一种犬腺病毒ⅰ型灭活疫苗及其制备方法
阅读说明：本技术 一种犬腺病毒ⅰ型灭活疫苗及其制备方法 (Canine adenovirus type I inactivated vaccine and preparation method thereof ) 是由 唐青海 杨海 易程 王芳宇 杨灿 何丽芳 刘会敬 唐娇玉 易诚 曹丽敏 唐斯萍 于 2019-11-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗及其制备方法,采用无血清培养工艺制备得到犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗,其与含血清培养的犬腺病毒Ⅰ型的免疫原性相当,而采用本发明的无血清工艺培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒所制备得到的疫苗相比有血清工艺制备得到的疫苗,其在免疫早期能够获得更好的中和抗体滴度。(The invention relates to a canine adenovirus type I inactivated vaccine and a preparation method thereof, wherein the canine adenovirus type I inactivated vaccine is prepared by adopting a serum-free culture process, and the immunogenicity of the canine adenovirus type I inactivated vaccine is equivalent to that of the canine adenovirus type I cultured by containing serum.)
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗及其制备方法。
背景技术
犬腺病毒（Canine adenovirus，CAV）是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒。犬作为一种与人类接触最为亲密的、与人类相处时间最长的宠物之一，与人类的日常生活已经密不可分，其健康状况往往与人类自身的健康状况息息相关，因此，关注宠物犬的健康对于动物福利和人类健康具有重要的公共卫生意义。
目前我国对于犬传染性肝炎的防治主要方法是疫苗接种。商品化的疫苗都是弱毒疫苗，即要获得制备该疫苗必须要采用细胞培养的方法体外制备高质量的病毒液。在我国原中国人民解放军农牧大学研制的犬五联活疫苗中，犬传染性肝炎病毒采用MDCK（犬肾）细胞单层，按照维持液（含有1-2%终浓度的胎牛血清）的1%体积接种病毒，置于37℃培养，24小时后换液，当细胞病变（CPE）达75%以上时，收获病毒。在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的犬三联疫苗中，犬传染性肝炎组分也采用MDCK细胞单层，按照细胞维持液（含有2%的胎牛血清）的2%接种病毒，置于37℃培养，观察48小时，当细胞病变达到80%以上时收获病毒，用于疫苗的配制，所有制备疫苗其中的犬腺病毒滴度106TCID50。
对于疫苗来说，病毒培养的效价是决定该产品成本和效果的主要因素，而病毒培养物中的异源性物质（如上述工艺使用的胎牛血清）容易诱导本体动物免疫排斥而引起副反应。因此，如何降低或者不用添加异源性营养物质如胎牛血清以提高疫苗的安全性，以及改进现有工艺以提高犬腺病毒Ⅰ型效价以大幅提高病毒的产量、降低成本是目前犬腺病毒Ⅰ型疫苗急需解决的问题。
发明内容
为解决犬腺病毒Ⅰ型病毒疫苗制备过程中血清使用所带来的问题，提高疫苗的安全性，本发明旨在提供一种犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗及其制备方法，采用无血清工艺培养增强疫苗原料的生物安全性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现：
一种犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将无血清驯化后的MDCK细胞传代，待细胞汇合度为90%左右，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL，洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次；
