阅读说明：本技术 甘草酸与益生菌配伍作为缓解呕吐毒素危害的饲料添加剂 (Glycyrrhizic acid and probiotics are combined to be used as feed additive for relieving vomitoxin harm ) 是由 尹清强 许小向 常娟 王平 卢富山 王潇 刘超齐 党晓伟 朱群 李茂龙 张瑞 于 2020-06-18 设计创作，主要内容包括：本发明属于饲料添加剂技术领域,具体涉及甘草酸和益生菌配伍作为缓解呕吐毒素的饲料添加剂。本发明通过研究呕吐毒素诱导肠上皮细胞炎症和凋亡的分子机制,阐明了甘草酸对呕吐毒素诱导的细胞炎症和凋亡的修复机制,在此基础上本发明提出了甘草酸在制备缓解呕吐毒素危害的药物或饲料添加剂中的应用,并提供了一种甘草酸和益生菌配伍的饲料添加剂,为缓解呕吐毒素对动物的毒性、改善畜禽健康状况奠定基础。(The invention belongs to the technical field of feed additives, and particularly relates to a feed additive for relieving vomitoxin, which is prepared by mixing glycyrrhizic acid and probiotics. The invention clarifies a repairing mechanism of glycyrrhizic acid on the vomitoxin-induced cell inflammation and apoptosis by researching a molecular mechanism of vomitoxin-induced intestinal epithelial cell inflammation and apoptosis, provides an application of glycyrrhizic acid in preparing a medicine or feed additive for relieving the harm of vomitoxin on the basis, provides a feed additive prepared by mixing glycyrrhizic acid and probiotics, and lays a foundation for relieving the toxicity of vomitoxin to animals and improving the health condition of livestock and poultry.)

甘草酸与益生菌配伍作为缓解呕吐毒素危害的饲料添加剂

技术领域

本发明属于饲料添加剂技术领域，具体涉及甘草酸和益生菌配伍作为缓解呕吐毒素的饲料添加剂。

背景技术

脱氧雪烯醇(Deoxynivalenol,DON)，又名呕吐毒素，是由赤霉病菌产生的一类B型单端孢霉菌毒素，主要存在于小麦、玉米、燕麦、大麦等谷物中。DON对人和许多动物都存在毒性作用，其中猪是对DON最敏感的动物之一，会导致呕吐、腹泻、生长缓慢、免疫系统紊乱和经济损失。动物肠道是机体抵御外界有害物质入侵的第一道屏障，肠粘膜是吸收和运输葡萄糖、氨基酸、微量元素等多种营养物质的重要屏障。DON可引起肠道通透性增加、粘膜受损和坏死、细胞凋亡、抗氧化能力降低和线粒体功能障碍，从而导致猪肠道损伤。紧密连接蛋白是主要维持肠上皮屏障的连接性多蛋白复合物，当它们被环境条件(霉菌毒素、环境改变、饲料更替等)破坏时，会引起机体损伤和炎症，甚至影响营养物质的运输和吸收。

甘草是一种多年生草本植物，具有良好的解毒作用，甘草提取物被广泛应用于畜牧业，以促进动物生长，提高肉质，预防和治疗多种畜禽疾病，另有文献报道甘草提取物在临床上可用于治疗肝损伤。甘草酸(Glycyrrhinic acid,GA)是甘草中的一种提取物，具有多种药理活性，包括抗炎、调节免疫、抗氧化、抗病毒、抗癌、降血脂等作用，是否可将甘草酸用于治疗或缓解DON引起的肠道毒性、炎症，从而提供一种有效且经济实惠的兽药或饲料添加剂是本发明想要解决的技术问题。

益生菌是通过改善宿主胃肠道微生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主健康水平和健康状态的活菌制剂或其代谢产物，动物体内有益的细菌或者真菌主要有：乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酵母菌、肠杆菌等。益生菌具有调节动物胃肠道微生物区系、降解霉菌毒素、解除免疫抑制、抑制有害菌生长繁殖及促进动物生产等功效。是否能将甘草酸与益生菌进行配伍，从而获得一种经济、有效的缓解呕吐毒素对肠道细胞危害的饲料添加剂，这在现有技术中尚无报道，因而是本发明想要解决的主要技术问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明目的是提出甘草酸与益生菌配伍作为缓解DON的饲料添加剂；本发明通过研究DON诱导肠上皮细胞炎症和凋亡的分子机制，阐明了甘草酸对DON 诱导的细胞炎症和凋亡的修复机制，在此基础上本发明提出了一种甘草酸和益生菌配伍的饲料添加剂，从而为缓解DON对动物的毒性、改善畜禽健康状况奠定基础。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

