阅读说明：本技术 透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用 (Application of transparent renal cell carcinoma metabolic marker in renal cell carcinoma early screening and diagnosis product ) 是由 孙伟 刘晓燕 孙海丹 刘响 郭正光 李京 汤晓悦 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用,所述代谢标志物为12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸中的一种或全部。所述早期筛查标志物可以结合标准品用其进行人群中这两种代谢物基线的建立,可以基于正常对照的含量范围,对透明肾细胞癌患者进行早期诊断,其对后续临床应用研究的开展具有指导意义。(The invention discloses application of a metabolic marker of clear renal cell carcinoma in a renal cell carcinoma early screening and diagnosis product, wherein the metabolic marker is one or all of 12, 13-dihydroxyoctadecenoic acid or 5-L-glutamyl-alanine. The early screening marker can be combined with a standard substance to establish a baseline of the two metabolites in a population, can be used for carrying out early diagnosis on a patient with the renal cell carcinoma cell based on the content range of a normal control, and has guiding significance for the development of subsequent clinical application research.)

透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中 的应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用。

背景技术

肾癌(RCC)是第二致命的泌尿系肿瘤。临床上，肾癌主要通过超声、计算机断层扫描和磁共振成像等检测技术进行诊断[1]。目前诊断手段成本较高，同时对于较小的病灶，诊断的准确度较低。有待进一步发展新的诊断标志物。

血浆作为临床上常用的诊断体液，已广泛应用于肾癌标志物的研究。血浆代谢组学由于其高通量、高准确性的特点，是目前研究肾癌诊断标志物的热点。已经有大量的研究将血浆代谢组学应用于肾癌生物标志物的发现[2]。2016年，Hong Zheng等人收集了68名健康受试者和58名肾癌患者的血浆样本，采用核磁共振技术对血浆中的代谢组进行了表征，建立了基于生物标志物簇的早期肾癌诊断方法。确定了7种代谢物(丙氨酸、肌酸、胆碱、异亮氨酸、乳酸、亮氨酸和缬氨酸)联合使用对健康受试者的预测准确率可达91.30％，肾癌患者的预测准确率达94.74％[3]。另有研究表明肾细胞癌发生与脂质代谢失调有关[4]。2017年，Zhang,Y等研究了45例原发性透明肾细胞癌组织的脂质组学，并观察了同一肿瘤级别内脂质积累的瘤内和溜间异质性，结果发现多数侵袭性肿瘤的脂质积累较低[5]。以往的研究使用的样本量相对较小，需要使用更大的样本量进一步对潜在的血浆标志物进行验证。这对肾细胞癌的早期诊断具有重要意义。

发明内容

为了实现肾细胞癌的早期发现、早期干预，及诊断筛查，本发明的目的在于提供透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用。

本发明的还一目的是提供一种辅助肾细胞癌早期筛查和诊断的试剂盒。

高通量的血浆代谢组学有助于筛选到更加灵敏和特异的肾癌标志物。在本发明中，我们收集了共计143例透明肾细胞癌血浆和204例年龄性别相匹配的正常人的血浆，采用非靶向联合靶向代谢组方法对血浆代谢组进行定性定量分析。通过对OPLS-DA监督聚类分析，差异倍数分析和T检验分析，筛选出29个潜在的生物标记物。进一步数据分析发现其中2种代谢物组合使用对肾癌组具有很好的区分，具有良好的临床应用前景

为实现上述目的，本发明首先提供透明肾细胞癌代谢标志物在肾细胞癌早期筛查和诊断产品中的应用，所述代谢标志物为12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸中的一种或全部。

更优选的，所述代谢标志物为12,13-双羟基十八碳烯酸和5-L-谷酰基-丙氨酸组合代谢标志物。

在具体的实施方案中，所述代谢标志物12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸在透明肾细胞癌患者中显著下调(低于健康对照者水平)。健康对照是指未患有透明肾细胞癌及其他疾病的健康个体。

所述代谢标志物筛查是在受试者的血浆样本中测定的。

其次，本发明利用所述代谢标志物筛查和诊断透明肾细胞癌的步骤为：(1)获取受试者血浆样本；(2)检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物的浓度；(3)将受试者代谢物浓度与健康对照者代谢物浓度比较；(4)相较于健康对照，所述代谢标志物含量降低及其组合含量降低指示所述受试者患有透明肾细胞癌。

