阅读说明：本技术 一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗 (Preparation method of egg drop syndrome vaccine and vaccine ) 是由 邢刚 丁莉 李成山 岳丰雄 左榕琳 肖倩 潘倩 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及家禽疫苗的技术领域,具体涉及一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗。鸡产蛋下降综合征疫苗,包括灭活的产蛋下降综合征病毒的抗原液和疫苗佐剂。此疫苗所用抗原液HA效价高,成本低。鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法,包括如下步骤：先将全悬浮鸭胚视网膜细胞复苏、培养,然后将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到培养好的全悬浮鸭胚视网膜细胞中,同时添加DMEM培养基进行培养,然后收毒、冻融。可以得到效价更高、成本更低的疫苗。(The invention relates to the technical field of poultry vaccines, in particular to a preparation method of a vaccine for egg drop syndrome and the vaccine. A vaccine for egg drop syndrome of chicken comprises an antigen solution of inactivated egg drop syndrome virus and a vaccine adjuvant. The antigen liquid used by the vaccine HAs high HA titer and low cost. The preparation method of the egg drop syndrome vaccine comprises the following steps: reviving and culturing the fully suspended duck embryo retinal cells, inoculating the egg drop syndrome virus (K-11 strain) to the cultured fully suspended duck embryo retinal cells, adding a DMEM culture medium for culturing, and then performing virus harvesting and freeze thawing. The vaccine with higher titer and lower cost can be obtained.)

一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗

技术领域

本发明涉及家禽疫苗的技术领域，具体而言，涉及一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗。

背景技术

鸡产蛋下降综合征(Eggs drop syndrome，简称EDS)是由产蛋下降综合征病毒(Eggs drop syndrome virus，简称EDSV)引起的产蛋鸡常见的一种传染病，该病虽致死率较低，但感染鸡产蛋量会严重下降，且影响蛋品质。患鸡主要表现为群发性产蛋率下降、蛋壳异常、蛋体畸形、蛋质低劣等症状。本病可使产蛋鸡群产蛋率下降30-50％，蛋的破损率达40％，无壳蛋、软壳蛋可达15％，给养鸡业造成严重的经济损失。

目前，我国鸡产蛋下降综合征相关疫苗的生产主要采用接种鸭胚培养制备疫苗，由于SPF鸭胚较贵，且量很少，无法满足实际生产需求，而非免鸭胚又无法保证鸭胚来源，鸭胚中有可能含有其它病毒，对其所繁殖EDSV的效价造成很大影响，不同批次间的疫苗质量差异巨大。同时鸭胚培养的病毒悬液中含有大量异源蛋白，疫苗副反应大。

近年来，禽苗类相关产品都在努力脱离胚源生产，寻找新的生产介质，如亚单位疫苗、细胞源疫苗。也有报道使用EB66细胞制备鸡产蛋下降综合征疫苗的，但其病毒滴度在17log2左右，配苗后免疫抗体水平在10-12log2之间，抗体水平仍然比较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡产蛋下降综合征疫苗，此疫苗的抗原HA效价高，成本低。

本发明的另一目的在于提供一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法，以得到效价更高、成本更低的疫苗。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种鸡产蛋下降综合征疫苗，包括灭活的产蛋下降综合征病毒的抗原液和疫苗佐剂。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述灭活的产蛋下降综合征病毒的抗原液由鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞培养获得。

本发明提出一种如上所述鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法，包括如下步骤：先将全悬浮鸭胚视网膜细胞复苏、培养，然后将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到培养好的全悬浮鸭胚视网膜细胞中，同时添加DMEM培养基进行培养，然后收毒、冻融。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述全悬浮鸭胚视网膜细胞复苏、培养包括如下步骤：从液氮罐中取出全悬浮鸭胚视网膜细胞，在37℃水浴下迅速融化，然后再200g离心5分钟，弃去上层清液，再用30ml细胞生长液悬浮鸭胚视网膜细胞，再将全悬浮鸭胚视网膜细胞接种于125ml的摇瓶中，将摇瓶置于摇床中，设置转速为160r/min，温度37℃、CO₂浓度为5％条件下培养，培养2-3日，当细胞密度达到至少6.0×10⁶/ml时，将全悬浮鸭胚视网膜细胞进行扩大传代至250ml摇瓶中，细胞起始密度为1.0×10⁶/ml，放于摇床中，继续培养。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述全悬浮鸭胚视网膜细胞进行扩大传代至250ml摇瓶中后，继续培养至细胞密度为2.0×10⁶/-1.0×10⁷/ml，再将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种量为0.0001-0.01MOI。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中后的培养温度为35-39℃。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中后的培养时间为3-5天。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述DMEM培养基添加量是培养液体积比的0-20％。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到培养好的全悬浮鸭胚视网膜细胞中，放入摇床培养，转速为160r/min，CO₂浓度为5％。

