阅读说明：本技术 三七皂苷r1作为几丁质酶抑制剂的新用途 (New use of notoginsenoside R1 as chitinase inhibitor ) 是由 田洋 杨扬 盛军 史崇颖 贺水莲 陶亮 杨茗茸 于 2019-12-26 设计创作，主要内容包括：本发明公开了三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂的新用途,本发明通过基于药效团匹配的反向找靶技术进行三七皂苷R1活性靶点的虚拟筛选,以及计算机模拟分子对接并通过体外几丁质酶活性抑制试验验证发现了三七皂苷R1的一个新作用靶点蛋白几丁质酶,三七皂苷R1对几丁质酶具有较强的抑制作用,可以应用于几丁质酶抑制剂药物的制备并应用于相关疾病的治疗,其能对深入阐明三七皂苷R1的生物活性机制,以及为针对相应靶标所适用的疾病类型精准用药或配合用药奠定必要的研究基础。(The invention discloses a new application of notoginsenoside R1 as a chitinase inhibitor, which is characterized in that pseudo-screening of a notoginsenoside R1 active target is carried out by reverse targeting technology based on pharmacophore matching, computer-simulated molecular docking and in-vitro chitinase activity inhibition tests prove that a new action target protein chitinase of notoginsenoside R1 is found, and the notoginsenoside R1 has stronger inhibition effect on chitinase, can be applied to preparation of chitinase inhibitor medicines and treatment of related diseases, can deeply clarify the biological activity mechanism of the notoginsenoside R1, and lays a necessary research foundation for accurate medicine or matched medicine of disease types applicable to corresponding targets.)

三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂的新用途

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂的新用途。

背景技术

三七为五加科人参属植物，具有滋补强壮、活血化瘀、消肿止痛、止血等功效，三七总皂苷是三七的主要有效成分，人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1等是三七皂苷的主要活性单体。其中，三七皂苷R1对诸多系统、器官、组织具有良好的调节及保护作用，特别是三七皂苷R1在降血脂及心脑血管保护、提高免疫力方面具有显著活性。近年来，一些新药的研制开发常以三七特有的皂苷成分三七皂苷R1作为重要指标，但是针对单体R1的药理作用及机制还有很多领域有待进一步探索，而寻找三七皂苷R1新的作用靶点，可能对其治疗效果的作用机制阐释及药物开发有重要的参考价值。

反向找靶是新近发展的一种有效便捷的筛选新颖化合物作用靶标，及老药新型靶点机制发现的重要方法。一系列基于药效团模型匹配的靶标钓取方法和数据库被创建出来。这种方法相对于药理学实验的高通量筛选来说，具有更快更经济的特点，一系列化合物的新作用靶标被发现并得到药理活性验证。这种高通量筛选靶点的方法，再经过分子对接验证具有更高的作用机制预测准确性。将极大推动公司及研究机构新药研发过程。

几丁质酶抑制剂作为抑菌剂、抗真菌剂、杀虫剂和潜在的肺部免疫调节剂和抗过敏哮喘药物设计的靶点,开发高效的几丁质酶抑制剂对于抗细菌真菌感染、防治农业害虫和抗过敏哮喘具有非常重要的意义。近十年来,细菌、真菌、线虫、昆虫和人类几丁质酶研究在生物学和化学生物学等领域取得了突出进展。几丁质酶虽然与人体疾病没有较直接的药物作用关系，但在感染慢性炎症和各种退行性疾病患者的血液中几丁质酶都有高表达。抑制几丁质酶是否有利于人体慢性疾病的治疗是一个很有潜力的研究领域。最近，关于几丁质酶抑制剂被用于肺纤维化和骨溶解性骨病的活性研究有力证明了上述推测。针对溶骨性骨病的研究发现，多发性骨髓瘤骨病患者细胞系具有高水平的CHIT1活性，利用硼替佐米治疗溶骨性骨病时发现，硼替佐米通过抑制CHIT1和TKL40的活性，从而降低了溶骨性患者细胞细胞系的骨溶性以及骨吸收，其中，CHIT1的活性降低，另外，CHIT1的mRNA的表达水平也降低。表明几丁质酶可以作为多发性骨髓瘤骨病的治疗靶点，开发新的几丁质酶抑制剂对治疗多发性骨髓瘤骨病具有重要意义。目前，尚未有报道三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂方面的用途。

发明内容

针对以上的问题，本发明的目的是：通过反向找靶技术寻找一种安全可靠的几丁质酶抑制剂，为开发新几丁质酶抑制剂类药物提供新的选择。

实现本发明的技术特征是：

三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂方面的新用途。

三七皂苷R1作为几丁质酶抑制剂类药物的用途，所述药物包括三七皂苷R1及一种或两种以上的辅料。

本发明的有益效果为：

本发明发现了三七皂苷R1的一个新靶标，即对几丁质酶具有显著的抑制活性，与目前已报道的具有几丁质酶抑制活性的化合物allosamidin(IC₅₀＝128μM),acetazolamide(IC₅₀＝164μM)和8-chlorotheophylline(IC₅₀＝410μM)相比，活性有显著提高，具有较强的开发利用价值。

三七皂苷R1可通过抑制几丁质酶的活性进而治疗多发性骨髓瘤骨病等疾病，为开发新的几丁质酶抑制剂提供新的选择，对深入了解三七皂苷R1的抑制几丁质酶的生物活性机制，以及为针对相应靶标所适用的疾病类型精准用药或配合用药奠定必要的研究基础。

附图说明

图1为三七皂苷R1的分子特征图及其进行pharmmapper药效团匹配筛选后与几丁质酶药效团的匹配情况，其中，(a)为三七皂苷R1分子及分子特征；(b)三七皂苷R1及药效团模型匹配图；

