阅读说明：本技术 用于快速检测核酸目标分子的存在的方法 (Method for rapid detection of the presence of nucleic acid target molecules ) 是由 弗拉迪米尔·哈吉恩 奈福斯·哈科 戴利博·哈科 姚祖栩 于 2018-12-27 设计创作，主要内容包括：一种室温隔板可储存的电泳阵列,用于在一溶液中快速检测多种预先选择的核酸目标分子中的至少一种核酸目标分子的存在的一方法,所述电泳阵列包括：多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物,所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物中的每一个都含有适于对所述多种预选的核酸目标分子中的至少一个进行滚环式扩增与结合的多种材料,所述多个微凝胶沉积物中的每一个都至少含有预先锚定在其中的下列元件：特异于所述多种预选核酸目标分子中的至少一种的一RCA探针；以及至少一个引物。(A room temperature partition storable electrophoretic array for use in a method of rapidly detecting the presence of at least one of a plurality of preselected nucleic acid target molecules in a solution, the electrophoretic array comprising: a plurality of immobilized, spaced apart and electrically isolated microgel deposits, each of said plurality of immobilized, spaced apart and electrically isolated microgel deposits containing a plurality of materials suitable for rolling-circle amplification and binding of at least one of said plurality of preselected nucleic acid target molecules, each of said plurality of microgel deposits containing at least the following elements pre-anchored therein: (ii) an RCA probe specific for at least one of the plurality of preselected nucleic acid target molecules; and at least one primer.)

用于快速检测核酸目标分子的存在的方法

相关申请

现在参考2018年7月5日公开的WO 2018/122856，2018年7月5日公开的WO 2018/122852及2018年7月4日提交的PCT/IL2018/050726，它们被认为与本申请有关，其公开内容通过引用的方式并入本文中。

在此也参考2017年12月28日提交的临时专利申请案62/610,997，其公开内容通过引用的方式并入本文中，并且在此要求所述临时专利申请案的优先权。

技术领域及先前技术

本发明涉及滚环式扩增。

发明内容

本发明旨在提供多种改进的滚环式扩增(rolling-circle amplification，RCA)的方法。

根据本发明的一优选实施例，提供一种室温隔板可储存的电泳阵列，其用于在一溶液中快速检测多种预先选择的核酸目标分子中的至少一种核酸目标分子的存在的一方法，所述电泳阵列包括：多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物，所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物中的每一个都含有适于对所述多种预选的核酸目标分子中的至少一个进行滚环式扩增与结合的多种材料，所述多个微凝胶沉积物中的每一个都至少含有预先锚定在其中的下列元件：特异于所述多种预选核酸目标分子中的至少一种的一RCA探针；以及至少一个引物。

优选的，所述多个微凝胶沉积物是脱水的，并且当暴露于含有至少一个核酸目标分子的一溶液时可再水化。另外地或可选地，所述至少一个引物包括至少一个正向引物及至少一个反向引物。

根据本发明的一优选实施例，所述RCA探针与所述至少一个引物预先杂交。

根据本发明的一优选实施例，当水合时，所述多个微凝胶沉积物中的每一个都具有一大致半球形的构型。

根据本发明的一优选实施例，所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物限定一相应的多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域；以及所述电泳阵列被用于实施一方法，所述方法包括：将所述溶液引入所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的每一个；在所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的每一个上，至少大致地同时进行滚环式扩增，同时在所述滚环式扩增的各个阶段期间向所述多个微凝胶区域施加多个电场；以及在至少一个对应的所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域上，检测所述多种预先选定的核酸目标分子中的至少一个的存在，其中所述检测发生在所述引入的一短时间内，所述短时间小于30分钟。

根据本发明的另一优选实施例，还提供一種在一溶液中快速检测多种预先选择的核酸目标分子中的至少一种核酸目标分子的存在的方法，所述方法包括：将所述溶液引入一电泳阵列上的至少多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的每一个都含有一微凝胶沉积物，所述微凝胶沉积物含有适合与所述多种预先选择的核酸目标分子中的不同分子结合并进行滚环式扩增的多种材料；在所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域处，至少大致地同时进行滚环式扩增，同时在所述滚环式扩增的各个阶段期间向所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域施加多个电场；以及检测所述多种预先选择的核酸目标分子中的至少一种核酸目标分子的存在、以及检测所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的至少一种对应的分子；其中所述检测发生在所述引入的一短时间内，所述短时间小于30分钟。

根据本发明的一优选实施例，所述检测包括光学检测。优选地，所述检测包括萤光检测。

根据本发明的一优选实施例，所述施加多个电场发生在所述滚环式扩增中的至少两个不同阶段。

优选地，在所述固定的、相互隔开且相互电隔离的多个微凝胶区域中的每一个上，所述多个电场至少大致相同。

根据本发明的一优选实施例，所述检测发生在小于20分钟的一持续时间内。更佳地，所述检测发生在小于15分钟的一持续时间内。

根据本发明的一优选实施例，在所述滚环式扩增期间，所述施加多个电场包括以下步骤中的至少一个：将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以将所述溶液中的多种核酸目标分子驱动到所述多个微凝胶沉积物处；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以将所述溶液中的多种核酸目标分子与RCA探针杂交的产物驱动到所述多个微凝胶沉积物处；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以重新捕获漂离所述多个微凝胶沉积物的多个RCA扩增子；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以将多个RCA探针驱动到所述多个微凝胶沉积物中，从而与已经结合到所述多个微凝胶沉积物的多个捕获探针及多个引物中的至少一个进行杂交；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以从所述多个微凝胶区域中移除多种不需要的分子；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以延长与所述多个微凝胶沉积物结合的多个RCA扩增子；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以压缩与所述多个微凝胶沉积物结合的多个RCA扩增子；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以在与所述多个微凝胶沉积物结合的多个RCA扩增子附近搅拌多种RCA试剂；将一电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以提高RCA中酶活性的速度；以及将依次逆转极性的电场施加到所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，以增强多个RCA扩增子与所述多个微凝胶沉积物结合的严格性。

根据本发明的另一优选实施例，所述电泳阵列包括在一室温隔板可储存的电泳阵列。

优选地，所述电泳阵列包括：多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物，所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物中的每一个都含有适于对所述多种预选的核酸目标分子中的至少一个进行滚环式扩增与结合的多种材料，所述多个微凝胶沉积物中的每一个都至少含有预先锚定在其中的下列元件：特异于所述多种预选核酸目标分子中的至少一种的一RCA探针以及至少一种引物。

图示说明

从以下结合图式的详细说明中，将更全面地理解且领会本发明，其中：

图1A及图1B是根据本发明的一优选实施例中，一电泳阵列的组件构造及操作的多个简化组装图及分解视图，所述电泳阵列包括在滚环式扩增(RCA)的操作期间的多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域；

图2A及图2B是图1A及图1B的所述电泳阵列组件的简化组装图及分解视图，所述电泳阵列包括：多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，其处于一脱水储存的操作取向；

图3A、图3B、图3C、图3D、图3E、图3F、图3G、图3H及图3I都是用于制造图1A至图2B的实施例中所采用的所述电泳阵列的一优选方法的一简化图示；

图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G、图4H、图4I及图4J是根据本发明的一个实施例中，快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个典型步骤的多个简化图示；

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E、图5F、图5G、图5H、图5I及图5J是根据本发明的一个实施例中，快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个典型步骤的多个简化图示；

图6A、图6B、图6C、图6D、图6E、图6F、图6G、图6H、图6I及图6J是根据本发明的一个实施例中，快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个典型步骤的多个简化图示；

图7A、图7B、图7C、图7D、图7E、图7F、图7G、图7H、图7I及图7J是根据本发明的一个实施例中，快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个典型步骤的多个简化图示；

图8是总结示例I的结果的一图示；以及

图9是总结示例II的结果的一图示。

具体实施方式

现在参考图1A及图1B，图1A及1B是根据本发明的一优选实施例的构造及操作的一电泳阵列组件100的简化组装图及分解视图，所述电泳阵列组件100在操作滚环式扩增(RCA)的期间，限定多个固定的、相互隔开且相互电隔离的目标特异性分子的微凝胶区域；现在参考图2A及图2B，图2A及图2B是图1A及图1B的所述电泳阵列组件的简化组装图及分解视图，其中多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域以一脱水储存的操作取向示出。应当理解，电泳阵列组件100特别适用于下文参考图7A至图7I所描述的一方法。

