维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用
阅读说明：本技术 维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用 (Application of vitamin D2 in preparation of SARS-CoV-2 novel coronavirus inhibitor ) 是由 宋世东 孙媛媛 葛以跃 迟莹 江经纬 于 2020-05-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,具体涉及维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用。本发明通过研究发现,维生素D2可以结合SARS-CoV-2新型冠状病毒的刺突蛋白S1上与ACE-2受体结合的RBD区,阻断病毒进入细胞,从而抑制病毒复制。因此,维生素D2可以作为SARS-CoV-2新型冠状病毒的抑制剂,为预防和/或治疗SARS-CoV-2新型冠状病毒提供了新思路,为临床试验的开展提供了理论基础,具有重要的医学研究价值。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to application of vitamin D2 in preparation of a novel SARS-CoV-2 coronavirus inhibitor. The invention discovers that vitamin D2 can be combined with RBD area combined with ACE-2 receptor on spike protein S1 of SARS-CoV-2 novel coronavirus to block virus from entering cells, thereby inhibiting virus replication. Therefore, the vitamin D2 can be used as an inhibitor of SARS-CoV-2 novel coronavirus, provides a new thought for preventing and/or treating SARS-CoV-2 novel coronavirus, provides a theoretical basis for the development of clinical tests, and has important medical research value.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用。
背景技术
高致病性冠状病毒感染成了这十年来广受关注公共卫生问题。如严重急性呼吸综合征 (SARS，2002-2004)、中东呼吸综合征(MERS，2012-至今)、SARS-CoV-2(COVID- 19)，每种疾病都对人类健康和经济发展都带了巨大的冲击。据报道，SARS-CoV-2是β属冠状病毒(Betacoronavirus，Beta-CoV)的一个新成员，与严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒(SARS-CoV)和几种蝙蝠冠状病毒密切相关。
由于没有针对性的有效药物和疫苗，SARS-CoV-2新型冠状病毒的新药研发意义重大，在这场没有硝烟的战争中，全球多家科研机构和制药公司致力于研发新型冠状病毒疫苗和治疗药物。因此，研发SARS-CoV-2新型冠状病毒的治疗药物具有重大的社会学和经济学意义。
维生素D2(Vitamin D2；Ergocalciferol)是维生素D类似物，由某些植物在UVB光存在下合成。该药物用于治疗软骨症，美国FDA于1941年批准上市。根据美国2011年的诊断指南，Ergocalciferol也许可以作为饮食补充剂来补充维生素D，Ergocalciferol和皮肤在紫外线照射下产生的胆钙化醇(维生素D3)同样有效。Frank等(2020)发现在免疫反应中，维生素D依赖性抗菌途径对新冠病毒COVID-19等复制过程中产生的双链RNA有反应。这些途径随后上调受损细胞的清除(自噬)，以及各种抗菌和抗病毒肽水平。因此，维生素D 缺乏可能通过阻碍宿主激活上述防御途径，并影响淋巴细胞和巨噬细胞的迁移，使宿主容易受到新冠病毒感染。但目前尚未见维生素D2是否能抑制SARS-CoV-2的相关报道，其作用机理也尚不清楚。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了维生素D2在制备SARS-CoV-2新型冠状病毒抑制剂中的应用。维生素D2可以结合SARS-CoV-2新型冠状病毒的刺突蛋白S1上与ACE- 2受体结合的RBD区，阻断病毒进入细胞，从而抑制病毒复制。