所述受试者是人。

优选的，检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物浓度的方法包括质谱法、核磁共振分析、酶速法。

优选的，检测受试者样本中所述一种或多种代谢标志物浓度的方法为质谱法，所述质谱法为液相色谱-高分辨质谱。

优选的，当采用质谱法确定代谢物水平时，在获得血浆样本的步骤之后，还可以包括代谢物提取，蛋白去除步骤。

优选的，所述质谱法是一级全扫描模式联合靶向二级分析法。质谱全扫描模式是同时采集质量范围100m/z到1000m/z内的所有小分子一级信息，通过多元统计分析筛选差异代谢物，进一步对差异代谢物进行靶向二级碎裂，结合数据库二级谱图，最终确定差异分子。

优选的，所述早期筛查和诊断产品包括诊断制剂、试剂盒或芯片。

进一步地，本发明还提供了一种辅助肾细胞癌早期筛查和诊断的试剂盒或芯片，所述试剂盒或芯片包括检测12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸这些标志物组的浓度的试剂。

在一

具体实施方式

中，所述试剂盒或芯片包括：

(1)标准品：12,13-双羟基十八碳烯酸,二氨基庚二酸或5-L-谷酰基-丙氨酸，所述标准品分别特异性识别12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸的抗体；

(2)血浆样本处理液：所述血浆样本处理液用于预处理来自受试者的血浆样品，所述血浆样本处理液包括甲醇-氯仿混合溶液，二氯甲烷加入10％的乙酸乙酯，或正己烷溶液。

本发明的有益效果如下：

本发明公开了与肾细胞癌相关的代谢标志物，并进一步证实所述代谢物可以作为检测肾细胞癌的早期筛查标志物。所述早期筛查标志物可以结合标准品用其进行人群中这两种代谢物基线的建立，可以基于正常对照的含量范围，对透明肾细胞癌患者进行早期诊断，其对后续临床应用研究的开展具有指导意义。

附图说明

图1：透明肾细胞癌和对照组血浆代谢谱PCA分类图。

图2：透明肾细胞癌和对照组血浆代谢谱OPLS-DA分类图。

图3：两种代谢物组合预测样本组1透明肾细胞癌的ROC曲线。

图4:两种代谢物联合区分样本组2透明肾细胞癌样本ROC曲线。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

然而，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测血浆中代谢物，通过多元统计分析筛选与透明肾细胞癌相关的代谢物。标志物的鉴定是采用二级靶向分析方法，通过对二级碎片的匹配或者解析进行。

实施例1基于LC-MS平台筛选差异代谢标志物

材料与试剂

1)仪器：Waters H-clas(Waters公司)LTQ-Orbitrap velos pro质谱仪(Thermofisher Scientific公司)。

2)主要试剂：乙腈(Thermofisher Scientific公司)；C18反相色谱柱(3.0mm×100mm,C18,1.7μm,Waters公司)。

3)样本1：98例透明肾细胞癌患者的血浆和135例年龄、性别匹配的正常对照组的血浆，来自北京协和医院。

1.1人血浆样品

本实施例中，我们分析了143例透明肾细胞癌血浆和204例年龄性别相匹配的正常人的血浆，具体为收集空腹血液，置于放有抗凝剂的分离管中，2小时后分离血浆，存于-80度冰箱中待分析。

1.2代谢物提取

取50ul血浆，加150ul水稀释，加400ul乙腈沉淀蛋白，涡旋，4度静置60min,14000g离心10min，取上清,离心浓缩，用200ul 2％乙腈水复溶，14000g离心10min，过10kD滤膜后取10ul进样。

1.3液相分析

Waters H-class

色谱柱：waters BEH C18(3.0X100mm,1.7um),柱温50℃；流动相A为0.1％甲酸水，流动相为乙腈；分析梯度为：0-1min，2％B；1-8min,2％B-98％B；8-8.1min,98％B-100％B；8.1-12min,100％B；12-12.1min,100％-2％B；12.1-17min，2％B；流速为0.5ml/min；进样体积为10ul.

1.4质谱分析

UPLC质谱串联LTQ-Orbitrap velos(Thermo Fisher Scientific,SanJose,CA,USA)质谱，采用电喷雾离子源正离子模式；鞘气为氮气和辅助气，流速分别为45arbitraryunits and 10arbitrary units；质谱扫描范围为100–1000m/z；spray voltages设为4.2KV；离子传输管温度350℃。数据采用高分辨傅里叶转换模式(FT)获取，一级分辨率为60000；二级分辨率为15000.