（2）加入犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型，使病毒感染复数为1TCID50，采用转瓶培养，转速为1圈/5min,培养温度为38.5℃，密闭培养96h后收获病毒；
（3）反复冻融3次，5000g/min，离心5min，去除细胞碎片，取上清测定病毒的滴度，调整病毒的效价为107TCID50/mL；
（4）病毒灭活：在每1L病毒液中加入甲醛2mL，即甲醛终浓度为0.2%；放置于 37℃，90r/min，灭活24 h；
（5）甲醛的中和：将上述制备抗原放置在冰上（低温对抗原效果好），用三叶浆式搅拌器(搅拌头直径5cm)进行搅拌，将转速调至1000r/min，往灭活的病毒液中加入终浓度为0.05%的亚硫酸钠溶液（1L抗原中加入1mL 50%亚硫酸钠），搅拌30min使抗原分散均匀，充分中和甲醛；
（6）按“抗原：佐剂=98:2”比重比例缓慢加入佐剂（MontanideTM PET GEL A），用三叶浆式搅拌器（搅拌头直径5cm）进行搅拌，将转速调至1500r/min，在10min内加完佐剂； 继续以1500r/min的转速搅拌30-40min；
（7）一次性加入终浓度为20 μg/mL的硫柳汞（1L抗原中加入1mL 20mg/mL硫柳汞储存液），将转速调至800r/min，持续搅拌10min；
（8）置于4℃，静止30min以消除气泡，乳化；
（9）分装、压盖、保存：往无菌疫苗瓶中灌装疫苗，40mL/瓶，压盖；放4℃保存。
优选的，所述无血清驯化后的MDCK细胞采用如下方法制备得到：
（1）将长成单层的犬肾细胞（MDCK）用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；
（2）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；
（3）加入含有终浓度为5%胎牛血清（v/v）的MEM培养基、加入终浓度为2-10µg/mL的泰勒菌素，摇匀，置于37℃密闭培养24 小时；
（4）将培养温度设置为38.5℃，持续密闭培养72小时；
（5）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行传代，按照步骤（1）-（4）所述持续传代培养3代次，得到种子细胞；
（6）将长成单层的犬肾细胞（MDCK）用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；
（7）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；
（8）加入商品化的MEM培养基培养300 mL，按照体积比添加终浓度为5%的胎牛血清；加入终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃，密闭培养96小时;
（9）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行连续传代，每个代次，培养基中的血清浓度在上一个代次血清浓度基础上降低0.2%，每个代次中均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃；
（10）按照第（9）步方法连续传代培养至无血清培养时，继续传代培养，每个代次不再添加胎牛血清，每个代次均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，连续传代50代次，即得到无血清驯化后的MDCK细胞。
优选的，所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基，其特征在于，由基础培养基、细胞生长促进因子和促病毒增殖因子组成，所述基础培养基为MEM培养基；所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成。
优选的，所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基是以MEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子，所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成，所述无血清培养基中添加了终浓度为0.05µg/mL～0.4 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.06µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL的葡萄糖，终浓度为0.05µg/mL～0.15μg/mL的EDTA-Na2，终浓度为50µg/mL -75µg/mL的牛磺酸，终浓度为10µg/mL -15µg/mL的皮质醇。