甘草酸在制备缓解DON危害的药物或饲料添加剂中的应用。

优选的，甘草酸通过调节基因IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2、NF-Kb、Bax、Caspase 3或Bcl-2 的相对表达量缓解DON导致的细胞炎症或细胞早衰。

优选的，甘草酸通过调节乳酸脱氢酶、丙二醛、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的含量缓解DON导致的细胞氧化应激反应。

进一步优选的，所述细胞为猪肠道细胞。

优选的，所述甘草酸的添加量为50～800μg/mL。

基于一个总的发明构思，本发明还包括一种缓解DON危害的饲料添加剂，所述饲料添加剂由甘草酸、酵母菌和肠球菌组成。

优选的，所述饲料添加剂的添加量为甘草酸200～400mg/kg饲料、酵母菌0.5×10⁹～5× 10⁹CFU/kg饲料、肠球菌0.5×10⁹～5×10⁹CFU/kg饲料。

进一步优选的，所述饲料添加剂的添加量为甘草酸400mg/kg饲料、酵母菌1×10⁹CFU/kg 饲料、肠球菌1×10⁹CFU/kg饲料。

优选的，所述酵母菌为产朊假丝酵母；所述肠球菌为粪肠球菌。

基于一个总的发明构思，本发明还包括所述饲料添加剂在缓解DON导致的仔猪生长性能下降上的应用。

本发明研究结果表明，0.5μg/mL DON刺激6h即可引起细胞氧化应激、炎症或凋亡；与DON处理组相比，在加入DON的同时加入200～400μg/mL GA，可以显著提高细胞活力以及超氧化物岐化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活力，降低乳酸脱氢酶(LDH)释放、丙二醛 (MDA)含量以及细胞凋亡率。GA还可以显著下调IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2、NF-Kb、Bax 和Caspase3等炎性基因的相对表达量，显著上调抗炎基因Bcl-2的相对表达量，通过激活肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、固有免疫病原模式受体(Toll-like)信号通路和核转录因子(NF-κB) 信号通路，抑制炎症因子和趋化因子的产生，缓解DON诱导的氧化应激、炎症反应、细胞毒性和凋亡，保护肠道的完整性和动物健康。

本发明研究结果还表明，在断奶仔猪的饲粮中添加甘草酸400g/吨饲粮、产朊假丝酵母为1×10¹²CFU/吨饲粮、粪肠球菌为1×10¹²CFU/吨饲粮，可有效缓解DON对仔猪生长的危害。本发明为甘草酸与益生菌配伍作为缓解DON毒性的饲料添加剂、改善畜禽健康状况奠定了基础。

附图说明

图1： GA和DON对IPEC-J2细胞活力的影响；A，不同GA浓度在不同作用时间下对IPEC-J2 细胞活力的影响；B，不同浓度GA和0.5μg/mL DON共培养6h对细胞活力的影响；

图2 ：GA对DON处理后IPEC-J2细胞中乳酸脱氢酶释放量及抗氧化参数的影响；A，乳酸脱氢酶(LDH)释放量；B，丙二醛(MDA)含量；C，超氧化物歧化酶(SOD)活力值；D，过氧化氢酶(CAT)活力值；

图3： GA对DON引起的IPEC-J2细胞凋亡的影响；A，利用流式细胞术检测AnnexinV/FITC/PI 染色的凋亡细胞，其中Q1、Q2、Q3、Q4分别代表晚期凋亡细胞率、坏死细胞率、活细胞率和早期凋亡细胞率；B，细胞总凋亡率的定量分析；C，Q1、Q2、Q3、Q4在不同条件下的变化情况；

图4 ：GA对DON处理后IPEC-J2细胞相关基因表达量的影响；A，GA对细胞凋亡相关基因 (Bax、Bcl-2和Caspase3)的影响；B，GA对细胞炎症相关基因(IL-6、IL-8、TNF-α、 COX-2和NF-κB)的影响；

