帕立骨化醇在制备治疗胆汁淤积性肝损伤药物中的新用途
阅读说明：本技术 帕立骨化醇在制备治疗胆汁淤积性肝损伤药物中的新用途 (New application of paricalcitol in preparation of medicine for treating cholestatic liver injury ) 是由 李丽华 翁志勇 于 2020-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种帕立骨化醇的医药新用途。帕立骨化醇用于治疗胆汁淤积诱导的肝损伤时,能够有效减少肝脏内胆汁的淤积,减轻肝细胞损伤,抑制肝纤维化形成,提高生存率,且治疗有效剂量为50-200ng/kg。(The invention discloses a new medical application of paricalcitol. When the paricalcitol is used for treating hepatic injury induced by cholestasis, the paricalcitol can effectively reduce the cholestasis of the liver, relieve hepatocyte injury, inhibit hepatic fibrosis formation and improve survival rate, and the effective treatment dose is 50-200 ng/kg.)
技术领域
本发明涉及治疗胆汁淤积性肝损伤，具体涉及一种药物帕立骨化醇。
技术背景
人类胆汁淤积性肝病的病因多种多样，可导致肝细胞损伤和纤维化，严重可发展为肝硬化和肝衰竭乃至死亡。临床调查显示，维生素D的缺乏与妊娠期肝内胆汁淤积症【Song Hong-Bi, Xu Yin, Yang Xiaowu, et al. High prevalence of vitamin Ddeficiency in pregnant women and its relationship with adverse pregnancyoutcomes in Guizhou, China [J]. J Int Med Res. 2018 Nov;46(11):4500-4505.】、儿童慢性胆汁淤积症【Bahram Mohammadi, Mehri Najafi, Fateme Farahmand, et al.Prevalence of vitamin D deficiency and rickets in children with cholestasisin Iran [J]. Acta Med Iran. 2012;50(7):482-5.】和原发性胆汁性肝硬化【MikkelMalham, Søren Peter Jørgensen, Peter Ott, et al. Vitamin D deficiency incirrhosis relates to liver dysfunction rather than aetiology. World JGastroenterol. 2011 Feb 21;17(7):922-5.】 密切相关。而补充维生素D可调节胆汁酸调节基因的表达，并抑制胆总管结扎诱导的小鼠炎症【Michitaka Ogura, Shigeru Nishida,Michiyasu Ishizawa, et al. Vitamin D3 modulates the expression of bile acidregulatory genes and represses inflammation in bile duct-ligated mice [J]. JPharmacol Exp Ther. 2009 Feb;328(2):564-70.】。但具体机制不清。
帕立骨化醇是1 ,25-二羟维生素D的类似物，是维生素D2的活性形式。2005年，帕立骨化醇胶囊剂在美国上市，用于治疗继发性甲状旁腺功能亢进症与慢性肾功能衰竭。随着深入研究发现，帕立骨化醇在脑部病变，如阿尔茨海默症、帕金森综合征，心脏炎症等疾病中都起到治疗作用。然而，帕立骨化醇是否能够减轻胆汁淤积性肝损伤尚未可知。
发明内容
本发明的目的是要提供一种帕立骨化醇的医药新用途，具有减轻胆汁淤积诱导的肝损伤作用。
所述用于治疗胆汁淤积性肝损伤的帕立骨化醇（Paricalcitol）为市售产品，购买于美国Sigma-Aldrich公司。使用时溶于丙三醇中，使用剂量为200ng/kg，用法为腹腔注射，隔日一次。
所述的肝损伤，为胆总管结扎诱导的胆汁淤积性肝损伤。
所述胆管结扎诱导的胆汁淤积性肝损伤的动物疾病模型制备，具体方法为：
