA-2931

<400> 13

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Arg

<210> 14

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VL RCA-2932

<400> 14

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Arg

<210> 15

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VL RCA-2933

<400> 15

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Arg

<210> 16

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> VL RCA-2934

<400> 16

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1 5 10 15

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100 105 110

Arg