优选的，所述犬腺病毒Ⅰ型无血清培养基是以MEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子，所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成，所述无血清培养基中添加了终浓度为0.1 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.15µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为2.5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为3.5µg/mL的葡萄糖，终浓度为0.1μg/mL的EDTA-Na2，终浓度为50µg/mL的牛磺酸，终浓度为10µg/mL的皮质醇。
优选的，所述犬腺病毒Ⅰ型毒株为CAV-ZY 180711。
本发明还请求保护基于以上方法制备得到的犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
一方面，本发明采用无血清培养工艺制备得到犬腺病毒Ⅰ型灭活疫苗，其与含血清培养的犬腺病毒Ⅰ型的免疫原性相当，而采用本发明的无血清工艺培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒所制备得到的疫苗相比有血清工艺制备得到的疫苗，其在免疫早期能够获得更好的中和抗体滴度，且其免疫效果优于商品化的弱毒疫苗。
第二方面，本发明采用无血清培养工艺对犬腺病毒Ⅰ型进行了培养，获得了相比含血清培养更高滴度，无血清培养的CAV呈平稳态势（1010.5TCID50/mL-1010.6TCID50/mL），而含血清培养的CAV略有下降（由109.2TCID50/mL降低为108.9TCID50/mL）。在培养120h，无血清培养工艺培养的CAV的滴度能够达到1010.6TCID50/mL，而对照有血清培养的CAV为108.9TCID50/mL，二者之间相差10倍之多（P<0.05）。表明该无血清培养基所培养的CAV滴度高，可以提高产量、提高生产效率、降低成本。
第三方面，本发明对无血清培养基进行了优化，发现EDTA-Na2，牛磺酸和皮质醇对于犬腺病毒Ⅰ型病毒均具有促进增殖的效果，当三者在一定的浓度范围内才能促进病毒的增殖，否则对于病毒的增殖的促进作用不明显，以上结果表明本发明促病毒增殖因子的组成和配比是获得犬腺病毒Ⅰ型病毒增殖的无血清培养，得到高滴度的病毒培养液的关键所在。
附图说明
图1：MDCK细胞培养形态，图1-A为无血清驯化后的MDCK细胞形态；图1-B为含血清培养的MDCK细胞形态。
图2：无血清培养MDCK和含血清培养MDCK增殖特性比较。
图3：无血清培养中各个添加因子对犬腺病毒Ⅰ型增殖特性的影响。
图4：无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型的免疫染色鉴定（100×）。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的特点和优点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：犬肾细胞（MDCK）的无血清培养工艺驯化
（1）将长成单层的犬肾细胞（MDCK）用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；
（2）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；
（3）加入含有终浓度为5%胎牛血清（v/v）的MEM培养基、加入终浓度为2-10µg/mL的泰勒菌素，摇匀，置于37℃密闭培养24 小时；
（4）将培养温度设置为38.5℃，持续密闭培养72小时；
（5）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行传代，按照步骤（1）-（4）所述持续传代培养3代次，得到种子细胞；
（6）将长成单层的犬肾细胞（MDCK）用pH 7.4的磷酸缓冲盐溶液，洗涤2次；
（7）加入0.25%的胰蛋白酶消化，待细胞变圆时，弃掉胰蛋白酶溶液；
（8）加入商品化的MEM培养基培养300 mL，按照体积比添加终浓度为5%的胎牛血清；加入终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃，密闭培养96小时;
（9）细胞长满单层，以1:10的比例接种，进行连续传代，每个代次，培养基中的血清浓度在上一个代次血清浓度基础上降低0.2%，每个代次中均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，采用转瓶培养，将培养温度设置为38.5℃；