图5：样本的差异表达基因分析结果；A，PCA主成分分析；B，两个处理组之间的差异表达基因数；C，样本间差异表达基因的聚类热图分析；D，Venn分析图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。

1、试验材料

甘草酸(GA)由河南德邻生物制品有限公司提供。DON购自Sigma-Aldrich公司(美国)；磷酸盐缓冲液(PBS)，0.25％胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)，青霉素/链霉素(10,000unit/10,000μg/ml)，二甲基亚砜(DMSO)和噻唑基溴化四唑鎓(MTT)购自北京索莱宝生物有限公司；高糖培养基(HGDMEM)和胎牛血清(FBS)购自Biological Industries公司 (以色列)；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自上海启海富泰生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、胞内谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)试剂盒购自北京索莱宝生物有限公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司(美国)；逆转录试剂盒和TB GREEN试剂盒购自TaKaRa公司(中国大连)。

试验猪选用的是断奶的三元杂交仔猪(杜洛克×大白×长白)。所述酵母菌为产朊假丝酵母(Canida utilis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌号2.615)；所述肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌号1.2135)。

2、试验方法

1)细胞培养与样品配制

IPEC-J2细胞系由江西农业大学动物科学与技术学院提供。IPEC-J2细胞培养液为含10％ FBS和1％青霉素-链霉素的HGDMEM培养基，接种于25cm²培养瓶中，并放在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。当细胞融合率达到80％-90％时，分别接种于96孔板和6孔板培养24h，然后进行不同处理。将原装DON溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，配成1mg/mL母液，用 0.22μm滤膜过滤除菌。GA和DON均采用不含血清和抗生素的培养液稀释成不同浓度，现配现用。

2)数据统计与分析

试验中所有数据均以平均值±标准偏差表示，所有图均使用GraphPad Prism 7生成。所有数据均使用SPSS 20.0一般线性模型通过单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析，并使用Duncan检验进行多重比较。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

实施例1 GA对DON处理后细胞活力的影响

猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)是一种研究肠道功能常用的细胞模型，为了研究GA以及DON 对肠道细胞的影响，本发明以猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)为细胞模型展开研究。首先发明人采用MTT法测定不同GA浓度和处理时间对细胞增殖的影响：

取对数生长期的IPEC-J2细胞，用胰酶消化后以1×10⁴cells/孔的密度接种到96孔板中，孵育24小时后弃上清，用PBS洗两遍，然后分别加入不同浓度的GA(0μg/mL、50μg/mL、 100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL和800μg/mL)，培养时间分别为3h、6h、12g和24h；之后向每孔中添加10μL MTT溶液(5mg/mL)，并孵育4h。小心弃去上清液，并向每孔中加入150μLDMSO溶解。在室温下震荡10min后用酶标仪在490nm波长和参考波长630 nm下测定其吸光度值(OD)。每个处理6个重复。不同条件下IPEC-J2细胞活力测定结果见图1中A；图中control为空白组，不同上标表示与空白组相比的差异显著程度，其中差异显著性用^*(P<0.05)和^**(P<0.01)表示。

从图1中A可以看出，GA对细胞增殖的促进作用呈剂量依赖性和时间依赖性；不同浓度的GA处理6h后，细胞活力均显著增强(P<0.01)。因此，以6h作为GA的最佳处理时间。

发明人之前的研究表明，用0.5μg/mL DON刺激IPEC-J2细胞6h会显著降低细胞活力，为了考察GA对DON毒性的缓解效果，以DON浓度0.5μg/mL为对照组，在添加DON的同时加入不同浓度的GA，处理6h后细胞的增殖情况如图1中B所示；图中不同上标代表与对照组相比的差异显著程度，与对照组相比，差异显著性用^*P<0.05和^**P<0.01表示；与DON组对比，差异显著性用^#P<0.05和^##P<0.01表示，ns代表差异不显著(P>0.05)。

从图1中B中可以看出，在GA添加浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和 400μg/mL条件下，对于DON引起的细胞活力下降均有所缓解，细胞活力相比对照组有所提高，尤其当GA浓度达到400g/mL时，细胞增殖活性基本回到空白对照水平，说明利用 GA可以缓解DON引起的细胞活力下降，恢复细胞增殖活性。