如图1A及图1B所示，所述电泳阵列组件100包括由一基板110、一外围壁结构120及一窗口130限定的一外壳。优选地，通过形成在基板110中的一溶液入口孔140及一溶液出口孔150以进入所述外壳的内部。

一电泳阵列160形成在基板110上，在下文中将参考图3A至图3I中更详细描述的细节。多个目标分子特异性微凝胶沉积物170优选地具有与其结合的多个不同的RCA环状探针、多个正向引物及多个反向引物，在本文中通常用一符号形式的参考标号175表示，并且固定在多个分离的工作电极位置180上，由所述电泳阵列160限定。在图1A及图1B中，所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170以适于滚环式扩增的一操作取向显示。

在图2A及图2B中，所述目标分子特异性微凝胶沉积物以适于储存的一脱水状态显示，并用参考标号190表示。应当理解，当水合时，图2A及2B的多个目标分子特异性微凝胶沉积物190，通过向所述电泳阵列组件100的内部提供一合适的溶液，所述溶液优选地含有核酸目标分子的溶液，优选地呈现图1A及图1B中所示的操作取向，其以附图标号170表示。

所述电泳阵列组件100及其各种部件的多种优选尺寸，为了便于计算，假设暴露于溶液的每个微凝胶沉积物170呈现一大致半球形状，如下：

溶液体积：约100立方毫米。

基板110及窗口130之间的内部高度：0.8毫米至2.0毫米。

在图1A及图1B的操作取向上，多个目标分子特异性微凝胶沉积物170在基板110上方的高度：0.5毫米至1.25毫米。

在图2A及图2B的操作取向上，多个目标分子特异性微凝胶沉积物190在基板110上方的高度：0.1毫米至0.3毫米。

在图1A及图1B的操作取向上，每个目标分子特异性微凝胶沉积物170在基板110上方的表面积：0.0016平方毫米至0.009平方毫米。

暴露于溶液的每个目标分子特异性微凝胶沉积物170的表面积与溶液体积的比率：每立方毫米的溶液中具有0.000016平方毫米至0.00009平方毫米的微凝胶沉积物的暴露表面积。

应当理解，溶液体积中的实际表面积及表面积的实际比率大于或等于经由一半球形状的简化假设计算后的所述表面积及比率。

现在将介绍所述电泳阵列组件100的结构及构造，并参考图3A至图3I。

首先参考图3A，可以看出基板110通常是一聚酯片材，例如：聚对苯二甲酸乙二醇酯，优选的厚度为0.1毫米。在此阶段，优选地通过雷射切割，基板110可以设置具有溶液入口孔140及溶液出口孔150。或者，溶液入口孔140及溶液出口孔150可以在一稍后阶段形成在基板110中。

现在参考图3B，可以看出基板110形成具有一高导电材料的一初始图案层200，其优选地通过Henkel 479SS墨水的丝网印刷而形成。优选地，层200的厚度为0.03毫米。层200提供均匀的电流传导到所述电泳阵列组件100中的每一个微凝胶沉积物。

图3C示出随后形成的一碳层210，所述碳层与所述初始图案层200配准，并且优选地通过杜邦7102及BQ 221的丝网印刷来完成。优选地，层210的厚度为0.03毫米。层210用作所述工作电极材料，所述工作电极材料暴露于所述溶液，如下文所述。层210还控制施加在一内部工作电极230及一外部相对电极240之间的电压。

相互配准的层200及层210一起限定外部相对电极240及内部工作电极230，所述外部相对电极240及所述内部工作电极230连接到相应的多个电极触点250及260。

现在另外参考图3D，可以看出在多个层200及层210上以及在基板100上方形成一图案化的电介质层270，优选地，通过CMI-101-8079SS墨水的丝网印刷来完成，所述墨水可以从Creative Materials公司购得(Ayer，MA)。优选地，电介质层270的厚度为0.04毫米。

如图3D所示，电介质层270优选地形成具有多个孔272及274，所述孔272及274优选地在尺寸及位置上对应于溶液入口孔140及溶液出口孔150。电介质层270还优选地设置具有多个细长孔276及278，其覆盖相对电极240的多个部分。多个细长孔276及278中的每一个的长度优选地为100毫米。此外，电介质层270形成具有多个孔280，这里示出为八个孔280的一阵列，其覆盖工作电极230并限定分离的工作电极的位置180(图1B及图2B)。优选地，多个孔280都是相同的多个圆形孔，其直径为0.2毫米至0.5毫米，多个孔280之间的一最小间距为1毫米。

现在参考图3E，通过在多个工作电极位置180上进行机械式点样(roboticspotting)，可以看到形成多个微凝胶沉积物300的一阵列。优选地，多个微凝胶沉积物300在水合时具有一大致半球形且所述电介质层270的平面中的直径为0.70毫米，使得它们彼此物理地分离。优选地，所述多个微凝胶沉积物300具有0.5毫米至1.2毫米的一高度及0.0016平方毫米至0.009平方毫米的一暴露表面积。优选地，所述多个微凝胶沉积物300由含有链霉抗生物素蛋白的(双)丙烯酰胺水凝胶形成。

现在参考图3F，优选地，可以看出所述多个微凝胶沉积物300通过紫外线照射以聚合所述多个微凝胶沉积物300的多个组分。将组氨酸添加到所述多个微凝胶沉积物300中，然后洗涤所述多个微凝胶沉积物300以移除过量的组氨酸。

聚合之后，经由风干所述多个微凝胶沉积物300，以产生多个干燥的微凝胶沉积物310，如图3G所示。

现在参考图3H，可以看出多种不同的核酸目标分子特异性RCA环状探针320，并且优选地，多个正向引物322及多个反向引物324也与相应的不同的所述多个干燥微凝胶沉积物310结合，例如通过机械式点样从而产生不同的目标分子特异性微凝胶沉积物190(图2A及图2B)。应当理解，在所述多个附图中，多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320、多个正向引物322及多个反向引物324以符号表示且未按照比例显示。

应当理解，尽管如图3H至图3I及图1A至图2B中的实施例所示，多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320、多个正向引物322及多个反向引物324均显示为与多个微凝胶沉积物310结合，在多个替代实施例中，多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320中的一个或多个、多个正向引物322及多个反向引物324可以不与多个微凝胶沉积物310结合，并且可以与所述多个核酸目标分子一起在一溶液中提供。在图3H至图3I所示的所述实施例中以及在所述替代的多个实施例中，所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320、多个正向引物322及多个反向引物324位于所述固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性微凝胶区域中，如下文中参考图5A至图7J所述。

如图3I所示，在适当洗涤所述多个目标分子特异性微凝胶干燥的微凝胶沉积物190并添加棉子糖(raffinose)作为一防腐剂之后，将所述周围壁结构120及所述窗口130组装到所述基板110上，从而完成制造如上文中的参考图2A及图2B所述的处于一隔板可储存状态的所述电泳阵列组件100。根据本发明的一优选实施例，所述电泳阵列组件100已经准备就绪，其提供一种从多种预先选择的核酸目标分子中快速检测至少一种核酸目标分子的存在的方法，在一解决方案中，包括以下步骤：

将所述溶液引入一电泳阵列上的至少多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域，所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的每一个都含有一微凝胶沉积物，所述微凝胶沉积物含有适合与所述多种预先选择的核酸目标分子中的不同分子结合并进行滚环式扩增的多种材料；

在所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域处，至少大致地同时进行滚环式扩增，同时在所述滚环式扩增的各个阶段期间向所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域施加多个电场；以及

检测所述多种预先选择的核酸目标分子中的至少一种核酸目标分子的存在、以及检测所述多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域中的至少一种对应的分子；