具体地，本发明提供了维生素D2在制备抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒核酸增殖的制剂中的应用。
具体地，本发明提供了维生素D2在制备阻断SARS-CoV-2新型冠状病毒进入细胞的制剂中的应用。
具体地，本发明提供了维生素D2在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2新型冠状病毒肺炎感染的药物中的应用。
优选地，所述的维生素D2抑制SARS-CoV-2新型冠状病毒的刺突蛋白S1识别受体ACE-2。
本发明的另一目的在于提供一种预防和/或治疗SARS-CoV-2新型冠状病毒肺炎感染的药物，所述药物含有维生素D2。
优选地，所述的维生素D2的血药浓度为5-20μmol/L。
更优选地，所述的维生素D2的血药浓度为10μmol/L。
由于SARS-CoV-2新型冠状病毒进入细胞靠刺突蛋白spike(S1)识别受体ACE-2。因此，抑制spike与ACE-2靶点相互作用的小分子抑制剂可应用于针对SARS-CoV-2新型冠状病毒的预防和/或治疗。发明人将全部FDA获批的老药(2514个，Drugbank数据库)对S蛋白上与ACE-2受体结合区进行虚拟分子对接及AI评分系统进行评分获得19种候选老药，试验和筛选了多种老药，发现维生素D2可作为有效的2019新型冠状病毒抑制剂。
维生素D2的结构式如图1所示。中文名称：麦角钙化醇(维生素D2)。英文名称：Ergocalciferol(Vitamin D2)。分子式：C28H44O。分子量：396.6484。CAS号：50-14-6。
发明人发现Ergocalciferol可以结合SARS-CoV-2新型冠状病毒的刺突蛋白S1上与 ACE-2受体结合的RBD区，阻断病毒进入细胞，是全新机制SARS-CoV-2新冠病毒的抑制剂。Ergocalciferol在细胞水平上10μM能抑制病毒核酸增殖57.53％。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过研究发现，维生素D2可以作为SARS-CoV-2新型冠状病毒的抑制剂，为预防和/或治疗SARS-CoV-2新型冠状病毒提供了新思路；维生素D2作为老药新用，不存在安全性问题，为临床试验的开展提供了理论基础，具有重要的医学研究价值。
附图说明
图1为Ergocalciferol的结构式。
图2为Ergocalciferol与SARS-CoV-2新型冠状病毒S蛋白的RBD区的亲和力测定结果。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。以下原料来源，为示例性说明。
一、实验试剂与耗材
重组2019nCOVSpike RBD蛋白(KACTUS,Cat.COV-VM5BD)；
蛋白标记试剂盒(Cat#MO-L011)；
上样毛细管(Cat#MO-K022)；
DMSO(碧云天生物技术，货号ST-1276-500ml)；
DMEM培养基(Gibco，货号12430-054)；
CCK-8试剂盒(碧云天生物技术，货号C0039)；
核酸提取试剂盒(Roche,Cat.03038505001)；
2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒(上海伯杰，货号SJ-HX-226-2)。
二、主要仪器
荧光定量PCR仪QuantStudioDx，厂家ABI，编号04-620；
MagNA Pure LC2.0全自动核酸提取仪，厂家Roche；
二氧化碳培养箱(GALAXYS)，厂家RsBiotech，编号04-0303；
三、SARS-CoV-2病毒株
江苏省疾病预防控制中心BSL-3实验室通过分离培养实验室分离鉴定出新型冠状病毒毒株。本实验所采用的毒株编号为：BetaCoV/JS03/human/2020(EPI_ISL_411953)。
四、化合物Ergocalciferol
IUPAC名称：(1S,3Z)-4-亚甲基-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-八氢-7a-甲基-1-[Chemicalbook[1R,2E,4R)-1,4,5-三甲基-2-己烯-1-基]-4H-茚满-4-亚丙基]亚乙基]环己醇 (1S,3Z)-4-Methylene-3-[(2E)-2-[(1R,3aS,7aR)-octahydro-7a-methyl-1-[(1R,2E,4R)-1,4,5- trimethyl-2-hexen-1-yl]-4H-inden-4-ylidene]ethylidene]cyclohexanol，分子量396.65,化学式: C28H44O,纯度：99.89％,保存条件：-20℃(粉末)；-80℃(溶剂)。货号：T1086。化合物样品及相关信息均由上海陶素生化科技有限公司提供。