（1）C57BL/6小鼠随机三组，分别为假手术组，模型组及治疗组。当治疗组小鼠连续给予帕立骨化醇3天后，三组小鼠同时开始造模。首先，将小鼠放于小动物麻醉机中麻醉（2%异氟烷），麻醉后的小鼠固定于37度恒温垫上，然后在体式解剖镜下进行无菌开腹，并分离胆总管，假手术组小鼠胆总管行穿线，但不结扎；而模型组和治疗组小鼠胆总管行两端结扎并在中间剪断，然后缝合腹腔。待小鼠清醒后放回笼子饲养。
（2）治疗组小鼠给予腹腔注射帕立骨化醇，假手术组和模型组小鼠分别给予腹腔注射等体积的丙三醇，造模后连续给予5天或者28天。
基于建立的胆汁淤积诱导的小鼠胆汁淤积性肝损伤疾病模型，所述帕立骨化醇通过减少肝脏内胆汁的淤积、肝细胞损伤、肝纤维化形成，从而减轻肝脏损伤，提高小鼠生存率，具体表现在：
（1）所述帕立骨化醇可减轻肝脏内胆汁的淤积。在造模后2天，通过生物化学的方法检查，观察到帕立骨化醇显著减低血清中总胆汁酸和总胆红素水平。
（2）所述帕立骨化醇可减少胆汁淤积诱导的肝细胞损伤及肝脏点灶状坏死面积。在造模后2天，通过血清酶学检查方法，观察到帕立骨化醇明显降低血清中谷丙转氨酶水平；在造模后5天，通过病理学检查方法，将肝脏切片进行H&E染色，观察到帕立骨化醇减少肝脏点灶状坏死面积。
（3）所述帕立骨化醇可减少肝纤维化形成。造模后5天和28天，通过western blot技术分析显示帕立骨化醇可抑制肝脏星形细胞的激活；另外，使用天狼星红特殊染色，观察到帕立骨化醇明显减少胶原在肝脏组织间的沉积。
（4）所述帕立骨化醇可降低小鼠死亡率。造模后观察并记录小鼠给药后28天的生存状态，统计分析显示帕立骨化醇明显降低小鼠死亡率。
说明书附图
为了更清楚地说明本发明实施的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中的本发明实验技术路线图及小鼠生存率统计学分析结果
图2为实施例2中的小鼠血清酶学及肝脏形态学检测分析
图3为实施例3中的小鼠肝纤维化程度分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
本发明通过结扎胆总管（BDL）建立小鼠胆汁淤积模型，帕立骨化醇（PAL）能够有效减少肝脏内胆汁的淤积、肝细胞损伤、肝纤维化形成，从而减轻肝脏损伤，提高小鼠生存率，且治疗剂量为50-200ng/kg。
实施例1、实验方案及小鼠生存率分析
如图1所示，实验小鼠（C57BL/6雄性小鼠，8-10周龄，购自江苏南京君科生物技术有限公司）分为假手术组（分别给予PAL和溶剂丙三醇PG），模型组（给予PG）和治疗组（给予PAL，200ng/kg，腹腔注射，隔日一次）。PAL预给药3天，在第4天时，三组小鼠同时进行胆总管结扎手术，然后继续给药至5天或28天（A）。收集小鼠血液、肝脏等样本进行后续检测。每天观察小鼠状态，记录体重、毛发、饲料量、水量、死亡例数及其原因。利用统计分析软件（GraphPadPrism 5）分析小鼠生存率。结果（B）所示，胆总管结扎导致小鼠近50%的死亡率。PAL治疗后，显著降低小鼠死亡率，说明PAL通过改善肝脏损伤，而提高小鼠生存时间。本发明还发现，PAL剂量在50-200ng/kg之内，能够有效提高小鼠生存率；但大于200或小于50ng/kg的剂量则不能提高小鼠生存率。
实施例2、小鼠血清学及肝脏形态学检测
血清中的谷丙转氨酶（ALT）水平是检测肝脏损伤的重要指标；而总胆汁酸（TBA）和总胆红素（TBIL）是检测肝脏胆汁淤积的重要指标。如图2所示，小鼠胆总管结扎2天时，血清中的ALT，TBA 和TBIL水平显著升高，说明小鼠胆汁淤积性肝损伤模型诱导成功。PAL治疗后显著降低上述参数水平。说明PAL 能够有效减轻胆汁淤积诱导的肝损伤程度（A）。将小鼠肝脏固定、切片并进行苏木精和伊红（H&E）染色，显微镜下观察组织病变情况。胆总管结扎5天后，在汇管区和门静脉周围出现胆管增生和点状肝细胞坏死灶；PAL治疗后，减少点状肝细胞坏死灶的面积，说明PAL可减轻肝损伤（B，图中箭头指示坏死灶）。
实施例3、小鼠肝脏纤维化程度检测
使用免疫组织化学技术，在肝组织上进行天狼星红染色，检测肝脏纤维化程度。如图3所示，胆总管结扎诱导了肝脏星形细胞激活，分泌胶原并沉积于胆管周围，并随着时间延长逐渐增多。天狼星红染料可以特异性地将胶原染成红色。经PAL治疗后，红色沉积胶原明显减少了（A）。a-SMA是肌纤维的特异性蛋白；a-SMA蛋白表达量上调也是肝脏星形细胞激活的标志。Western blot分析显示（B），PAL治疗后明显减少a-SMA蛋白表达量，说明PAL预处理能够有效抑制星形细胞的激活，减少胶原沉积，而阻止肝脏纤维化形成。
综上所述，帕立骨化醇用于治疗胆汁淤积诱导的肝脏损伤时，能够有效减少肝脏内胆汁的淤积，减轻肝细胞损伤，抑制肝纤维化形成，提高生存率，且治疗有效剂量为50-200ng/kg。