其中所述检测发生在所述引入的一短时间内，优选地，所述短时间小于30分钟，更佳地，所述短时间小于25分钟，甚至更佳地所述短时间小于20分钟。

在下文的描述中，分别参考图4A至图4J、图5A至图5J、图6A至图6J、图7A至图7J中，详细地描述执行上述方法的四种变化。上文所述的所述电泳阵列组件100特别适合用于执行图7A至图7J的所述方法。

所有这些方法都采用滚环式扩增。滚环式扩增是一种已知的技术，尤其在以下出版物中描述，其公开内容在此并入作为参考：

美国专利号5,854,033；Lizardi等人，Nature Genetics 19(3)：225-232(1998)。

Michael G.Mohsen及Eric T.Kool的Rolling Circle Amplification andRolling Circle Transcription,Acc Chem Res.2016,49(11):2540–2550M。

Peiying Feng等人的Identification and Typing of Isolates ofCyphellophora and Relatives by Use of Amplified Fragment Length Polymorphismand Rolling Circle Amplification,Journal of Clinical Microbiology,2013年Volume 51 Number 3,p.931–937。

Signal Amplification by Rolling Circle Amplification on DNAMicroarrays，G.Nallur等人的Nucleic Acids Research，2001年，Vol.29，NO.123号，e118。

M.Monsur Ali等人的Rolling circle amplification:a versatile tool forchemical biology,materials science and medicine,Chemical Society Review,Chem.Soc.Rev.,2014年,43,3324-3341。

Ali MM、Li F、Zhang Z、Zhang K、Kang D、Ankrum JA、Le XC、Zhao W.Rollingcircle amplification:a versatile tool for chemical biology,materials scienceand medicine.Chem Soc Rev.2014年；43：3324。

Kool,ET.Rolling circle synthesis of oligonucleotides andamplification of select randomized circular oligonucleotides.US.5714320.1998年2月3日。

Fire A，Xu S.Rolling replication of short DNA circles.Proc Natl AcadSci U S A.1995年；92：4641-4645。

Nilsson M、Malmgren H、Samiotaki M、Kwiatkowski M、Chowdhary BP、LandegrenU.Padlock Probes：Circularizing Oligonucleotides for Localized DNADetection.Science.1994年；265:2085–2088。

下面描述的各种方法包括相对于现有技术的滚环式扩增技术而言是新颖且不明显的多个特征。

现在参考图4A至图4J，图4A至图4J示出了根据本发明的一个优选实施例中，从多种预先选择的核酸目标分子中快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个主要阶段。

优选地，可以使用处于一隔板可储存状态的电泳阵列组件100来执行图4A至图4J的所述方法，如上文参考图2A及图2B所述，其中只有多个捕获探针与多个固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶沉积物190结合。应当理解，为简洁起见，构成所述电泳阵列160的所述基板110、所述周边壁结构120及所述窗口130以及各种层，如上文中的参考图1A至图2B所示，在图4A至图4J中则未具体显示。图4A至图4J中的每一个图是大致沿着图2A中的多条线4-4所截取的一简化侧视截面图。

图4A示出如图2A所示的处于其隔板可储存状态的所述电泳阵列组件100，所述电泳阵列组件100具有各种不同的象征性、未按照比例绘制的寡核苷酸核酸特异性捕获探针400的多个指示，例如，那些具体但不限于辨识脑膜炎传染病病原体或其他疾病，这些疾病与多个相应的不同的干燥微凝胶沉积物190结合。图4A以毫米为单位表示所述电泳阵列组件100的一优选实施例的所述内部尺寸，以及所述固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190的一般尺寸，其以多个工作电极位置180为中心但略微延伸(图1A至图3I)。

图4B示出了由一箭头401表示的包含一种或多种不同类型的核酸目标分子403的一溶液402的引入，以便填充所述电泳阵列组件100的内部。优选地，溶液402另外包括多个核酸目标分子403、多个正向引物322及多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320。

溶液402的制备不是本专利申请的一部分，并且是按照传统技术进行的，例如「Nasir Ali、Rita de Cássia Pontello Rampzzo、Alexandre Dias Tavares Costa及MarcoAurelio Krieger中所述的技术、当前的核酸提取方法以及对即时诊断的影响，BioMedResearch International Volume 2017,主题号：9306564,13页」。优选地，溶液402包括通常在所述溶液402制备期间所引入的一低导电性洗脱液，其促进多种核酸的电子定址并促进溶液402中限制酶的活性。一优选的洗脱液包括组氨酸及一限制酶缓冲液。图4B显示了在脱水状态下的所述干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190。将溶液402引入电泳阵列组件100中，使溶液402接触干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，定义一时间T0，并使干燥的目标分子特异性微凝胶沉积190呈现其水合状态，由参考标号170所指定(图1A及1B)。

图4C示出了处于一水合状态的多个固定的目标分子特异性微凝胶沉积物170，其作为引入含有多个核酸目标分子403的溶液402的结果，所述核酸目标分子403填充所述电泳阵列组件100的内部。图4C示出了所述多个水合的目标分子特异性电隔离的微凝胶沉积物170，其具有1.25毫米的一典型最大高度。优选地，所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170水合至图4C中所示的状态需要约10秒，并且优选地在时间T＝T0+10秒完成。

图4D示出了在工作电极230及相对电极240上的多个工作电极位置180之间，在施加一直流电(DC)电场(优选为10至300伏特/厘米)存在的情况下，核酸电泳定址到所述水合固定的、相互电隔离的微凝胶沉积物170处(图1A及1B)。所述多个电场线(electric fieldlines)的多个部分由多个参考标号410表示，所述电场的方向由多个箭头412表示。应当理解，所述多个电场线限定多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性的微凝胶区域420，每个区域围绕一不同的目标分子特异性微凝胶沉积物170。

应当理解，所述定址以及下文中参考图4E至图4J所描述的各种步骤不仅发生在多个微凝胶沉积物170的表面上，还发生在多个微凝胶沉积物170的所述体积内。

如图4D所示，将所述DC电场施加到所述三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性微凝胶区域420导致多种核酸目标分子403、多种核酸目标分子特异性RCA环状探针320及多种正向引物322快速运送到所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处，从而促进所述核酸目标分子403及所述核酸目标分子特异性RCA环状探针320之间的特异性杂交、所述多个正向引物322及所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320之间的特异性杂交，并且通过多个目标分子特异性捕获探针400捕获所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320，所述多个目标分子特异性捕获探针400与水合的目标分子特异性电分离微凝胶沉积物170结合。

图4D中所示的阶段的持续时间在30秒至120秒之间。优选地，图4D所示的所述阶段在时间T＝T0+[40至130]秒完成。

现在参考图4E，其示出了通常在图4D中所示的所述定址阶段之后的一连接阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下进行，优选地在与图4D的所述步骤中的所述电场相同的方向上为10至300伏特/厘米。优选地，所述连接阶段的持续时间通常为120秒至240秒。优选地，所述连接阶段在T＝T0+[160至370]秒完成。

现在参考图4F，其示出了通常在图4E中所示的所述连接阶段之后的一RCA聚合阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，在具有与图4E中的所述步骤的所述电场相同的所述方向上为10至300伏特/厘米。

优选地，所述RCA聚合阶段在一Bst聚合酶429、多种dNTP(未显示)及一反向引物324存在的情况下发生，其通过一溶液而引入电泳阵列组件100中，以及正向引物322与RCA环状探针结合，而所述RCA环状探针320又与捕获探针400结合，而捕获探针400又与目标分子特异性微凝胶沉积物170结合，优选地在65℃的一温度下结合。所述RCA聚合阶段的一结果是产生长的RCA扩增子440。如图4F所示，在聚合酶429与多种核酸目标分子特异性RCA环状探针320结合后，多种核酸目标分子403从多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320处移位，如多个箭头442所示。所述RCA聚合阶段的持续时间通常为300秒至720秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[460至1090]秒完成。

现在参考图4G，其示出了通常在图4F的所述RCA聚合阶段期间发生的一扩增子延长阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图4F的所述步骤中的所述电场相反的一个方向上为10伏特至300伏特/厘米，如箭头444所示。在所示的实施例中，扩增子440的延长发生在一箭头448所示的一方向上。优选地，所述扩增子延长阶段在一Bst聚合酶429、多种dNTP(未显示)及反向引物324存在且在65℃的一温度下进行。所述扩增子延长阶段的持续时间通常为5至15秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[465-1105]秒完成。

