一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用 (DNA vaccine for simultaneously expressing FAdV-4 spike protein 1 and spike protein 2 genes and construction method and application thereof ) 是由 刘青涛 李银 杨婧 黄欣梅 赵冬敏 韩凯凯 刘宇卓 章丽娇 于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明设计特异性引物,利用重叠PCR扩增技术,将FAdV-4的纤突蛋白1与纤突蛋白2基因通过2A肽基因连接形成融合基因fibers2A,然后将融合基因fibers2A插入pCDNA3.1真核表达载体,构建重组质粒pC-fibers2A,将重组质粒pC-fibers2A转化至大肠杆菌DH5α,扩大培养后提取重组质粒即为DNA疫苗。将该重组质粒用于免疫试验,结果表明该DNA疫苗可以免疫SPF鸡产生抗体,减小发病率和死亡率,提高免疫预防效果。(The invention belongs to the technical field of biological medicines, and particularly relates to a DNA vaccine for simultaneously expressing FAdV-4 spike protein 1 and spike protein 2 genes, and a construction method and application thereof. The invention designs a specific primer, utilizes an overlap PCR amplification technology to connect the fiber protein 1 of FAdV-4 and the fiber protein 2 gene through a 2A peptide gene to form a fusion gene fibers2A, then inserts the fusion gene fibers2A into a pCDNA3.1 eukaryotic expression vector to construct a recombinant plasmid pC-fibers2A, converts the recombinant plasmid pC-fibers2A into Escherichia coli DH5 alpha, and extracts the recombinant plasmid after amplification culture, namely the DNA vaccine. The recombinant plasmid is used for an immunity test, and the result shows that the DNA vaccine can immunize SPF chickens to generate antibodies, reduce morbidity and mortality and improve the immunity prevention effect.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。
背景技术
目前I群禽腺病毒共有12个血清型，其中血清4型禽腺病毒(FAdV-4)是目前对我国养鸡业危害最为严重的禽腺病毒。2014年在我国鸡群中爆发了由FAdV-4引起的心包积液-包涵体肝炎综合征，并迅速传播蔓延至全国，给我国养鸡业造成了巨大经济损失，但目前仍没有疫苗可用。文献报道显示，由感染鸡的肝脏经甲醛灭活制备的疫苗具有良好的免疫保护效果，由鸡肝癌细胞系LMH培养制备的病毒灭活疫苗也能够提供有效保护，但是以上2种疫苗在制备和使用过程中均涉及到病毒的扩增培养，存在散毒风险。研究显示纤突蛋白的杆状病毒表达产物具有良好的免疫原性，能够对鸡提供免疫保护，但是杆状病毒表达存在表达量低、成本高等问题。
DNA疫苗又称基因疫苗或核酸疫苗，具有比其他传统疫苗更多的优势，因此又被称为继灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗后的第三代疫苗。它可以在活体内表达疫苗抗原，从而诱导针对疫苗的特异性体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗制备简单，成本低廉，生产过程不涉及病毒的扩增培养，不存在散毒问题；此外，DNA疫苗可以同时表达不同的疫苗抗原，并且非常稳定，易于储存和运输。但是，目前尚未有将FAdV-4的纤突蛋白1和纤突蛋白2同时用于DNA疫苗的研制。
发明内容