（10）按照第（9）步方法连续传代培养至无血清培养时，继续传代培养，每个代次不再添加胎牛血清，每个代次均添加：终浓度为0.05µg/mL～0.2 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.01µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL葡萄糖，连续传代50代次，即得到无血清驯化后的MDCK细胞；
（11）无血清培养细胞的形态学观察：无血清培养连续传代50代次，得到无血清驯化后的MDCK细胞形态良好（图1A），与含血清培养的MDCK细胞无形态学差别（图1B）。
(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl)-2H- salt] （12）采用MTS法（[3-(4,5-diethylthiazol-2-yl)-5- etrazolium,inner）测定驯化前后的细胞生长特性，方案如下：
12.1 将所得到的无血清驯化后的MDCK细胞，消化后接种到96孔板中，密度为1000个细胞/孔，共接种15孔，按照步骤（10）中无血清培养条件进行培养。
12.2将含血清（终浓度5%的胎牛血清）培养的MDCK，消化后接种到96孔板中，密度为1000个细胞/孔，培养基中含有终浓度为5%胎牛血清（v/v）的MEM培养基、共接种15孔，置于37℃密闭培养，作为对照细胞。
12.3分别在培养后24、48、72、96、120小时后，选择12.1和12.2中各3个孔培养的细胞每孔加入20 µL的MTS，轻轻摇匀持续培养4小时。在490nm波长处测定各孔的吸光度。
12.4 由图2可见，经驯化后的无血清培养MDCK细胞与未驯化含血清培养的MDCK细胞均生长良好，增殖试验结果显示，每个时间点生长无显著差异（P>0.05）。
实施例2：无血清培养中各个添加因子对犬腺病毒Ⅰ型增殖特性的影响
（1）试验材料：犬腺病毒Ⅰ型（CAV-Ⅰ）毒株为CAV-ZY 180711系本人2018年分离和鉴定的犬腺病毒Ⅰ型，具体参见本人发表论文：易程，邓莉，唐青海等，“一株Ⅰ型犬腺病毒的分离与鉴定”，《中国动物检疫》，2019年第36卷第2期，第82-87页，在此，申请人和发明人均保证从申请日起20年内可以向公众发放该生物材料。
（2）试验设计：基于本人在先研究，发现EDTA-Na2，牛磺酸和皮质醇分别对于犬腺病毒Ⅰ型在MDCK细胞上增殖具有一定的促进作用，因此，为了更好的进行犬腺病毒Ⅰ型的无血清培养，将EDTA-Na2，牛磺酸和皮质醇按照一定配比制备成促病毒增殖因子，为了验证无血清培养基病毒促增殖因子中各添加成分对犬腺病毒Ⅰ型增殖特性的影响，本发明设置了如下试验，按照下表1所示的培养基组成分别配置了实施例2-1、实施例2-2和对照组1-5的无血清培养基。
表1 无血清培养基组成
（3）无血清培养中各个添加因子对犬腺病毒Ⅰ型增殖特性的影响
（a）将实施例1得到的无血清细胞株MDCK，采用同样方法传代，待细胞汇合度为90%左右，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL，洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次。
（b）加入无血清MEM培养基、及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型，使病毒感染复数为1TCID50；分别加入以上表1中各无血清培养基进行转瓶培养，转速为1圈/5min，培养温度为38.5℃，密闭培养，做12个重复样品，分别在培养后48h、72h、 96h和120h各收集3个重复样品进行TCID50的测定，取平均值即为相应的TCID50。
（4）试验结果：参见图3。基于以上试验可知，本发明实施例2-1（试验组1）和实施例2-2（试验组2）均取得了良好的增殖效果，当仅添加EDTA-Na2，牛磺酸和皮质醇中的一种时，即对照组2-4的增殖效果优于不添加任何促病毒增殖因子的对照组5，说明三者对于病毒均具有促进增殖的效果，但是，基于实施例2-1、实施例2-2以及对照组1和对照组3的比较可知，当三者在一定的浓度范围内才能促进病毒的增殖，否则对于病毒的增殖的促进作用不明显，以上结果表明本发明促病毒增殖因子的组成和配比是获得犬腺病毒Ⅰ型病毒增殖的无血清培养，得到高滴度的病毒培养液的关键所在，且基于后续试验可知，其对于病毒的增殖效果优于传统的有血清培养工艺，这种效果是犬腺病毒Ⅰ型病毒培养的相关文献中所不曾报道的，属于突破性的效果。