应当理解，图4F及图4G中所示的所述多个阶段可以间歇地重复多次，图4F所示的多个阶段中的每一阶段的一持续时间比上文所述的时间短，并且由图4G所示的一阶段分开。

现在参考图4H，其示出了通常在图4F的所述RCA聚合阶段及图4G的所述扩增子延长阶段所发生的一指数RCA扩增阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图4G的所述步骤中的所述电场相反的一个方向上为10伏特至300伏特/厘米，如箭头412所示，但优选地包括所述电场极性反转的多个短周期。在此阶段，使用反向引物324产生多个额外的扩增子450。

优选地，所述指数RCA扩增阶段在一Bst聚合酶429、多个dNTP(未显示)及反向引物324存在且在65℃的温度下发生。在图4F的所述RCA聚合阶段及图4G的所述扩增子延长阶段期间所发生的所述指数RCA扩增阶段的持续时间通常为5秒至15秒。图4F的所述RCA聚合阶段，图4G的所述扩增子延长阶段及图4H的所述指数RCA扩增阶段优选地在T＝T0+[465至1105]秒完成。

现在参考图4I，其示出了在图4F的RCA聚合阶段、图4G的所述扩增子延长阶段及图4H的所述指数RCA扩增阶段完成之后通常会发生一后RCA聚合定址阶段，优选地，在一DC电场存在的情况下，优选地在与图4H的所述步骤中的所述电场相同的一个方向上为10伏特至300伏特/厘米。所述后RCA聚合定址阶段对于浓缩扩增子440来说是特别具有帮助的，所述扩增子440在距离多个目标分子特异性微凝胶沉积物170的一距离处的溶液402中，并且在所述目标分子特异性微凝胶沉积物170处重新捕获它们，如箭头460所示，优选地，在每个微凝胶区域420内的一个位置处聚集所述多个扩增子440。所述后RCA聚合定址阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述后RCA聚合定址阶段在T＝T0+[475至1135]秒完成。

现在参考图4J，其示出了通常在所述后RCA聚合定址阶段之后的一报告阶段。优选地，所述报告阶段在与多个扩增子440、450互补的多个萤光报告子(fluorescencereporters)470存在的情况下发生，所述多个扩增子440、450通过一溶液而引入电泳阵列组件100。所述报告阶段的所述持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述报告阶段在T＝T0+[485至1165]秒完成。

在完成报告阶段及一随后的洗涤阶段(未示出)后，可以经由常规萤光检测从多种预先选择的核酸目标分子中检测至少一种核酸目标分子的存在。因此，应当理解，优选地至少一种核酸目标分子的检测应在初始供应溶液402至所述电泳阵列组件100内部的8分钟至20分钟内完成。

应当理解，如果在获取一样品的4分钟至5分钟内完成溶液402的制备(例如：通过从一患者所采集的一血液样品)则可以在12分钟至25分钟内从一样品中检测至少一种核酸目标分子。

现在参考图5A至图5J，图5A至图5J示出了根据本发明的另一个优选实施例中，从多种预先选择的核酸目标分子中快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个主要阶段。

优选地，使用处于一隔板可储存状态的一电泳阵列组件500来执行图5A至图5J的所述方法，如上文中参考图2A及图2B所述，其中多个正向引物322与所述多个固定的且相互隔开的微凝胶沉积物190结合。应当理解，为简洁起见，构成所述电泳阵列160的所述基板110、所述周边壁结构120及所述窗口130以及各个层都没有具体示出。图5A至图5J中的每一个是大致沿着图2A中的线4-4所截取的一简化侧视截面图。

图5A示出了处于干燥、脱水、操作取向、类似于图2A中所示的一电泳阵列组件500，所述电泳阵列组件500具有各种不同的寡核苷酸正向引物322的多个指示，其未按照比例绘制，并且与相应的不同的所述多个干燥微凝胶沉积物190结合。

图5A以毫米为单位表示所述电泳阵列组件500的一优选实施例的内部尺寸，以及所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190的一般尺寸。

应当理解，图5A至图5J的方法与图4A至4J的方法不同，因为在图4A至图4J的所述方法中，代替多个捕获探针400与所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190结合，在图5A至图5J的所述方法中，多个正向引物322也用作多个捕获探针并且与所述多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190结合。

图5B示出了由一箭头501表示的含有多种核酸目标分子503的一溶液502的引入，以便填充所述电泳阵列组件500的内部。所述溶液优选地包括除了多种核酸目标分子503之外的多个核酸目标分子特异性RCA环形探针320。

溶液502的制备不是本发明要求保护的一部分，并且按照常规技术进行，例如「Nasir Ali，RitadeCássiaPontelloRampazzo，Alexandre Dias Tavares Costa及MarcoAurelio Krieger，Current Nucleic Acid中描述的那些技术、提取方法及其对即时诊断的影响、BioMed Research International，2017年，文章号码：9306564，13页」。优选地，溶液502包括通常在所述溶液制备期间引入的一低导电率洗脱液，其促进核酸的电子定址并促进限制酶在溶液502中的活性。一优选的洗脱液包括组氨酸及一限制酶缓冲液。图5B显示处于脱水状态的多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190。将溶液502引入电泳阵列组件500中，使得溶液502接触干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，定义一时间T0并使干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190(图2A及2B)水合至它们的水合形式，以附图标号170表示(图1A及1B)。

图5C示出了处于一水合状态的多个固定的目标分子特异性微凝胶沉积物170，并且作为引入含有多种核酸目标分子503的溶液502的结果，所述多种核酸目标分子503填充所述电泳阵列组件500的内部。图5C示出了所述多个水合的目标分子特异性电隔离的微凝胶沉积物170，其具有1.25毫米的一典型最大高度。所述多个分子特异性微凝胶沉积物170水合至图5C所示的状态，优选地需要约10秒，并且优选地在时间T＝T0+10秒完成。

图5D示出了在一DC电场(优选为10伏特至300伏特/厘米)存在的情况下，将核酸电泳定址到多个水合的、固定的，相互电隔离的目标分子特异性微凝胶沉积物170处。所述多个电场线的多个部分由参考标号510表示，以及所述电场的所述方向由多个箭头512表示。应当理解，所述电场线限定多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域520，每一个的中心都围绕一不同的目标分子特异性微凝胶沉积物170。

应当理解，定址以及下文中参考图5E至图5J描述的各种步骤不仅发生在微凝胶沉积物170的表面上，而且还发生在所述多个微凝胶沉积物170的所述体积内。

如图5D所示，将所述DC电场施加到所述多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性微凝胶区域520导致多个核酸目标分子503及多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320快速运送到所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处，从而促进所述多个核酸目标分子503及所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320之间的特异性杂交。将多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320快速运送到所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处，也促进所述多个正向引物322之间的特异性杂交，所述多个正向引物322与所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170及所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320结合。

图5D中所示的所述阶段的持续时间在30秒及120秒之间。优选地，图5D所示的所述阶段在一时间T＝T0+[40至130]秒完成。

现在参考图5E，其示出了通常在图5D中所示的所述多个定址阶段之后的一连接阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下进行，优选地在与图5D的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述连接阶段在一连接酶528(例如：T-4连接酶)存在的情况下发生，所述连接酶528经由一溶液引入电泳阵列组件500中。所述连接阶段的所述持续时间通常为120秒至240秒。优选地，所述连接阶段在T＝T0+[160至370]秒完成。

现在参考图5F，其示出了通常在图5E中所示的所述连接阶段之后的一RCA聚合阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图5E的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述RCA聚合阶段在一Bst聚合酶529、多种dNTP(未显示)及一反向引物324存在的情况下发生，所述反向引物324经由溶液引入电泳阵列组件500，以及一正向引物322优选地在65℃下与目标分子结合特异性微凝胶沉积物170结合。所述RCA聚合阶段的一结果是产生多个长的RCA扩增子540(图5G)。如图5F所示，在聚合酶529与多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320结合后，多个核酸目标分子503从多个核酸目标目标分子特异性RCA环状探针320处移位，如箭头542所示。所述RCA聚合阶段的持续时间通常为300秒至720秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[560至1090]秒完成。