为了解决现有技术针对FAdV-4的疫苗存在的散毒、表达量低等缺陷，本发明提供了一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1(fiber1)与纤突蛋白2(fiber2)基因的DNA疫苗及其构建方法和应用。本发明首先将fiber1和fiber2基因融合到一起，然后将融合基因连接到真核表达载体，较单一蛋白基因的表达，既提高了表达抗原的免疫原性，又保证了fiber1和fiber2基因的同步表达，且所述DNA疫苗制备简单，成本低廉，安全有效。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明提供一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗，所述DNA疫苗中含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述的DNA疫苗是通过将SEQ ID No.1所示的核苷酸序列克隆至表达载体中得到。
本发明还提供一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：
(1)设计FAdV-4纤突蛋白1的特异性引物P1和P2和纤突蛋白2的特异性引物P3和P4；
(2)提取FAdV-4的DNA作为模板DNA，利用特异性引物P1和P2对纤突蛋白1进行PCR扩增；利用特异性引物P3和P4对纤突蛋白2进行PCR扩增；
(3)将步骤2中纤突蛋白1的PCR扩增产物和纤突蛋白2的PCR扩增产物作为重叠PCR扩增的模板，利用特异性引物P1和P4再进行重叠PCR扩增，胶回收重叠PCR扩增产物，得到融合基因fiber2A；
(4)将步骤(3)得到的融合基因fiber2A和质粒pCDNA3.1进行HindIII和NotI双酶切，然后用T4连接酶将融合基因fibers2A和质粒pCDNA3.1进行连接，构建成表达FAdV-4纤突蛋白1和纤突蛋白2基因的重组质粒pC-fibers2A；
(5)将重组质粒pC-fibers2A转化至大肠杆菌DH5α，扩大培养后提取重组表达质粒即为所述DNA疫苗。
优选地，所述特异性引物P1的序列为：5'AATTAAGCTTATGTCGGCCCTAATCGCCTCCGCAGCCG 3'(如SEQ ID No.2所示)，所述特异性引物P2的序列为：5'CCCGCCTGCTTAAGCAGGCTAAAGTTGGTCGCGCCGCTGCCGGGGCCCGGAGCATT 3'(如SEQ ID No.3所示)，所述特异性引物P3的序列为：5'GCTTAAGCAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGCTCCGGGCCCCT 3'(如SEQ IDNo.4所示)，所述特异性引物P4的序列为：5'TAAAGCGGCCGCTTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGCTG3'(如SEQ ID No.5所示)。
优选地，步骤(2)中所述对纤突蛋白1的PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，57℃45s，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。
优选地，步骤(2)中所述对纤突蛋白2的PCR扩增程序为：95℃5min；95℃30s，59℃45s，72℃2min，35个循环；72℃7min。
优选地，步骤(3)中所述重叠PCR扩增的程序为：95℃5min；95℃30s，65℃45s，72℃3min，35个循环；72℃7min。
本发明还提供一种所述的同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗在制备预防鸡心包积液-包涵体肝炎综合征药物中的应用。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的DNA疫苗能够同时表达FAdV-4的纤突蛋白1和纤突蛋白2，从而能够更好的提高对FAdV-4的免疫预防效果，且所述DNA疫苗的制备生产过程不涉及FAdV-4病毒的扩增培养，不存在散毒风险。
(2)由于FAdV-4的基因组中fiber1和fiber2两种抗原使用不同的编码框，并且fiber2编码框起始密码子临近的碱基与fiber1编码框终止密码子附近的碱基重叠在一起，因此利用PCR对FAdV-4进行扩增时不能同时扩增出fiber1和fiber2抗原的编码框。而本发明通过分别扩增出fiber1和fiber2基因的序列，然后通过重叠PCR扩增技术将fiber1和fiber2两种抗原的编码框进行扩增，并通过2A肽序列将两个编码框连接在一起，保证了两种抗原能够同时进行表达，提高对FAdV-4的免疫预防效果。
(3)本发明对于推动血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的免疫防控具有重要意义。
附图说明
图1为纤突蛋白1(fiber1)和纤突蛋白2(fiber2)基因的PCR扩增产物的核酸电泳测试结果图；
其中泳道1为fiber1基因扩增产物，泳道2为fiber2基因扩增产物。
图2为融合基因fibers2A的重叠PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳测试结果图。
图3为重组质粒pC-fibers2A的酶切鉴定结果图。
图4为重组质粒pC-fibers2A的转染DF1细胞后间接免疫荧光检测结果，其中(A)为fiber1，(B)为fiber2。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：