（5）用于犬腺病毒Ⅰ型病毒增殖的无血清培养基组成：以MEM培养基为基础培养基，添加细胞生长促进因子和促病毒增殖因子，所述细胞生长促进因子由表皮生长因子EGF、转移生长因子TGF-β、L-赖氨酸和葡萄糖组成；所述促病毒增殖因子由EDTA-Na2、牛磺酸和皮质醇组成，所述无血清培养基中添加了终浓度为0.05µg/mL～0.4 µg/mL的表皮生长因子EGF，终浓度为0.06µg/mL～0.3µg/mL的转移生长因子TGF-β，终浓度为0.1µg/mL～5µg/mL的L-赖氨酸，终浓度为2µg/mL～5µg/mL的葡萄糖，终浓度为0.05µg/mL～0.15μg/mL的EDTA-Na2，终浓度为50µg/mL -75µg/mL的牛磺酸，终浓度为10µg/mL -15µg/mL的皮质醇。
实施例3：犬腺病毒Ⅰ型的无血清培养增殖特性
（1）将实施例1得到的无血清驯化后的MDCK细胞，采用同样方法传代，待细胞汇合度为90%左右，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL，洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次。
（2）加入实施例2-1所得到的无血清MEM培养基、及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型，使病毒感染复数为1TCID50，采用转瓶培养，转速为1圈/5min,培养温度为38.5℃，密闭培养。做12个重复样品，分别在培养后48h、72h、 96h和120h各收集3个重复样品进行TCID50的测定。
（3）设立犬腺病毒Ⅰ型的含血清培养作为对照：将含血清（终浓度5%的胎牛血清）培养的MDCK，传代，待细胞汇合度为90%左右，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL,洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次。加入含MEM培养基、终浓度2%的胎牛血清（通用的维持液浓度）；采用转瓶培养，转速为1圈/5min,培养温度为38.5℃，密闭培养。做12个重复样品，分别在培养后48h、72h、96h和120h各收集3个重复样品进行TCID50的测定。
（4）对比实验结果：由表2可以看出采用无血清培养工艺培养的CAV增殖特性显著强于含血清培养工艺培养的CAV增殖特性。
表2 无血清培养和含血清培养MDCK-CAV病毒增殖特性比较
结果显示：在培养48-96h二者均呈增长态势，但在96-120h，无血清培养的CAV呈平稳态势（1010.5TCID50/mL-1010.6TCID50/mL），而含血清培养的CAV略有下降（由109.2TCID50/mL降低为108.9TCID50/mL）。在培养120h，无血清培养工艺培养的CAV的滴度能够达到1010.6TCID50/mL，而对照有血清培养的CAV为108.9TCID50/mL，二者之间相差10倍之多（P<0.05）。表明该无血清培养基所培养的CAV滴度高，可以提高产量、提高生产效率、降低成本。
实施例4：无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒第10代次病毒的免疫染色鉴定
将无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型第10代培养液接种汇合度为80%的MDCK细胞（直径为35mm培养皿），培养12 h后弃去培养基；每皿细胞用2 mL PBS清洗3次，真空干燥，加入2 mL 30%丙酮-PBS，室温固定25 min，真空干燥，加入CAVⅠ型单克隆抗体2 mL（1:3000倍稀释），37 ℃孵育1h。PBS洗涤3次。加入酶标二抗（HRP-SPA，1:8 000倍稀释）2 mL，37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次，加入2 mL AEC底物显色液，37 ℃孵育20 min。弃掉反应液，蒸馏水冲洗2次，显微镜观察结果。具体参见图4。
结果显示：CAVⅠ型特异性单克隆抗体与培养的病毒在细胞核中特异性结合。
实施例5：无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒灭活疫苗的制备及免疫原性研究
一，试验材料：犬腺病毒Ⅰ型（CAV-Ⅰ）毒株为CAV-ZY 180711系本人2018年分离和鉴定的犬腺病毒Ⅰ型，具体参见本人发表论文：易程，邓莉，唐青海等，“一株Ⅰ型犬腺病毒的分离与鉴定”，《中国动物检疫》，2019年第36卷第2期，第82-87页，在此，申请人和发明人均保证从申请日起20年内可以向公众发放该生物材料。
二，犬腺病毒Ⅰ型病毒灭活疫苗的制备