实施例2 GA对DON处理后细胞氧化应激反应的影响

取对数生长期的IPEC-J2细胞，用胰酶消化后以5×10⁵cells/孔的密度在6孔板中培养细胞，直到细胞融合率达80％，然后分别按照对照组、DON组、GA组、GA+DON组处理细胞：其中DON组用0.5μg/mL DON处理6h，GA组用400μg/mL GA处理6h，GA+DON 组用400μg/mL GA和0.5μg/mL DON共处理6h，以未进行处理的细胞组为对照组，每组设置3个重复。处理相应时间后收集细胞，然后按照相应试剂盒的操作步骤测定各处理组 SOD、CAT酶活力及MDA含量。GA对DON引起的IPEC-J2细胞LDH释放率及抗氧化参数影响如图2所示。

从图中可以看出，与对照组相比，DON显著增加了乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和丙二醛(MDA)的水平(P<0.01)，降低了过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P<0.01)；而在DON处理的同时添加GA，与只用DON处理组相比，细胞中LDH的释放和 MDA含量显著降低(P<0.01)，细胞中SOD含量和CAT活力明显提高；说明添加GA后能够缓解DON引起的氧化应激反应，恢复细胞的抗氧化能力。

实施例3 GA对DON引起的细胞凋亡的影响

取对数生长期的IPEC-J2细胞，用胰酶消化后以5×10⁵cells/孔的密度在6孔板中培养细胞，直到细胞融合率达80％；然后分别按照对照组、DON组、GA组、GA+DON组处理细胞，其中DON组用0.5μg/mL DON处理6h，GA组用400μg/mL GA处理6h，GA+DON 组用400μg/mL GA和0.5μg/mL DON共处理6h，以未进行处理的细胞组为对照组，每组3 个重复；之后将收获的细胞用不含EDTA的胰酶消化5min，放入5mL离心管中，以800rpm 离心5min。将细胞用PBS洗涤两次以消除死细胞，重悬于100μL 1×结合缓冲液中，然后在室温黑暗条件下用5μLAnnexin V-FITC和5μL PI染色。最后，加入400μL 1×结合缓冲液，并在1h内通过流式细胞仪分析细胞凋亡水平；GA对DON诱导IPEC-J2细胞凋亡和炎症反应的影响如图3所示。

从细胞凋亡情况来看，与对照组相比，DON处理后IPEC-J2细胞的晚期细胞凋亡率(Q1) 和早期凋亡细胞率(Q4)明显升高，而GA的加入能显著减低因DON引起的晚期细胞凋亡率和早期凋亡细胞率的升高现象，即，GA的加入能显著缓解因DON引起的细胞凋亡现象。与之相对应的，DON会导致IPEC-J2活细胞率明显下降，坏死细胞率基本不变；而GA的加入显著改善DON引起的活细胞成活率低的情况，坏死细胞率甚至低于空白对照。

实施例4 GA对DON处理后IPEC-J2细胞中相关基因表达量的影响

为了进一步研究GA缓解DON引起细胞凋亡的原因，发明人针对IPEC-J2细胞中与细胞凋亡有关的基因Bax、caspase-3和Bcl-2的表达量进行了测定；除了上述基因，一些炎症类基因的表达量变化也会导致细胞早衰与凋亡，如IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2和NF-κB 等，因此发明人针对上述基因的表达量进行了测定。

首先将IPEC-J2细胞以5×10⁵cells/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合率达到80％，经过上述四个处理组(对照、DON、GA、GA+DON)后，采用使用Trizol提取总RNA，将RNA沉淀溶于50μL无RNase的水中，并保存在-80℃。通过NanoDrop ND-1000分光光度计测量RNA浓度，计算OD260/OD280和OD260/OD230，并通过琼脂糖凝胶验证RNA 的完整性。使用TB GREEN试剂盒，将每个样品中约1μg的总RNA在42℃的条件下保持 2min去除gDNA，通过反转录生成cDNA。使用CFX Connect^TM实时PCR检测系统进行实时PCR。PCR条件为95℃预变性300s，之后95℃20s、60℃30s和72℃30s进行38个循环。以GAPDH作为内参基因，使用2^-ΔΔCT方法分析每个基因的相对表达量，所有测定基因及扩增基因所用引物对均列于表1中。