现在参考图5G，其示出了通常在图5F的所述RCA聚合阶段期间所发生的一扩增子延长阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图5F的步骤中的所述电场相反的一方向上为10伏特至300伏特/厘米，如一箭头544所示。扩增子540的延长是沿一箭头548所示的一方向发生。优选地，所述扩增子延长阶段在一Bst聚合酶529、多种dNTP(未显示)及多个反向引物324存在且在一温度为65℃的情况下发生。所述扩增子延长阶段的持续时间通常为5至15秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[565-1105]秒完成。

应当理解，图5F及5G中所示的多个阶段可以间歇地重复多次，图5F所示的多个阶段中的每一阶段的一持续时间比上文所述的时间短，并且被图5G所示的一阶段分开。

现在参考图5H，其说明了一指数RCA扩增阶段，所述指数RCA扩增阶段通常在图5F的所述RCA聚合阶段及图5G的所述扩增子延长阶段期间发生，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，在与图5G的步骤中的所述电场相反的一方向上为10伏特至300伏特/厘米，如多个箭头512所示，但优选地包括所述电场极性反转的多个短周期。在这个阶段，使用多个反向引物324产生多个额外的扩增子550。

优选地，所述指数RCA聚合阶段在一Bst聚合酶529、多种dNTP(未显示)及反向引物324存在且在65℃的一温度的情况下发生，所述反向引物324经由溶液引入电泳阵列组件500，以及一正向引物322优选地在65℃下与目标分子结合特异性微凝胶沉积物170结合。在图5F的所述RCA聚合阶段及图5G的所述扩增子延长阶段期间所发生的所述指数RCA扩增阶段的持续时间通常为5秒至15秒。优选地，图5F的所述RCA聚合阶段、图5G的所述扩增子延长阶段及图5H的所述指数RCA扩增阶段在T＝T0+[465-1105]秒完成。

现在参考图5I，其说明了一后RCA聚合定址阶段通常在图5F的所述RCA聚合阶段、图5G的所述扩增子延长阶段及图5H的所述指数RCA扩增阶段完成之后发生，并且优选地在与图5H的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。所述后RCA聚合定址阶段对于收集位于溶液502中的多个扩增子540来说是特别有用的，所述多个扩增子540与多个目标分子特异性微凝胶沉积物170相距一距离并且在所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处重新捕获它们，如多个箭头560所示，优选地，将所述多个扩增子540浓缩在每个微凝胶区域520内的一个位置。所述后RCA聚合定址阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述后RCA聚合定址阶段在T＝T0+[475至1135]秒完成。

现在参考图5J，其示出了通常在所述后RCA聚合定址阶段之后的一报告阶段。优选地，所述报告阶段在与多个扩增子540、550互补的一萤光报告子470存在的情况下发生，所述多个扩增子540、550通过一溶液而引入电泳阵列组件500。所述报告阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述报告阶段在T＝T0+[585至1165]秒完成。

在完成报告阶段及一随后的洗涤阶段(未示出)后，可以经由常规萤光检测从多种预先选择的核酸目标分子中检测至少一种核酸目标分子的存在。因此，应当理解，优选地，至少一种核酸目标分子的检测应在初始供应溶液502至所述电泳阵列组件100内部的8分钟至20分钟内完成。

应当理解，如果在获取一样品的4分钟至5分钟内完成溶液502的制备(例如：通过从一患者所采集的一血液样品)则可以在12分钟至25分钟内从一样品中检测至少一种核酸目标分子。

现在参考图6A至图6J，图6A至图6J示出了根据本发明的另一个优选实施例中，从多种预先选择的核酸目标分子中快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个主要阶段。

优选地，可以使用处于一隔板可储存状态的电泳阵列组件600来执行图6A至图6J的所述方法，如上文参考图2A及图2B所述，其中多个正向引物322及多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320与多个固定的、相互隔开的微凝胶沉积物190结合。应当理解，为简洁起见，构成所述电泳阵列160的所述基板110、所述周边壁结构120及所述窗口130以及各种层未具体示出。图6A至图6J中的每一个图是大致沿着图2A中的多条线4-4所截取的一简化侧视截面图。

图6A示出了处于干燥、脱水、操作取向、类似于图2A中所示的一电泳阵列组件500，所述电泳阵列组件500具有象征性、未按比例的各种不同的寡核苷酸正向引物322及多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320的指示，多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320与相应的多个不同的干燥微凝胶沉积物190结合。

图6A以毫米为单位表示所述电泳阵列组件600的一优选实施例的内部尺寸，以及所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190的一般尺寸。

应当理解，图6A至图6J的方法与图4A至4J的方法不同，因为在图4A至图4J的所述方法中，代替多个捕获探针400与所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190结合，在图6A至图6J的所述方法中，多个核酸目标特异性RCA探针320与多个正向引物特异性结合，多个正向引物322也与所述多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190结合。

图6B示出了由一箭头601表示的含有多种核酸目标分子603的一溶液602的引入，以便填充所述电泳阵列组件600的内部。

溶液602的制备不是本发明要求保护的一部分，并且本发明是按照常规技术进行，例如「Nasir Ali，Rita de Cássia Pontello Rampazzo，Alexandre Dias Tavares Costa及Marco Aurelio Krieger，Current Nucleic Acid Extraction Methods and TheirImplications to Point-of-Care Diagnostics，BioMed Research International，2017年，文章号码93065」。优选地，溶液602通常包括在所述溶液制备期间所引入的一低电导率的洗脱液，所述洗脱液促进核酸的电子定址并促进溶液602中的限制酶的活性。一优选的洗脱液包括组氨酸及一限制酶缓冲液。图6B显示处于脱水状态的所述多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190。将溶液602引入电泳阵列组件100中，使得溶液602接触多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，定义一时间T0并使多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190呈现其水合状态，由附图标记170表示(图1A图1B)。

图6C示出了处于一水合状态的多个固定的目标分子特异性微凝胶沉积物170，其作为引入含有多种核酸目标分子603的溶液602的所述结果，并且填充所述电泳阵列组件600的内部。图6C示出了水合的所述多个目标分子特异性电隔离的微凝胶沉积物170，所述多个微凝胶沉积物170具有1.25毫米的一典型最大高度。优选地，所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物190水合至图6C所示的状态需要约10秒，并且优选地在时间T＝T0+10秒完成。

优选地，图6D示出了在10伏特至300伏特/厘米的一DC电场存在的情况下，核酸电泳定址到多个水合的、固定的、相互电隔离的目标分子特异性微凝胶沉积物170处。所述多个电场线的多个部分由多个参考标号610表示，所述电场的所述方向由多个箭头612表示。应当理解，所述多个电场线限定多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域620。每个微凝胶区域620围绕一不同的目标分子特异性微凝胶沉积物170。

应当理解，定址以及下文中参考图6E至图6J所描述的各种步骤不仅出现在多个微凝胶沉积物170的所述表面上，而且还出现在所述多个微凝胶沉积物170的体积内。

如图6D所示，将所述DC电场施加到所述多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性微凝胶区域620导致多种核酸目标分子603快速运送至所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处，从而促进所述多种核酸目标分子603与所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320之间的特异性杂交，其中多个RCA环状探针320与多个正向引物322结合，其中多个正向引物322与水合的多个目标分子特异性电隔离微凝胶沉积物170结合。

图6D中所示的所述阶段的持续时间在30秒至120秒之间。优选地，图6D所示的所述阶段在时间T＝T0+[40至130]秒完成。

现在参考图6E，其示出了通常在图6D中所示的所述定址阶段之后的一连接阶段，优选地，在存在一DC电场的情况下进行，优选地在与图6D的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述连接阶段在一连接酶628(例如：T-4连接酶)存在的情况下发生，其通过一溶液引入电泳阵列组件600中。所述连接阶段的持续时间通常为120至240秒。优选地，所述连接阶段在T＝T0+[160至370]秒完成。