本发明提供的一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗，至少具有以下有益效果：

本发明采用全悬浮细胞增殖产蛋下降综合征病毒，方法快速简捷，细胞来源清晰明确，并且避免了使用鸭胚生产造成的蛋白杂质过高影响免疫原性，也减少了胚源带来外源病毒的风险。此技术培养病毒时间短，病毒滴度高，利用此工艺生产的疫苗效价高，具有较高的经济效益和市场前景。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。

本发明提出一种鸡产蛋下降综合征疫苗，包括灭活的产蛋下降综合征病毒的抗原液和疫苗佐剂。这样制备的疫苗效价更高，免疫后抗体增长速度更快，且成本低廉。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述灭活的产蛋下降综合征病毒的抗原液由鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞培养获得。此方法获得的产蛋下降综合征病毒的抗原液，成本低廉，且获得的疫苗效价高，免疫效果好。

本发明提出一种如上所述鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法，包括如下步骤：先将全悬浮鸭胚视网膜细胞复苏、培养，然后将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到培养好的全悬浮鸭胚视网膜细胞中，同时添加DMEM培养基进行培养，然后收毒、冻融。这样的制备方法，十分简单，采用全悬浮鸭胚视网膜细胞成本低廉，制备的疫苗效价高，免疫效果好。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述全悬浮鸭胚视网膜细胞复苏、培养包括如下步骤：从液氮罐中取出全悬浮鸭胚视网膜细胞，在37℃水浴下迅速融化，然后再200g离心5分钟，弃去上清液，再用30ml细胞生长液悬浮全悬浮鸭胚视网膜细胞，接种于125ml的摇瓶中，将摇瓶置于摇床中，设置转速为160r/min，温度37℃、CO₂浓度为5％条件下培养，培养2-3日，当细胞密度达到至少6.0×10⁶/ml时，将全悬浮鸭胚视网膜细胞进行扩大传代至250ml摇瓶中，细胞起始密度为1.0×10⁶/ml，放于摇床中，继续培养。这样可以将全悬浮鸭胚视网膜细胞充分复活且培养出密度合适的全悬浮鸭胚视网膜细胞受体培养基。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述全悬浮鸭胚视网膜细胞进行扩大传代至250ml摇瓶中后，继续培养至细胞密度为2.0×10⁶/-1.0×10⁷/ml，再将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中。这样的细胞密度更加有利于病毒增殖。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种量为0.0001-0.01MOI。这样的接种量使得培养基可以负荷的同时可以最大程度的利用培养基。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中后的培养温度为35-39℃。这样的温度更有利于病毒的增殖。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到全悬浮鸭胚视网膜细胞中后的培养时间为3-5天。这样的培养时间可以使病毒效价达到最高峰。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述DMEM培养基添加量是培养液体积比的0-20％。这样使得培养基中的养分更加充足，有利于病毒增殖。

进一步的，在本发明的一些实施例中，上述将鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种到培养好的全悬浮鸭胚视网膜细胞中，放入摇床培养，转速为160r/min，CO₂浓度为5％。这样的培养条件使得细胞生长更好，病毒增殖更快速。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

试验例1：鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳接种细胞密度试验

取4个250ml的摇瓶培养全悬浮鸭胚视网膜细胞，分别培养至细胞密度约为2.0×10⁶/ml、6.0×10⁶/ml、8.0×10⁶/ml、1.0×10⁷/ml，然后分别接种鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)，同时添加体积比为15％的DMEM培养基，放入摇床，160r/min、37℃、5％CO₂培养。96h后收毒，冻融1次，测定其HA效价及病毒含量。结果详见表1。

表1鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳接种细胞密度试验结果

结果表明，接种产蛋下降综合征病毒时，细胞密度为8.0×10⁶/ml时，HA效价可达到23log2，病毒含量最高，为10^7.6TCID₅₀/0.1ml，所以细胞的最佳接种密度为8.0×10⁶/ml。