表1待测基因及扩增引物序列

各组基因表达量测定结果如图4所示；从图4中A可以看出，DON显著上调Bax和caspase-3基因的相对mRNA丰度(P<0.01)，下调Bcl-2的mRNA丰度(P<0.05)；在加入 DON的同时加入GA，与DON组相比，能显著降低Bax和caspase-3的mRNA丰度(P<0.01)，增加了Bcl-2的mRNA丰度(P<0.05)，说明GA能够通过调节Bax、caspase-3和Bcl-2的表达量改善细胞由DON引起细胞周期缩短或凋亡情况；

图4中B结果显示，采用DON处理6h后，IPEC-J2细胞中IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2 和NF-κB等炎性基因的相对mRNA丰度显著上调(P<0.01)；然而，加入GA后可以显著降低上述基因的表达量(P<0.01)，即，GA能够通过调节IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2和 NF-κB的表达量改善细胞由DON引起的炎症现象。

实施例5 RNA-seq数据分析

为探究GA减轻DON诱导的IPEC-J2细胞凋亡和炎症的分子机制，对对照组(Control， CON)、DON、GA和GAD(GA+DON)四组处理的细胞进行RNA-seq分析，筛选其差异表达基因(DEGs)，每组3个重复；具体过程如下：

将IPEC-J2细胞以5×10⁵cells/孔的密度接种在6孔板中，待细胞融合率达到80％，经过上述四个处理组(对照、DON、GA、GA+DON)后，采用使用Trizol提取总RNA，将 RNA沉淀溶于50μL无RNase的水中，并保存在-80℃。使用安捷伦2100生物分析仪检测 RNA的质量和纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。纯化后的mRNA经Oligo(dT) beads富集，Mg²⁺离子破碎缓冲液将其破碎成300bp。然后，用6bp随机引物将片段mRNA 逆转录成cDNA。然后以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA。合成的产物用PCR纯化试剂盒进行纯化，然后进行端部修复、poly(a)添加和Illumina测序适配器连接。根据大小选择测序文库，使用安捷伦2100生物分析仪检测其大小。最后，使用Illumina HiSeq 4000平台(Illumina,San Diego,CA,USA)进行测序，采用配对(PE 150bp)的测序策略。

通过采用Cutadapt去除3'端带接头的序列，去除平均质量分数低于Q20的Reads，对原始读码进行质量评估。然后，使用HISAT2软件将过滤后的Reads比对到参考基因组上，将比对到基因组上的Reads分布情况进行统计分析。使用HTSeq统计比对到每一个基因上Read Count值，作为基因的原始表达量。为了使不同基因、不同样本间的基因表达水平具有可比性，采用FPKM对表达量进行标准化，FPKM(Fragments Per Kilo bases per Millionfragments)是每百万片段中每千碱基长度的片段数目。此外，用R语言的DESeq软件包，根据表达量对各样品进行PCA主成分分析。对DESeq2(Bioconductor version 1.6.2)进行差异表达分析，两组间以P<0.05为差异性选择阈值，以log2(fold change)>1绝对值作为差异表达基因(difference expressed genes，DEGs)。

在过滤低质量的reads之后，Illumina Hiseq测序平台产生大约4200万个cleanreads(93％)，且超过96％的clean reads比对到参考基因组。之后对12个样本的基因表达变化进行分析，并根据基因表达量对每个样本进行PCA主成分分析，具体结果见图5；

从图5中A可以看出，PC1轴解释了86％的总变异，PC2轴解释了10％的总变异。从图5中B可以看出，与对照组相比，DON组、GA组和GA+DON组分别检测到1576个差异基因(668个上调和908个下调)，289个基因(211个上调和78个下调)和1398个基因(734 个上调和664个下调)；在DON与GA+DON组的对比中，检测到154个基因，其中103个上调，51个下调。随后在热图中分析DEGs簇，从图5中C可以看出，相同处理的样品之间有更多的相似性，每个处理中的3个生物学重复使用DEGs进行层次聚类，彼此之间以相近的距离聚在一起，表明每个处理具有良好的重现性。通过Venn图分析DON组、GA组、 GAD组分别与对照组，以及GAD组与DON组的共表达DEGs，从图5中D可以看出，对照组与DON组，以及DON与GAD组共表达了79个DEGs，其中有37个差异基因在对照组与DON组中表达下调，在DON与GAD组中表达上调；有26个差异基因在对照组与 DON组中表达上调，在DON与GAD组中表达下调。