现在参考图6F，其示出了通常在图6E中所示的所述连接阶段之后的一RCA聚合阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，在与图6E的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述RCA聚合阶段在一Bst聚合酶629、多个dNTP(未显示)及一反向引物324(所述反向引物324通过溶液引入电泳阵列组件600)及正向引物322(所述正向引物322与目标分子特异性微凝胶沉积物结合)存在的情况且优选地在65℃的一温度下发生。所述RCA聚合阶段的一结果是产生多个长的RCA扩增子640(图6G)。如图6F所示，在聚合酶629与多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320结合之后，多个核酸目标分子603从多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320移位，如多个箭头642所示。所述RCA聚合阶段的持续时间通常为300秒至720秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[460至1090]秒完成。

现在参考图6G，其示出了通常在图6F的所述RCA聚合阶段期间发生的一扩增子延长的阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图6F的步骤中的所述电场相反的一方向上为10伏特至300伏特/厘米。扩增子640的延长沿着一箭头648所示的一方向发生。优选地，所述RCA聚合阶段在一Bst聚合酶629、多个dNTP(未显示)及一反向引物324存在且在65℃的一温度下发生。所述扩增子延长阶段的持续时间通常为5至15秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[465-1105]秒完成。

应当理解，图6F及图6G中所示的所述多个阶段包括：图6F中所示的所述多个阶段可以间歇地重复多次，图6F所示的多个阶段中的每一阶段的一持续时间比上文所述的时间短，并且由图6G所示的一阶段分开。

现在参考图6H，其示出了通常在图6F的所述RCA聚合阶段及图6G的所述扩增子延长阶段期间所发生的一指数RCA扩增阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地在与图6G的步骤中的所述电场相反的一方向上为10伏特至300伏特/厘米，但优选地包括电场极性反转的多个短周期。在所述阶段，使用多个反向引物324产生额外的多个扩增子650。

优选地，所述指数RCA扩增阶段在一Bst聚合酶629、多个dNTP(未显示)及反向引物324的存在且在65℃的一温度下发生。在图6F的所述RCA聚合阶段及图6G的所述扩增子延长阶段期间发生的所述指数RCA扩增阶段的持续时间通常为5秒至15秒。优选地，图6F的所述RCA聚合阶段、图6G的所述扩增子延长阶段及图6H的所述指数RCA扩增阶段在T＝T0+[465至1105]秒完成。

现在参考图6I，其示出了在图6F的所述RCA聚合阶段、图6G的所述扩增子延长阶段及图6H的所述指数RCA扩增阶段完成之后，通常发生的一后RCA聚合定址阶段，优选地，在一DC电场存在的情况下，优选地在与图6H的步骤中的所述电场相同的一方向上为10伏特至300伏特/厘米。所述后RCA聚合定址阶段对于收集溶液602中的多个扩增子640来说是特别有用的，所述多个扩增子640与多个目标分子特异性微凝胶沉积物170相距一距离并且在所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170处重新捕获所述多个扩增子640，如多个箭头660所示，并且优选地，将所述多个扩增子640集中在每个微凝胶区域620内的一个位置。所述后RCA聚合定址阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述后RCA聚合定址阶段在T＝T0+[475至1135]秒完成。

现在参考图6J，其示出了通常在所述后RCA聚合定址阶段之后的一报告阶段。优选地，所述报告阶段在与多个扩增子640、650互补的一萤光报告子670存在的情况下发生，其通过一溶液引入电泳阵列组件600。所述报告阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述报告阶段在T＝T0+[485至1165]秒完成。

在完成报告阶段及一随后的洗涤阶段(未示出)后，可以经由常规萤光检测从多种预先选择的核酸目标分子中检测至少一种核酸目标分子的存在。因此，应当理解，优选地至少一种核酸目标分子的检测应在初始供应溶液602至所述电泳阵列组件600内部的8分钟至20分钟内完成。

应当理解，如果在获取一样品的4分钟至5分钟内完成溶液602的制备，例如：通过从一患者所采集的一血液样品，则可以在12分钟至25分钟内从一样品中检测至少一种核酸目标分子。

现在参考图7A至图7J，图7A至图7J示出了根据本发明的另一个优选实施例中，从多种预先选择的核酸目标分子中快速检测至少一种核酸目标分子的存在的多个主要阶段。应当理解，为简洁起见，未示出构成所述电泳阵列160的所述基板110、所述周边壁结构120及所述窗口130以及各种层。图7A至图7J中的每一个图是大致沿着图2A中的多条线4-4所截取的一简化侧视截面图。

图7A示出了处于干燥、脱水、操作取向、类似于图2A中所示的一电泳阵列组件700，所述电泳阵列组件700具有象征性的各种不同的寡核苷酸正向引物322、多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320及多个反向引物324的多个指示，多个反向引物324与相应的多个不同的干燥微凝胶沉积物190结合。图7A以毫米为单位显示所述电泳阵列组件700的一优选实施例的内部尺寸，以及所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190的一般尺寸。

应当理解，图7A至图7J的方法与图4A至4J的方法不同，因为在图4A至图4J的所述方法中，代替多个捕获探针400与所述多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190结合，在图7A至图7J的所述方法中，多个核酸目标分子特异性RCA环形探针320与多个正向引物322特异性杂交，以及多个正向引物322与多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190结合，以及多个反向引物324也与多个固定的干燥目标分子特异性微凝胶沉积物190结合。

图7B示出了由一箭头701表示的含有多个核酸目标分子703的一溶液702的引入，以便填充所述电泳阵列组件700的内部。

溶液702的制备不是本发明要求保护的一部分，并且本发明是按照常规技术进行，例如「Nasir Ali，Rita de Cássia Pontello Rampazzo，Alexandre Dias Tavares Costa及Marco Aurelio Krieger，Current Nucleic Acid Extraction Methods and TheirImplications to Point-of-Care Diagnostics，BioMed Research International，2017年，文章号码93065」。优选地，溶液702包括通常在所述溶液制备期间引入的一低电导率的洗脱液，所述洗脱液促进核酸的电子定址并促进溶液702中的限制酶的活性。一优选的洗脱液包括组氨酸及一限制酶缓冲液。图7B显示处于脱水状态的所述多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190。将溶液702引入电泳阵列组件700中，使得溶液702接触多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，定义一时间T0并使多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190呈现其水合状态，由附图标记170表示(图1A图1B)。

图7C示出了处于一水合状态的多个固定的目标分子特异性微凝胶沉积物170，其作为引入含有多种核酸目标分子703的溶液702的所述结果，并且填充所述电泳阵列组件700的内部。图7C示出了水合的所述多个目标分子特异性电隔离的微凝胶沉积物170，所述多个微凝胶沉积物170具有1.25毫米的一典型最大高度。优选地，所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170水合至图7C所示的水合状态需要约10秒，并且优选地在时间T＝T0+10秒完成。

优选地，图7D示出了在10伏特至300伏特/厘米的一DC电场存在的情况下，多个核酸目标分子703电泳定址到所述多个水合的、固定的、相互电隔离的目标分子特异性微凝胶沉积物170处。所述多个电场线的多个部分由多个参考标号710表示，所述电场的所述方向由多个箭头712表示。应当理解，所述多个电场线限定多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的微凝胶区域720，每个微凝胶区域720围绕一不同的目标分子特异性微凝胶沉积物170。

应当理解，定址以及下文中参考图7E至图7J所描述的各种步骤不仅出现在多个微凝胶沉积物170的所述表面上，而且还出现在所述多个微凝胶沉积物170的体积内。

如图7D所示，将所述DC电场施加到所述多个三维的、固定的、相互隔开且相互电隔离的目标分子特异性微凝胶区域720导致多种核酸目标分子703快速运送至所述目标分子特异性微凝胶沉积物170处，从而促进所述多种核酸目标分子703与所述多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320之间的特异性杂交，其中多个RCA环状探针320与多个正向引物322结合，多个正向引物322与水合的多个目标分子特异性电隔离微凝胶沉积物170结合。