1.5质谱数据分析

由UPLC-LTQ orbitrap获得的原始数据，采用Waters公司的商业组学分析软件progenesis QI(Version 2.0,Nonlinear Dynamics,UK)进行处理。该软件可自动完成峰对齐，峰识别和峰校正等前处理程序，最终输出三维矩阵，即由保留时间和精确质荷比组成的谱峰索引变量、样本名称和峰强度/面积组成。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-P software 14.0(Umetrics AB,Umea,Sweden)进行PCA分析，可视化组间变化趋势。组间差异变量通过OPLS-DA模型获取的VIP值进行筛选，VIP值大于1，非参检验p值小于0.05的变量认为是组间显著性差异变量，筛选为透明肾细胞癌早期潜在标志物。对筛选的差异变量进行二级碎裂，采用HCD(High collision dissociation)碎裂方式，根据具体代谢物选择20,40,60eV能量。将二级碎片采用progenesis QI软件进行解卷积，搜索HMDB(HUMANMETABOLOME DATABASE)数据库，确定差异代谢物结构，以HMDB数据库编号表示。

1.6血浆代谢组区分透明肾细胞癌和对照组

非监督PCA得分图显示(图1)透明肾细胞癌组和对照组呈现出一定的区分度。进一步采用监督OPLS-DA构建模型,两组区分度更加明显(图2)。在筛选出的差异代谢物，进一步应用ROC曲线评估差异代谢物对透明肾细胞癌的预测准确性。结果显示有27个代谢物的曲线下面积(AUC)均大于0.7，提示均有较好的预测价值。

表1两种差异代谢物含量信息

12,13-双羟基十八碳烯酸和5-L-谷酰基-丙氨酸酸对透明肾细胞癌的预测效果较好，它们的含量变化及统计学差异见表1。我们对12,13-双羟基十八碳烯酸和5-L-谷酰基-丙氨酸酸代谢物测试的曲线下面积(AUC)分别为1和0.71(表2)，提示这两个代谢物有较好的预测价值。

表2两种代谢物组合进行透明肾细胞癌早期诊断

数据库编号	名称	AUC	p值
				HMDB06248	5-L-谷酰基-L-丙氨酸	1.00	3.94E-18
HMDB04705	12,13-双羟基十八碳烯酸	0.71	0.022294

我们期望多个代谢物联合应用，可以更好的预测疾病的发生，进而采用逻辑回归算方法优化模型，最后得出2个代谢物，12,13-双羟基十八碳烯酸(数据库编号HMDB04705),5-L-谷酰基-丙氨酸酸(数据库编号HMDB06248)联合应用可以达到较好的预测效果，AUC值为0.936(图3)。

实施例2应用例

2.1取样

本实施例中，我们分析了45例透明肾细胞癌血浆和69例年龄性别相匹配的正常人的血浆，具体为收集空腹血液，置于放有抗凝剂的分离管中，2小时后分离血浆，存于-80度冰箱中待分析。

2.2检测

我们用液相色谱-高分辨质谱(LC-MS)通过全扫描模式检测114例样本血浆中代谢物12,13-双羟基十八碳烯酸，5-L-谷酰基-丙氨酸酸含量。，具体如表3所示，采用ROC曲线评估两种代谢物联合应用对透明肾细胞癌的预测效果。结果显示联合预测的AUC值为0.946(图4)。具有良好的应用前景。验证了这两种代谢标志物用作辅助肾细胞癌早期筛查和诊断的可靠性。

表3两种代谢物组合进行透明肾细胞癌早期诊断

数据库编号	名称	AUC	p值
				HMDB06248	5-L-谷酰基-L-丙氨酸	0.89	2.13E-12
HMDB04705	12,13-双羟基十八碳烯酸	0.90	3.37E-11

实施例3早期诊断试剂盒

所述试剂盒包括：

(1)标准品：12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸，所述标准品分别特异性识别12,13-双羟基十八碳烯酸或5-L-谷酰基-丙氨酸的抗体；

(2)血浆样本处理液：所述血浆样本处理液用于预处理来自受试者的血浆样品，所述血浆样本处理液包括甲醇-氯仿混合溶液，二氯甲烷加入10％的乙酸乙酯，或正己烷溶液。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。