图2：(a)为三七皂苷R1与几丁质酶的空间对接模拟3D图，(b)为(a)图放大情况，可见相互作用位点，(c)为三七皂苷R1与几丁质酶的空间对接模拟2D图；

图3为不同浓度三七皂苷R1对几丁质酶的抑制情况。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1三七皂苷R1靶标筛选

方法：Pharmmapper是一个广泛被使用的药效团匹配与潜在识别靶标平台，根据药物靶点特征应用许多算法来寻找所最佳匹配的基因和蛋白质。Pharmmapper本质上也是对小分子和特异靶点受体之间的相互作用进行分析。PharmMapper有超过7000个受体基础的药效团模型，来自TargetBank,DrugBank,BindingDB和PDTD这几个蛋白靶标数据库。

通过pharmmapper药物靶标虚拟筛选服务端，提交三七皂苷R1分子结构，根据其结构特征，选择对2241种人体相关靶标蛋白的药效团进行匹配打分和误差分析，并将结果按照z'-score值排名。结果：排名前五的作用蛋白中，见表1，Chitotriosidase-1其特征匹配值为8，匹配分数值为4.331，以及z'-score为3.46423，在2241种靶标蛋白中排名最高。其中z'-score是从分子的匹配分数和预先计算的数据库分数矩阵生成的分数，越高的z'-score值也表明该靶标蛋白更可能是三七皂苷R1的最佳作用蛋白。

表1.三七皂苷R1在Pharmmapper中匹配能力最高的5个靶标蛋白数据

图1为三七皂苷R1的分子特征图，及其进行pharmmapper药效团匹配筛选后与几丁质酶药效团的匹配情况，其匹配特征数为8，包括2个亲脂基团、1个正电荷基团、2个氢键供体基团和3个氢键受体基团。

实施例2评价三七皂苷R1的药物—蛋白结合能力

方法：SwissDock是一个广泛应用的可以通过提交靶点蛋白和分子结构，进而预测计算其结合能量，评价药物—蛋白结合能力的药物筛选平台。通过SwissDock服务端，分别提交三七皂苷R1与pharmmapper中可能结合的排名前五的靶标蛋白结构。

结果：经过分子对接和结合能计算，发现1DM2(几丁质酶)的结合能为-11.44kcal/mol，在五个蛋白中结合能值最低，表明其结合能最强。通过此结果，再次确证了几丁质酶与三七皂苷R1的结合能力，验证了虚拟筛选结果；

结论：本实验再次确证了几丁质酶与三七皂苷R1的结合能力，验证了虚拟筛选结果；

表2.SwissDock对三七皂苷R1排名前5匹配靶标蛋白的结合能预测值

实施例3阐释三七皂苷R1药物分子对靶标蛋白的结合机制

方法：Discovery Studio TM(简称DS)，是全球知名的基于Windows系统，在统一的工作界面下，集成了所有药物设计与生物大分子计算方法与模拟工具的软件平台。DS软件可以更精确的进行药物—蛋白分子对接模拟，并对其结合位点，结合键类型、间距进行分析评价，深入阐释药物分子对靶标蛋白的结合机制。通过在DS软件中，将处理好的三七皂苷R1和1DM2(几丁质酶)结构进行CDOCKER模块的分子对接，参数设置按照常规数值进行设置，结果如图2所示。

结果：图2中，三七皂苷R1能够结合到几丁质酶的活性口袋中，该结合位点也是目前公认的几丁质酶抑制剂所结合的位点，结合区域(Site Sphere)为19.7498,-0.6556,11.297,12.2。并且，三七皂苷R1能与几丁质酶活性位点的各个关键氨基酸残基形成多种相互作用力，包括三七皂苷R1糖基侧链中H73、H70和H76原子与蛋白的TYR267、ASP213、MET210、GLU140和SN100分别形成5个氢键作用力；三七皂苷R1的甾环部分能与蛋白的TRP99和TRP218残基分别形成4个π-烷基和1个π-θ相互作用力。上述相互作用表明三七皂苷R1能够与几丁质酶形成较强的结合力。

实施例4体外几丁质酶活性抑制测定

原理：几丁质酶可水解人工底物pNP-GlcNAc，释放在405nm波长下具有特异性荧光吸收的发光基团。

方法：将几丁质酶、抑制剂和底物一同孵育后，通过检测405nm波长下的吸收值即可几丁质酶抑制剂的活性。试验在96孔酶标板中进行，筛选体系包括：10μM各浓度三七皂苷R1，0.2mM的pNP-GlcNAc和适量蒸馏水，溶解于60μL含有20％乙醇的Britton-Robinson缓冲液(pH＝6.0)中。30℃孵育1小时后，使用60μL的碳酸钠溶液终止反应。通过检测405nm荧光吸收情况来表征计算相关抑制剂的几丁质酶抑制活性。根据荧光信号差值与空白信号值的比值计算抑制率，用Graphpad prism6拟合IC₅₀曲线并计算IC₅₀值。

空白对照：不加三七皂苷R1和酶的空白对照

阳性对照：仅加入三七皂苷R1的阳性对照。

结果：经6个浓度的三七皂苷R1对几丁质酶抑制实验后，计算得到其IC₅₀＝41.837μM，具有显著抑制几丁质酶活性，与目前已报道的具有几丁质酶抑制活性的化合物allosamidin(IC₅₀＝128μM),acetazolamide(IC50＝164μM)和8-chlorotheophylline(IC₅₀＝410μM)相比，抑制几丁质酶的活性有显著提高，且随三七皂苷R1浓度增加，呈现出明显的剂量依赖性。

综上所述，三七皂苷R1对几丁质酶有显著的抑制活性，且抑制几丁质酶的活性呈现出明显的剂量依赖性，具有开发利用价值。