1、设计FAdV-4纤突蛋白1的特异性引物P1和P2和纤突蛋白2的特异性引物P3和P4，其序列如下：
P1：5'AATTAAGCTTATGTCGGCCCTAATCGCCTCCGCAGCCG 3'(如SEQ ID No.2所示)；
P2：5'CCCGCCTGCTTAAGCAGGCTAAAGTTGGTCGCGCCGCTGCCGGGGCCCGGAGCATT3'(如SEQID No.3所示)；
P3：5'GCTTAAGCAGGCGGGCGATGTGGAAGAAAACCCGGGCCCGATGCTCCGGGCCCCT 3'(如SEQID No.4所示)；
P4：5'TAAAGCGGCCGCTTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGCTG 3'(如SEQ ID No.5所示)。
2、PCR扩增FAdV-4纤突蛋白1(fiber1)基因
(1)提取FAdV-4的DNA作为模板DNA，用特异性引物P1和P2进行fiber1基因的PCR扩增；
(2)PCR扩增体系：特异性引物P1 1μL，引物P2 1μL，含DNA聚合酶的反应液25μL，模板DNA 3μL，灭菌去离子水补齐到50μL；
(3)PCR扩增程序：95℃5min，95℃30s，57℃45s，72℃1.5min，35个循环；72℃7min；
(4)将fiber1的PCR扩增产物进行核酸电泳，结果如图1所示：获得了所需的fiber1基因片段，胶回收PCR扩增产物后用于重叠PCR扩增程序。
3、PCR扩增FAdV-4纤突蛋白2(fiber2)基因
(1)提取FAdV-4的DNA作为模板DNA，用特异性引物P3和P4进行fiber2基因的PCR扩增；
(2)PCR扩增体系：特异性引物P3 1μL，引物P4 1μL，含DNA聚合酶的反应液25μL，模板DNA 3μL，灭菌去离子水补齐到50μL；
(3)PCR扩增程序：95℃5min，95℃30s，59℃45s，72℃2min，35个循环；72℃7min；
(4)将fiber1的PCR扩增产物进行核酸电泳，结果如图1所示：获得了所需的fiber2基因片段，胶回收PCR扩增产物后用于重叠PCR扩增程序。
4、重叠PCR扩增FAdV-4纤突蛋白1和纤突蛋白2的融合基因fibers2A
(1)模板的准备：对FAdV-4纤突蛋白1基因和纤突蛋白2基因的PCR扩增产物进行胶回收，作为重叠PCR扩增的模板；
(2)重叠PCR扩增体系：特异性引物P1 1μL，特异性引物P4 1μL，含DNA聚合酶的反应液25μL，FAdV-4纤突蛋白1基因PCR扩增的胶回收产物1.5uL，FAdV-4纤突蛋白2基因PCR扩增的胶回收产物1.5uL，灭菌去离子水补齐到50μL；
(3)PCR扩增程序：95℃5min；95℃30s，65℃45s，72℃3min，35个循环；72℃7min；
(4)对重叠PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图2所示，获得了所需的融合基因fibers2A基因片段，胶回收重叠PCR扩增产物即为融合基因fibers2A，将用于重组质粒的构建。
5、重组质粒pC-fibers2A的构建
(1)将胶回收的融合基因fibers2A和质粒pCDNA3.1进行Hind III和Not I双酶切，然后分别进行胶回收，用T4连接酶对融合基因fibers2A和质粒pCDNA3.1进行连接，构建成重组质粒pC-fibers2A；
(1)融合基因fibers2A的酶切：在1.5mL离心管中加入融合基因fibers2A 15μL、Hind III内切酶1.5μL、Not I内切酶1.5μL、反应液3μL、去离子水9μL，混合均匀，在37℃水浴锅中反应15min，然后胶回收酶切产物，用于连接反应；
(2)质粒pCDNA3.1的酶切：在1.5ml离心管中加入质粒pCDNA3.1 10μL、Hind III内切酶1.5μL、Not I内切酶1.5μL、反应液3μL、去离子水14μL，混合均匀，在37℃水浴锅中反应15min，然后胶回收酶切产物，用于连接反应；
(3)连接反应：在1.5mL离心管中加入融合基因fibers2A的酶切回收产物3μL、质粒pCDNA3.1的酶切回收产物2μL、含有T4连接酶的反应液5μL，混合均匀，在16℃金属浴中反应30min，然后将连接反应的产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于氨苄LB琼脂平板，挑取克隆进行序列测定和酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示，得到重组质粒pC-fibers2A即为DNA疫苗。
实施例2：重组质粒pC-fibers2A的表达鉴定
将实施例1构建的重组质粒pC-fibers2A转染生长至DF1细胞，转染后48h用免疫荧光分别检测纤突蛋白1和纤突蛋白2的表达情况，具体步骤如下：
(1)将600ng重组质粒pC-fibers2A溶于50μL DMEM中，混匀后室温静置5min；同时将2μL转染试剂lipofectamine 2000溶于50μL DMEM中，混匀后室温静置5min；然后将含有重组质粒pC-fibers2A与转染试剂lipofectamine 2000的DMEM溶液混合为转染液，室温静置20min后将其滴入DF1细胞，培养8h后置换为含有血清的DMEM，继续培养48后用于免疫荧光试验；