实施例1微量热泳动仪(MicroscaleThermophoresis，MST)测定Ergocalciferol对SARS- CoV-2新型冠状病毒S蛋白RBD区的直接结合
1、原理
该技术基于生物分子的热泳动现象，MST使用红外激光进行局部加热导致分子定向移动，继而通过荧光分析粒子在微观的温度梯度中的定向运动。能够检测到由于结合而引起的生物分子的大小、电荷和水化层的变化。
2、应用
(1)单链抗体与人源抗原蛋白的结合过程；
(2)小分子化合物与模式蛋白的相互作用；
(3)体外合成蛋白与结合物分子相互作用；
(4)DNA/RNA分子立体螺旋结构的行程；
(5)小分子抑制剂对蛋白激酶的抑制效应；
(6)钙离子和突出蛋白左右-标记/非标记；
(7)蛋白结合小分子的热力学常数测量；
(8)生物素结合亲和素的化学计量学测量。
3、实验方法
按照蛋白标记试剂盒说明书，取140μL 10μM的蛋白溶液+15.56μL的NHS，以蛋白溶液和药物溶液对半混合并以两倍的浓度梯度稀释，选取10个浓度，每个毛细管吸取约6μL溶液。
4、实验结果
Ergocalciferol，实验选取25μM为最高浓度，往下设10个浓度梯度，信噪比7.6，拟合出Kd＝14.3μM(如图2所示)。
实施例2 Ergocalciferol体外抗SARS-CoV-2活性效果
一、生物安全要求
Ergocalciferol体外抗SARS-CoV-2活性效果评估实验涉及病毒培养，按照国家卫健委《新型冠状病毒实验室生物安全指南(第二版)》要求，所有病毒培养均在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。使用病毒培养物提取核酸，裂解剂或灭活剂的加入在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行。活病毒在采用可靠的方法灭活后进行的核酸检测等操作在生物安全二级实验室(BSL-2)进行。
二、实验环境
室温：22℃，相对湿度：55％。
三、实验方法
1、实验分组
(1)Ergocalciferol 10μM组；(2)DMSO对照组；(3)病毒对照组，用于评估 DMSO对病毒生长是否有影响；(4)细胞对照组，用于观察细胞生长是否正常。
2、药物稀释
Ergocalciferol按1:1000加入细胞维持液，得10μmol/L应用液。DMSO按照对应药物的稀释比例进行稀释。
3、实验步骤
(1)细胞准备及药物预处理
将Vero-E6细胞分别按照1×104细胞/孔接种于96孔培养板中，使用含10％胎牛血清的 DMEM培养16小时至80％成片，之后吸弃每一孔的细胞培养液，无菌PBS洗涤细胞1次，根据实验分组每孔加入细胞维持液稀释好的不同药物(50μl/孔)，每组设立4个复孔，放置于37℃，5％CO2孵箱中预处理1h。病毒对照组和细胞对照组只加50μl细胞维持液。
(2)病毒感染及培养
药物预处理1h后，除了细胞对照组之外，每孔加入2μl SARS-CoV-2毒株，使病毒感染复数为0.05(Multiplicity of infection，MOI＝0.05)，放置于37℃，5％CO2孵箱中吸附2小时。吸附完成后均弃去带有病毒的培养基，根据实验分组，每组分别加入200μl对应的新培养基，于37℃，5％CO2孵箱中培养48h。吸取每一孔培养上清120μl，置于56℃，灭活30min。灭活完成后，每孔取100μl加入核酸提取试剂的试剂槽裂解液中。试剂槽外表面消毒后转入BSL-2实验室进行病毒核酸提取和基因检测。
(3)核酸提取
参照全自动核酸提取仪和提取试剂盒的操作说明进行病毒核酸提取。
(4)荧光定量PCR检测
按照上海伯杰2019新型冠状病毒核酸检测试剂盒说明书配置PCR反应体系，具体反应体系为：qRT-PCR反应液6μl，qRT-PCR酶混合液2μl，引物探针2μl，模板2.5μl；反应参数为：50℃10min，95℃5min，40 cycles of：95℃10s，55℃40s(在此步收集FAM通道及 VIC通道荧光信号)；通过检测SARS-CoV-2病毒基因(ORF1ab和N)转录水平以反应病毒的复制水平。根据PCR仪给出的CT值计算2-△CT值，来表示实验组相对于对照组的相对病毒含量，病毒复制抑制率(％)＝(1-2-△CT)×100％。
4、实验结果
荧光定量PCR检测结果显示Ergocalciferol在Vero-E6细胞中浓度达10μM时，其对病毒生长的抑制率为57.53％。原始数据见表1。
表1 Ergocalciferol对SARS-CoV-2冠状病毒的抑制实验原始数据
结论：Ergocalciferol在Vero-E6细胞中浓度达10μM时，对病毒生长具有抑制作用。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。