实施例6 GO和KEGG通路富集分析

为了更好地理解DEGs所涉及的生物学过程和途径，发明人利用基因本体论(GO)数据库和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库中对DEGs进行功能注释。GO功能分析主要包括三个部分：生物过程(Biologicalprocess， BP)、分子功能(Molecular function,MF)和细胞成分(Cellular component，CC)；使用topGO 进行GO富集分析，分析时利用GO term注释的差异基因对每个term的基因列表和基因数目进行计算，然后通过超几何分布方法计算P值(显著富集的标准为P<0.05)，找出与整个基因组背景相比，差异基因显著富集的GO term，从而确定差异基因行使的主要生物学功能。

通过对对照组(CON)与DON组，对照组与GA组，对照组与GAD组，以及DON组与 GAD组进行GO注释发现，从生物过程(BP)水平来看，除了一些DEGs注释到对刺激物的反应和免疫系统上，DEGs主要集中在系统发育和细胞分化相关的功能上。从分子功能(MF) 水平来看，除了DON和GAD组外，其余三组的DEGs几乎都与序列特异性DNA结合相关。从细胞成分(CC)水平来看，CON和DON组，以及CON和GAD组，DEGs的作用集中于胞内细胞器；而CON和GA组的DEGs几乎注释于胞外区域或细胞膜，且在一定程度上与DON和GAD组具有相似的GO注释。

在上述四种不同的比较中，发明人对DEGs进行了KEGG通路富集分析，得到了在不同实验条件下变化显著的通路富集。KEGG是一个与路径相关的数据库，用于理解生物系统的高级功能和实用程序，P<0.05为当前分析的显著性。所有的DEGs根据细胞过程、环境信息处理、疾病、代谢和生物系统进行KEGG通路注释；结果发现，在CON和DON组中 DEGs参与多种信号转导途径，包括肿瘤坏死因子、Notch、MAPK、Ras和NF-kappa B信号转导途径，以及Th1和Th2细胞分化、B细胞受体和Toll样受体信号转导途径，还包括甾体生物合成、不饱和脂肪酸生物合成和萜类骨架生物合成三种代谢途径。对于CON和 GA组，其途径包括细胞粘附分子(CAMs)、白细胞跨内皮细胞迁移、补体和凝血级联、 PI3K-Akt信号途径等。由于CON和DON组，以及CON和GAD组共享了900多个DEGs，它们之间富集的途径相似，都与信号转导和免疫系统有关。有趣的是，DON和GAD组，与CON和DON组相比，发现了一些相同的途径，如TNF、cAMP、白细胞跨内皮细胞迁移等，但Jak-STAT信号通路是DON和GAD组独有的。此外，还富集到一些免疫系统，包括趋化因子信号途径、Fc epsilon-RI信号途径、补体和凝血级联以及Fcγ-R介导的吞噬作用。

发明人利用GO和KEGG通路富集对实施例5中对照组与DON组，以及DON与GAD 组共表达的79个DEGs进行功能注释与富集。GO注释结果表明，大多数被注释的BP本体集中于免疫细胞的迁移，如髓系白细胞、白细胞、中性粒细胞、单核细胞和粒细胞等；而其中一些DEGs被注释为外部刺激和炎症反应。MF方面，DEGs被注释到Notch结合、受体结合、趋化因子、趋化因子受体、IL8(CXCL8)受体结合等。利用KEGG富集后，包括 CXCL8、CCL5、IL15等DEGs被富集到趋化因子和肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-受体相互作用通路。