(2)用PBS轻轻洗涤DF1细胞2次，加入预冷的4％多聚甲醛，室温固定25min；用PBS洗涤DF1细胞2次，加入0.25％TritonX-100室温作用5min；用PBS洗涤DF1细胞2次，加入鼠抗纤突蛋白1的抗体和兔抗纤突蛋白2的抗体，37℃孵育1.5h；用PBS洗涤DF1细胞2次，加入FITC(绿色荧光)标记的羊抗鼠二抗和Cy3(红色荧光)标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1h；用PBS洗涤DF1细胞5次后置于倒置荧光显微镜下观察荧光。如图4所示，绿色荧光和红色荧光均能看到，说明纤突蛋白1和纤突蛋白2在细胞内均进行了表达。
实施例3：DNA疫苗免疫试验
(1)将重组质粒pC-fibers2A接种21日龄SPF鸡10只，每只每次接种量为200μg，腿部肌肉分2点注射，接种后14天进行加强免疫，接种剂量与方法与第一次免疫相同，作为免疫组；同时设pCDNA3.1空载体注射作为对照组，共10只鸡；
(2)加强免疫后21天进行攻毒(HN15株为FAdV-4，源自感染FAdV-4的发病鸡)，每只鸡的攻毒剂量为100CLD50(鸡半数致死剂量)，攻毒方式为肌肉注射，观察记录鸡的发病与死亡情况；
(3)结果显示，攻毒后第2天对照组部分鸡开始发病，第3天全部发病，主要表现为羽毛蓬松、精神沉郁、拍黄绿色粘稠样稀粪，至第14天全部死亡；免疫组鸡8只保护，2只发病，没有死亡。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种同时表达FAdV-4纤突蛋白1与纤突蛋白2基因的DNA疫苗及其构建方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2799
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcggccc taatcgcctc cgcagccgat accgtctccg ccagcggaaa aaaacgaccc 60
cgcagggccc tatccgaacc tagccggtac ctttcggagg gcgacgagcg tcgaaaaccc 120
aaacgcgcgc gaccggccac ccgcgcgaat ggtcccctcc tcgatctggt gtatccattt 180
gacttcaatg cggggggagg aggtggcagc ggtggcggcg gtgggggagg tggaggtcag 240
cagatcgcgg tcgaccccga tgggccgctc gaactcactg gtgacctact gaccctcaac 300
accaaaacgc ccatttacgt cagcgatcga gcggtcagtc tgctcatcga tgacaatact 360
ttggccacta agcaagccaa cggggcgctc atggtcaaaa ccgcggcccc tctgaactcg 420
ggcactggtg gaggcgtcac gctaggcttc gaccctcgca ccatggcgct agattccgtc 480
accggggtgc tcaaagtgct cgtcgactca cagggacctc tacaagccga cacgggaggc 540
atcactctcc agttcgacac tcaagacttc gttgtcaaca atggcgtctt agcgctagcc 600
tcctcggtcg gtccgaccta tctgagcccc tttgcgacct acgaagtcac gcccgtcttg 660
ggaatatcgc agaggaacgg caacgtaaaa agcaagggct tgcaaaactg gtccataggc 720
tattacatct acatggtgag ctcagccggg ctagtcaacg gactcatcac tctggagcta 780
gcccatgacc tcacaggcgc gagcggagaa aacagcctga ctagcggtct caactttacc 840
tttgtgctca gccccatgta cccgatagaa acagaggtga atttgtccct catcgtgccg 900
cccacggtct cgccgaccaa tcaaaaccac gtgtttgtgc ccaatagcaa ccagagcgac 960
gtgggctatc tcgggctgcc gcctcatacc agggacaatt ggtacgtgcc catcgactcg 1020
cccggcctgc ggctcgtctc tttcatgccc accgccaccg gaaacgagaa attcggacag 1080
ggcacgttgg gatactgcgc cgccaccatc cagaacacgt ccagcggaac cacgccgtcg 1140
gatgcgatag ccttcactgt ctcgctgccg cagacctccg gctccaactg gtttgaccag 1200