试验例2：鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳接种量试验

取3个250ml的摇瓶培养全悬浮鸭胚视网膜细胞，当细胞密度培养至8.0×10⁶/ml，分别以0.01MOI、0.001MOI、0.0001MOI接种鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)，同时添加体积比为15％的DMEM培养基，放入摇床，160r/min、37℃、5％CO₂培养。96h后收毒，冻融1次，测定其HA效价及病毒含量。结果详见表2。

表2鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳接种量试验结果

结果表明，鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)以0.001MOI接种，HA效价可达到22log2，收获的病毒含量略高，为10^7.8TCID₅₀/0.1ml，所以将产蛋下降综合征病毒的最佳接种量定为0.001MOI。

试验例3：鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳培养温度试验

取3个250ml的摇瓶培养全悬浮鸭胚视网膜细胞，当细胞密度培养至8.0×10⁶/ml时，按照0.001MOI接种鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)，同时添加体积比为15％的DMEM培养基，放入摇床，分别以35℃、37℃、39℃培养，摇床转速为160r/min，CO₂浓度为5％培养。分别在48h、72h、96h取样冻融1次，测定其HA效价。结果详见表3。

表3鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳培养温度试验结果

结果表明，鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种后，以39℃培养，HA效价可迅速提高，但最终病毒效价没有37℃培养的高，所以将K-11株病的培养最佳温度定为37℃。

试验例4：鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳收毒时间

取1个250ml的摇瓶培养全悬浮鸭胚视网膜细胞，当细胞密度培养至8.0×10⁶/ml，按照0.001MOI接种鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)，同时添加体积比为15％的DMEM培养基，放入摇床，160r/min、35℃、5％CO₂培养，分别在接种后72h、96h、120h取样，冻融1次，测定HA效价及病毒含量。结果详见表4。

表4鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)最佳收毒时间试验结果

结果表明，鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)接种后，培养96h和120h后，HA效价相差不大，病毒含量结果显示，培养96h略高，可达到10^7.6TCID₅₀/0.1ml，所以将产蛋下降综合征病毒接种后最佳的收毒时间定为96h。

试验例5：DMEM添加量的对比试验

取4个250ml的摇瓶培养全悬浮鸭胚视网膜细胞，当细胞密度培养至8.0×10⁶/ml，按照0.001MOI接种鸡产蛋下降综合征病毒(K-11株)，同时分别添加体积比为0％、10％、15％、20％的DMEM培养基，37℃，5％CO₂条件下培养96h，收毒，冻融1次，测定HA效价及病毒含量。结果详见表5。

表5 DMEM添加量的对比试验结果

通过DMEM不同添加量试验，表明添加体积比15％的DMEM时，收获病毒的HA效价及病毒含量最高，分别为24log2和10^7.3TCID₅₀/0.1ml。

试验例6：鸡产蛋下降综合征细胞毒与鸭胚毒的免疫原性研究

取鸡产蛋下降综合征细胞毒和鸭胚毒，分别加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃灭活48小时，将灭活完全的细胞毒和鸭胚毒，分别加入灭菌后的吐温-80混匀配制成水相，然后按油相∶水相为2∶1的比例，分别制备成细胞毒油乳剂灭活疫苗和鸭胚毒油乳剂灭活疫苗。

将20只35日龄SPF鸡随机平均分为2组，10只/组，分别经颈部皮下注射细胞毒油乳剂灭活疫苗及鸭胚毒油乳剂灭活疫苗，均为0.5ml/只，另取10只鸡不免疫作为对照。免后21日、28日、35日，分别采集试验鸡血分离血清，用EDSV-HI抗原检测血清中HI抗体。结果见表6。

表6鸡产蛋下降综合征细胞毒与鸭胚毒免疫原性试验结果

结果表明，细胞毒疫苗免疫组HI抗体平均值高于鸭胚毒疫苗免疫组。可见，细胞毒免疫原性较好。

本发明提供的一种鸡产蛋下降综合征疫苗的制备方法及疫苗，至少具有以下有益效果：

本发明采用全悬浮细胞增殖产蛋下降综合征病毒，方法快速简捷，细胞来源清晰明确，并且避免了使用鸭胚生产造成的蛋白杂质过高影响免疫原性，也减少了胚源带来外源病毒的风险。此技术培养病毒时间短，病毒滴度高，利用此工艺生产的疫苗效价高，具有较高的经济效益和市场前景。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。