（1）将实施例1得到的无血清驯化后的MDCK细胞传代，待细胞汇合度为90%左右，将转瓶中的培养液全部倒掉，加入0.9%（w/v）NaCl洗涤液 100mL，洗涤细胞，倒掉洗涤液，再重复洗涤一次；
（2）加入实施例2-1所得到的无血清MEM培养基及其稀释过的稀释倍数为1000倍的犬腺病毒Ⅰ型，使病毒感染复数为1TCID50，采用转瓶培养，转速为1圈/5min，培养温度为38.5℃，密闭培养96h后收获病毒；
（3）反复冻融3次，5000g/min，离心5min，去除细胞碎片，取上清测定病毒的滴度，调整病毒的效价为107TCID50/mL；
（4）病毒灭活：在每1L病毒液中加入甲醛2mL，即甲醛终浓度为0.2%；放置于 37℃，90r/min，灭活24 h；
（5）甲醛的中和：将上述制备抗原放置在冰上（低温对抗原效果好），用三叶浆式搅拌器(搅拌头直径5cm)进行搅拌，将转速调至1000r/min，往灭活的病毒液中加入终浓度为0.05%的亚硫酸钠溶液（1L抗原中加入1mL 50%亚硫酸钠），搅拌30min使抗原分散均匀，充分中和甲醛；
（6）按“抗原：佐剂=98:2”比重比例缓慢加入佐剂（MontanideTM PET GEL A），用三叶浆式搅拌器（搅拌头直径5cm）进行搅拌，将转速调至1500r/min，在10min内加完佐剂；继续以1500r/min的转速搅拌30-40min；
（7）一次性加入终浓度为20 μg/mL的硫柳汞（1L抗原中加入1mL 20mg/mL硫柳汞储存液），将转速调至800r/min，持续搅拌10min；
（8）置于4℃，静止30min以消除气泡，乳化；
（9）分装、压盖、保存：往无菌疫苗瓶中灌装疫苗，40mL/瓶，压盖；放4℃保存。
三，疫苗检验方法及结果
3.1性状检验 灭活疫苗外观为澄清透明。
3.2无菌检验灭活疫苗按照现 《中华人民共和国兽药典》 2010年版第三部附录进行检验，T. G、G .P 管和G .A 斜面培养基均未观察到菌落。
3.3支原体检验灭活疫苗按照 《中华人民共和国兽药典》 2010年版第三部附录进行检验，未发现小瓶和小管培养物颜色出现明显变化，移植的液体培养物在固体培养基上无 “煎蛋”状支原体菌落。
3.4外源病毒检验灭活疫苗按照 《中华人民共和国兽药典》 2010年版第三部附录进行检验，均无犬细小病毒、犬瘟病毒、猪细小病毒、犬冠状病毒等污染，证明毒种是纯净的。
3.5安全性评价：取2月龄中华幼犬9只，检测CVA抗原抗体均为阴性健康犬只。共分为3组：A组、B组和C组，每组3只，A组每只幼犬颈部肌肉注射无血清培养的CAV-Ⅰ所制备的灭活疫苗4mL（4只份），B组每只幼犬颈部肌肉注射含血清培养的CAV-Ⅰ所制备的灭活疫苗4mL（4只份），C组不做任何处理。每天观察犬只食欲、精神、并测量体温。结果显示：A组犬只在疫苗注射后当天体温正常、食欲正常、精神稍有不振，第2天所有指标恢复正常；B组犬只在疫苗注射后当天体温略有升高（39.2℃），疫苗注射后2天内食欲有所下降，精神稍有不振，第3天所有指标恢复正常；和C三组试验犬只的食欲、精神、体温均正常，说明无血清培养CAV所制备的疫苗相对有血清制备疫苗安全性更好。
实施例6：无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒灭活疫苗的免疫原性评价：
取2月龄中华幼犬12只，检测CVA抗原抗体均为阴性。动物分为5组：A组、B组、C组和D组，每组3只，A组每只幼犬颈部肌肉注射无血清培养的CAV-Ⅰ所制备的灭活疫苗，1mL/只/次，免疫两次，间隔21d；B组每只幼犬颈部肌肉注射含血清培养的CAV-Ⅰ所制备的灭活疫苗，1mL/只/次，免疫两次，间隔21d；C组接种卫佳®伍，1mL/只/次，免疫两次，间隔21d；D组不做任何处理。分别与首次免疫后7、14、21和42d采血制备血清，采用微量细胞中和试验法测定血清中和抗体效价。具体结果见下表3。
表3 血清中和抗体效价测定结果
基于以上表3的结果可知，A组和B组犬只的血清中和效价均能达到1:12800以上，说明在疫苗毒株相同的情况下，无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒的免疫原性与含血清培养的犬腺病毒Ⅰ型的免疫原性相当，而采用本发明的无血清工艺培养的犬腺病毒Ⅰ型病毒所制备得到的疫苗相比有血清工艺制备得到的疫苗，其在免疫早期能够获得更好的中和抗体滴度，其可能是采用无血清工艺减少了血清中的成分对于免疫动物的免疫干扰和免疫应激等有关，而通过与市售的疫苗进行比较可知，本发明的灭活疫苗能够刺激动物产生更高的中和抗体，对动物也具有良好的保护作用。
综合前述增殖特性和安全性全面评价，无血清培养的犬腺病毒Ⅰ型制备的疫苗保持了良好的免疫原性的同时，产量更高、成更低、更为安全。