aacgcgcccg acactgtggt gacgaccggt cctatccctt tttcctatca gggttacgtc 1260
tactccccca acgggaacaa tgctccgggc cccggcagcg gcgcgaccaa ctttagcctg 1320
cttaagcagg cgggcgatgt ggaagaaaac ccgggcccga tgctccgggc ccctaaaaga 1380
agacattccg aaaacgggaa gcccgagacc gaagcgggac cttccccggc tccaatcaag 1440
cgcgccaaac gcatggtgag agcatcccag cttgacctgg tttatccttt cgattacgtg 1500
gccgaccccg tcggagggct caacccgcct tttttgggag gctcaggacc cctagtggac 1560
cagggcggac agcttacgct caacgtcacc gatcccatca tcatcaagaa cagatcggtg 1620
gacttggccc acgaccccag tctcgatgtc aacgcccaag gtcaactggc ggtggccgtt 1680
gaccccgaag gggccctgga catcaccccc gatggactgg acgtcaaggt cgacggagtg 1740
accgtaatgg tcaacgatga ctgggaactg gccgtaaaag tcgacccgtc cggcggattg 1800
gattccaccg cgggtggact gggggtcagc gtggacgaca ccttgctcgt ggatcaggga 1860
gaactgggcg tacacctcaa ccaacaagga cccatcactg ccgatagcag tggtatcgac 1920
ctcgagatca atcctaacat gttcacggtc aacacctcga ccggaagcgg agtgctggaa 1980
ctcaacctaa aagcgcaggg aggcatccaa gccgacagtt cgggagtggg cgtttccgtg 2040
gatgaaagcc tacagattgt caacaacact ctggaagtga aaccggatcc cagcggaccg 2100
cttacggtct ccgccaatgg cctagggctg aagtacgaca ctaataccct agcggtgacc 2160
gcgggcgctt taaccgtggt cggagggggg agcgtctcca cacccatcgc tacttttgtc 2220
tcgggaagtc ccagcctcaa cacctacaat gccacgaccg tcaattccag cgcgaacgcc 2280
ttctcttgcg cctactacct tcaacagtgg aacatacagg ggctccttgt tacctccctc 2340
tacttgaaat tggacagcgc caccatgggg aatcgccctg gggacctcaa ctccgccaat 2400
gccaaatggt tcaccttttg ggtgtccgcc tatctccagc aatgcaaccc ctccgggatt 2460
caagcgggaa cggtcagccc ctccaccgcc accctcacgg actttgaacc catggccaat 2520
aggagcgtga ccagcccatg gacgtactcg gccaatggat actatgaacc atccatcggg 2580
gaattccaag tgttcagccc ggtggtaaca ggtgcctgga acccgggaaa catagggatc 2640
cgcgtcctcc ccgtgccggt ttcggcctcc ggagagcgat acacccttct atgctatagt 2700
ctgcagtgca cgaacgcgag catttttaat ccaaacaaca gcggaaccat gatcgtggga 2760
cccgtgctct acagctgtcc agcggcctcc ctcccgtaa 2799
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattaagctt atgtcggccc taatcgcctc cgcagccg 38
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccgcctgct taagcaggct aaagttggtc gcgccgctgc cggggcccgg agcatt 56
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttaagcag gcgggcgatg tggaagaaaa cccgggcccg atgctccggg cccct 55
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taaagcggcc gcttacggga gggaggccgc tggacagctg 40