图7D中所示的所述阶段的持续时间在30秒及120秒之间。优选地，图7D所示的阶段在一时间T＝T0+[40至130]秒完成。

应当理解，在下文中参考图7E至图7J所描述的多个阶段之前，可以在图7D所示的定址阶段之后添加一可选的移除阶段(未示出)，优选地，在与图7D的步骤中的所述电场相反的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述移除阶段用于移除与多个RCA环状探针320杂交的多种非特异性目标分子。

现在参考图7E，其示出了通常在图7D中所示的所述定址阶段之后的一连接阶段，优选地，在一DC电场存在的情况下进行，在与图7D的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述连接阶段在一连接酶728(例如：T-4连接酶)存在的情况下发生，所述连接酶728通过一溶液引入电泳阵列组件700中。所述连接阶段的持续时间通常为120至240秒。优选地，所述连接阶段在T＝T0+[160至370]秒完成。

现在参考图7F，其示出了通常在图7E中所示的所述连接阶段之后的一RCA聚合阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，在与图7E的步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。优选地，所述RCA聚合阶段在一Bst聚合酶729及多个dNTP(未显示)存在的情况下发生，所述Bst聚合酶729及多个dNTP通过一溶液引入电泳阵列组件700，以及优选地在65℃的一温度下，正向引物322及反向引物324与所述目标分子特异性微凝胶沉积物170结合。所述RCA聚合阶段的一结果是产生多个长的RCA扩增子740(图7G)。如图7F所示，在聚合酶729与多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320结合之后，多个核酸目标分子703从多个核酸目标分子特异性RCA环状探针320移位，如多个箭头742所示。所述RCA聚合阶段的持续时间通常为300秒至720秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[460至1090]秒完成。

现在参考图7G，其示出了通常在图7F的所述RCA聚合阶段期间发生的一扩增子延长及压缩阶段，优选地，在与图7F的步骤中的所述电场相同及相反的多个方向上为10伏特至300伏特/厘米，如一箭头744所示。所述扩增子740的延长在一箭头748所示的方向上发生。压缩通常发生在与箭头748所示方向相反的一方向上。扩增子延长及压缩增强了多个反向引物324的杂交，所述多个反向引物324与所述多个目标分子特异性微凝胶沉积物170、扩增子740结合。优选地，所述扩增子延长及压缩阶段在一Bst聚合酶729、多个dNTP(未示出)存在且在65℃的一温度下发生。所述扩增子延长阶段的持续时间通常为5至15秒。优选地，所述RCA聚合阶段在T＝T0+[465-1105]秒完成。

应当理解，图7F及图7G中所示的所述多个阶段可以间歇地重复多次，图7F所示的多个阶段中的每一阶段的一持续时间比上文所述的时间短，并且由图7G所示的一阶段分开。

现在参考图7H，其示出了通常在图7F的所述RCA聚合阶段及图7G的所述扩增子压缩延长阶段期间所发生的一指数RCA扩增阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，通常在与图7G的所述步骤中的所述电场相反的一方向上为10伏特至300伏特/厘米，但是优选地包括电场的极性反转的多个短周期。在此阶段，使用多个反向引物324来产生多个额外的扩增子750。

优选地，所述指数RCA扩增阶段一在Bst聚合酶729、多个dNTP(未显示)及反向引物324存在且在65℃的一温度下发生。在图7F的所述RCA聚合阶段及图7G的所述扩增子延长阶段期间所发生的所述指数RCA扩增阶段的持续时间通常为5秒至15秒。优选地，图7F的所述RCA聚合阶段、图7G的所述扩增子延长阶段及图7H的所述指数RCA扩增阶段在T＝T0+[465至1105]秒完成。

现在参考图7I，其示出了通常在图7F的所述RCA聚合阶段、图7G的所述扩增子延长及压缩阶段以及图7H的所述指数RCA扩增阶段完成之后发生的一后RCA扩增子浓缩阶段，并且优选地在一DC电场存在的情况下发生，优选地，通常在与图7H的所述步骤中的所述电场相同的方向上为10伏特至300伏特/厘米。所述扩增子浓缩阶段特别适合用于在每个微凝胶区域720内的一个位置处浓缩多个扩增子740及750，如多个箭头760所示。所述扩增子浓缩阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述后RCA聚合定址阶段在T＝T0+[475至1135]秒完成。

现在参考图7J，其示出了通常在所述后RCA聚合定址之后的一报告阶段。优选地，所述报告阶段在与多个扩增子740、750互补的一萤光报告子770存在的情况下发生，所述多个扩增子740、750通过一溶液而引入电泳阵列组件700。所述报告阶段的持续时间通常为10秒至30秒。优选地，所述报告阶段在T＝T0+[485至1165]秒完成。

在完成报告阶段及一随后的洗涤阶段(未示出)后，可以经由常规萤光检测从多种预先选择的核酸目标分子中检测至少一种核酸目标分子的存在。因此，应当理解，优选地至少一种核酸目标分子的检测应在初始供应溶液702至所述电泳阵列组件100内部的8分钟至20分钟内完成。

应当理解，如果在获取一样品的4分钟至5分钟内完成溶液701的制备，例如：通过从一患者所采集的一血液样品，则可以在12分钟至25分钟内从一样品中检测至少一种核酸目标分子。

多个示例

示例1：使用图7A至7J的方法来检测脑膜炎病原体以及使用代表脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)的一合成DNA目标分子。

提供一种类似于电泳阵列组件700(图7A)的电泳阵列组件，其包含100个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，所述固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190具有0.45毫米的一基部直径及约0.2毫米至0.3毫米的一高度。将48个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190以多个RCA环状探针320点样，所述多个RCA环形探针320与多个正向引物322进行预先杂交，并且使用特异于9种不同病原体DNA目标的多个反向引物324，每一个目标与脑膜炎的检测相关，尤其包括脑膜炎双球菌。因此，所述48个点样固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190是目标分子特异性的，如下文所示：

沉积物1：特异于脑膜炎双球菌

沉积物2：特异于脑膜炎双球菌

沉积物3：特异于脑膜炎双球菌

沉积物4：特异于大肠杆菌

沉积物5：特异于大肠杆菌

沉积物6：特异于大肠杆菌

沉积物7：特异于脑膜炎双球菌

沉积物8：特异于脑膜炎双球菌

沉积物9：特异于脑膜炎双球菌

沉积物10：特异于肠道病毒

沉积物11：特异于肠道病毒

沉积物12：特异于脑膜炎双球菌

沉积物13：特异于脑膜炎双球菌

沉积物14：特异于脑膜炎双球菌

沉积物15：B型链球菌

沉积物16：B型链球菌

沉积物17：B型链球菌

沉积物18：特异于脑膜炎双球菌

沉积物19：特异于脑膜炎双球菌

沉积物20：特异于脑膜炎双球菌

沉积物21：特异于流感嗜血杆菌

沉积物22：特异于流感嗜血杆菌

沉积物23：特异于流感嗜血杆菌

沉积物24：特异于脑膜炎双球菌

沉积物25：特异于脑膜炎双球菌

沉积物26：特异于脑膜炎双球菌

沉积物27：特异于人类疱疹病毒

沉积物28：特异于人类疱疹病毒

沉积物29：特异于人类疱疹病毒

沉积物30：特异于人类疱疹病毒

沉积物31：特异于脑膜炎双球菌

沉积物32：特异于脑膜炎双球菌

沉积物33：特异于脑膜炎双球菌

沉积物34：特异于人类副肠孤病毒

沉积物35：特异于人类副肠孤病毒

沉积物36：特异于人类副肠孤病毒

沉积物37：特异于脑膜炎双球菌

沉积物38：特异于脑膜炎双球菌

沉积物39：特异于脑膜炎双球菌

沉积物40：特异于李斯特菌

沉积物41：特异于李斯特菌

沉积物42：特异于李斯特菌

沉积物43：特异于脑膜炎双球菌

沉积物44：特异于脑膜炎双球菌

沉积物45：特异于脑膜炎双球菌

沉积物46：特异于水痘带状疱疹病毒

沉积物47：特异于水痘带状疱疹病毒

沉积物48：特异于水痘带状疱疹病毒

在定义为T0的一时间点，将含有代表脑膜炎双球菌的多种核酸目标分子703(100纳摩尔/公升浓度)的一溶液702提供到所述电泳阵列的内部体积。所述溶液702还包括一低电导率的缓冲液，所述低电导率的缓冲液支持快速的DNA运送及与沉积在所述多个微凝胶上的所述多个RCA探针的杂交。