实施例7甘草酸与益生菌配伍对缓解DON毒性的影响

实施例1-6结果表明，GA能够抑制炎症因子和趋化因子的产生，显著减缓氧化应激和减少坏死细胞凋亡，并具有一定的免疫调节作用；因而当细胞受到DON影响，加入甘草酸可减轻DON诱导的肠道炎症反应，改善DON引起的病理活动。为了获得一种经济有效的饲料添加剂，发明人将GA与益生菌进行配伍，考察了所得组合制剂对缓解DON毒性的效果。

所用益生菌选择产朊假丝酵母和粪肠球菌，其中粪肠球菌选用MRS培养基：胰蛋白胨 15g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，K₂HPO₄ 2g，乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，水1000mL，pH为6.2～6.6；培养基在121℃、0.15MPa条件下灭菌20min；粪肠球菌接种到MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养24h。

产朊假丝酵母选用YPD培养基：蛋白胨20g，酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水1000mL，pH为7.0～7.2；培养基在121℃、0.15MPa条件下灭菌20min；产朊假丝酵母接种到YPD 培养基中，放在30℃、180r/min的摇床中振荡培养24h。

使用的产朊假丝酵母和粪肠球菌浓度均为1×10⁶colony formed unit(CFU)/mL；不同处理条件下猪肠上皮细胞活力测定结果见表2；

表2不同处理条件对猪肠上皮细胞活力的影响

注：表中同列数据后面的小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)。

从表2的数据可以看出，DON使细胞的活力值由对照组的100降至78.14。添加DON的同时添加甘草酸，细胞活力值提高至88.03；添加DON的同时添加产朊假丝酵母，细胞活力值仅为62.94，而添加DON的同时添加粪肠球菌，细胞活力值能提高至90.68。上述结果表明，甘草酸或粪肠球菌对缓解DON引起的细胞活力下降具有显著效果，而单独使用产朊假丝酵母会恶化DON引起的细胞活力下降趋势。

由于之前的研究表明，产朊假丝酵母在动物体内具有降解DON的作用，而且将甘草酸、产朊假丝酵母、粪肠球菌与DON同时使用，细胞活力值能恢复至89.13，缓解效果显著，因而在下面的动物饲养试验中选用甘草酸+产朊假丝酵母+粪肠球菌组合。

实施例8甘草酸与益生菌配伍对缓解DON导致的仔猪生长性能下降的影响

以断奶的三元杂交仔猪160头，随机地分为4个组，每个组4个重复，每个重复10头仔猪。4组的处理条件分别为：对照组(无GA和DON)、负对照组(DON组，DON含量为1000mg/吨饲粮)、甘草酸与益生菌配伍组(甘草酸含量为400g/吨饲粮+产朊假丝酵母1×10¹²CFU/吨饲粮+粪肠球菌1×10¹²CFU/吨饲粮)、DON+甘草酸与益生菌配伍组(DON 1000 mg/吨饲粮+甘草酸400g/吨饲粮+产朊假丝酵母1×10¹²CFU/吨饲粮+粪肠球菌1×10¹²CFU/吨饲粮)。仔猪日粮配方参照NRC(2012)的推荐标准。正试期为30天，自由采食、自由饮水，饲养管理按猪场的要求进行。不同处理条件下仔猪的生长情况如表3所示。

表3不同处理条件下仔猪的生长情况对比

注：表中同行数据后面的小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，相同则表示差异不显著(P>0.05)。

表3的试验结果表明，单独喂食甘草酸与产朊假丝酵母和粪肠球菌配伍的饲料添加剂可在一定程度上提高仔猪的日增重和日采食量；而将DON与甘草酸、产朊假丝酵母、粪肠球菌同时使用，可缓解DON对仔猪生长性能的负面影响，使仔猪日增重与仅用DON处理组相比提高12.56％(P<0.05)，并可降低由DON导致的仔猪死亡率。

概括而言，GA能够抑制炎症因子和趋化因子的产生，显著减缓氧化应激和减少坏死细胞凋亡，并具有一定的免疫调节作用；因而当细胞受到DON影响，加入甘草酸可减轻DON诱导的肠道炎症反应，改善DON引起的病理活动。甘草酸与益生菌配伍可缓解DON对细胞活力及仔猪生长性能的危害作用；因而，甘草酸与益生菌配伍有望成为一种新的饲料添加剂，既可以减轻DON的毒性，又可以提高肠道免疫力及动物的生产效率。