在一10秒的持续时间之后，供应溶液702使得多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190呈现其水合状态，由附图标记170表示(图7B至图7C)。

在时间T＝T0+10秒时，分别在所述工作电极及在对电极处点260及250上施加1.6毫安培的一恒定电流，产生4.5伏特的电压，从而在所述电泳阵列上施加12.5伏特/厘米的一电场，并产生电泳定址(图7D)。所述电泳定址的持续时间为40秒。

在时间T＝T0+50秒时，将包含连接反应酶T4连接酶(Blunt T/A，来自新英格兰的生物实验室)的一连接反应溶液供应至所述电泳阵列的内部体积、替换溶液702，所述持续时间大约为180秒(图7E)。

在时间T＝T0+230秒时，将含有Bst聚合酶729及多个dNTP(来自新英格兰的生物实验室)的一聚合酶溶液供应到所述电泳阵列的内部体积、替换所述连接反应溶液，其持续时间大约为720秒(图7F)。

在时间T＝T0+950秒时，分别在所述工作电极及对电极触点260及250上施加1.6毫安培的一恒定电流，产生4.5伏特的电压，从而在电泳阵列上施加12.5伏特/厘米的一电场，并且从所述聚合酶溶液中提供多个RCA扩增子的重新捕获。此步骤的持续时间约为20秒(图7I)。

在时间T＝T0+970秒时，将含有萤光标记的寡核苷酸的一红色报告溶液(来自Integrated Device Technology，Inc.，San Jose，CA的Alexa 647)供应到所述电泳阵列的内部体积、替换所述聚合酶溶液，其持续时间约为30秒(图7J)。在洗掉所述红色报告溶液后，通过窗口130获取所述电泳阵列组件700的一萤光图像，并且在下列多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物中检测到代表脑膜炎双球菌的核酸目标分子703的存在：1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32、33、37、38、39、43、44及45。在下列多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物170中未检测到代表脑膜炎双球菌的核酸目标分子703的存在：4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47及48。

所述检测结果的总结在图8中。应当注意，从多个沉积物1、2、3、7、8、9、13、14、15、19、20、21、25、26、27、31、32、33、37、38、39、43、44及45中所获得的所述萤光讯号与来自多个沉积物4、5、6、10、11、12、16、17、18、22、23、24、28、29、30、34、35、36、40、41、42、46、47及48的萤光讯号的强度的平均比率约为8.5。

示例2：

使用图7A至图7J的方法来检测脑膜炎病原体并且使用从脑膜炎双球菌中提取的一基因组DNA目标分子病原体以掺入脑脊液的临床样品。

提供一种类似于电泳阵列组件700(图7A)的电泳阵列组件，其包含100个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190，所述多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190具有0.45毫米的一基部直径及约0.2毫米至0.3毫米的一高度。将21个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190以多个RCA环状探针320点样，所述多个RCA环形探针320与多个正向引物322进行预先杂交，并且使用特异于9种不同病原体DNA目标的反向引物324，每一个目标与脑膜炎的检测相关，尤其包括脑膜炎双球菌。因此，所述21个经过点样的固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190是目标分子特异性的，如下文所示：

沉积物1：特异于大肠杆菌

沉积物2：特异于大肠杆菌

沉积物3：特异于脑膜炎双球菌

沉积物4：特异于脑膜炎双球菌

沉积物5：特异于脑膜炎双球菌

沉积物6：特异于肠道病毒

沉积物7：特异于肠道病毒

沉积物8：特异于脑膜炎双球菌

沉积物9：特异于脑膜炎双球菌

沉积物10：特异于脑膜炎双球菌

沉积物11：B型链球菌

沉积物12：B型链球菌

沉积物13：特异于流感嗜血杆菌

沉积物14：特异于流感嗜血杆菌

沉积物15：特异于脑膜炎双球菌

沉积物16：特异于脑膜炎双球菌

沉积物17：特异于脑膜炎双球菌

沉积物18：特异于李斯特菌

沉积物19：特异于李斯特菌

沉积物20：特异于水痘带状疱疹病毒

沉积物21：特异于水痘带状疱疹病毒

将脑膜炎双球菌病原体掺入脑脊液(CSF)的一临床样品，并且使用一常见的基于磁珠的DNA萃取方法来萃取基因组DNA。通过一参考实时PCR方法来测定脑脊液中的DNA目标的输入浓度，所述方法在每微升CSF的720个复制DNA的脑脊液的临床样品中，产生脑膜炎双球菌的病原体浓度。

在定义为T0的一时间点，将一溶液702供给到所述电泳阵列的内部体积，所述溶液702是从所述经掺入后的临床样品中所制备。所述溶液702还包括一低电导率的缓冲液，所述低电导率的缓冲液支持快速的DNA运送以及与沉积在所述多个微凝胶上的所述多个RCA探针的杂交。

在一10秒的持续时间之后，供应溶液702使得多个干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物190呈现其水合状态，由附图标记170表示(图7B至图7C)。

在时间T＝T0+10秒时，分别在所述多个工作电极及多个对电极触点260及250上施加1.6毫安培的一恒定电流，产生4.5伏特的电压，从而在所述电泳阵列上施加12.5伏特/厘米的一电场，并产生电泳定址(图7D)。所述电泳定址的持续时间为40秒。

在时间T＝T0+50秒时，分别在所述多个工作电极及多个对电极触点260及250上施加1.6毫安培的一逆转极性电场，产生4.5伏特的电压，从而在所述电泳阵列上施加12.5伏特/厘米的一电场，并增强非特异性结合的DNA目标的移除。所述电泳定址的持续时间为10秒(图7G)。

在时间T＝T0+60秒时，将包含连接反应酶T4连接酶(Blunt T/A，来自新英格兰的生物实验室)的一连接反应溶液供应至所述电泳阵列的内部体积、替换溶液702，其持续时间大约为180秒(图7E)。

在时间T＝T0+240秒时，将含有Bst聚合酶729及多个dNTP(来自新英格兰的生物实验室)的一聚合酶溶液供应到所述电泳阵列的内部体积、替换所述连接反应溶液，其持续时间大约为720秒(图7F)。

在时间T＝T0+960秒时，分别在所述工作电极及对电极触点260及250上施加1.6毫安培的一恒定电流，产生4.5伏特的电压，从而在所述电泳阵列上施加12.5伏特/厘米的一电场，并且从所述聚合酶溶液中提供多个RCA扩增子的重新捕获。此步骤的持续时间约为20秒(图7I)。

在时间T＝T0+980秒时，将含有萤光标记的寡核苷酸的一红色报告溶液(来自Integrated Device Technology，Inc.，San Jose，CA的Alexa 647)供应到所述电泳阵列的内部体积，替换所述聚合酶溶液，其持续时间约为30秒(图7J)。在洗掉所述红色报告溶液后，通过窗口130获取所述电泳阵列组件700的一萤光图像，并且在下列多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物中检测到代表脑膜炎双球菌的核酸目标分子703的存在：3、4、5、8、9、10、15、16及17。在下列多个固定的干燥的目标分子特异性微凝胶沉积物170中未检测到代表脑膜炎双球菌的核酸目标分子703的存在：1、2、6、7、11、12、13、14、18、19、20及21。

检测结果的总结在图9中。应当注意，从多个沉积物3、4、5、8、9、10、15、16及17中所获得的所述萤光讯号与来自沉积物1、2、6、7、11、12、13、14、18、19、20及21的萤光讯号的强度的平均比率约为4.3。

本领域中具有通常知识者应当理解本发明不限于本文所描述及示出的内容，本发明还包括本文所描述的多个特征的组合及子组合，以及其中不属于先前技术的多种修改。