一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺
阅读说明：本技术 一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺 (Freeze-drying process of chick embryo culture vaccine ) 是由 马光明 梁熔婷 许祥雨 钟伟锋 于 2020-12-29 设计创作，主要内容包括：本发明属于疫苗制备技术领域,公开了一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺。将疫苗生产种毒接种鸡胚,经培养后收获病毒液,加入蔗糖作为冻干保护剂,然后经冷冻干燥处理,得到疫苗成品；所述冷冻干燥处理的工艺条件如下：预冻干：-20℃,4h；冻干：-40℃,120h；第一次升温：-20℃,8h；第二次升温：0℃,8h；第三次升温：15℃,8h；第四次升温：25℃,8h。本发明冻干工艺无需加入冻干保护剂,将原有-40℃冻干步骤直接升温至0℃保温的过程中,增加了第一次升温至-20℃保温8h的过程,所得冻干疫苗的形态得到了明显的改善,且疫苗效价得到了明显的提高。(The invention belongs to the technical field of vaccine preparation, and discloses a freeze-drying process of a chicken embryo culture vaccine. Inoculating the vaccine production seed virus into a chicken embryo, culturing to obtain a virus liquid, adding sucrose as a freeze-drying protective agent, and then performing freeze-drying treatment to obtain a vaccine finished product; the process conditions of the freeze drying treatment are as follows: pre-freeze-drying: 4h at-20 ℃; freeze-drying: 120h at-40 ℃; first temperature rise: 8h at the temperature of minus 20 ℃; and (3) second temperature rise: 0 ℃ for 8 h; and (3) heating for the third time: 15 ℃ for 8 h; fourth temperature rise: 25 ℃ and 8 h. According to the freeze-drying process, a freeze-drying protective agent is not required to be added, the original freeze-drying step at the temperature of-40 ℃ is directly heated to the temperature of 0 ℃ for heat preservation, the process of heating to the temperature of-20 ℃ for heat preservation for 8 hours for the first time is added, the form of the obtained freeze-dried vaccine is obviously improved, and the titer of the vaccine is obviously improved.)
技术领域
本发明属于疫苗制备技术领域，具体涉及一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺。
背景技术
鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。鸡胚培养的技术比组织培养容易成功，也比接种动物的动物来源容易，无饲养管理及隔离等的特殊要求，且鸡胚一般无病毒隐性感染，同时它的敏感范围很广，多种病毒均能适应，因此，是常用的一种培养动物病毒的方法。
冻干疫苗，即利用致病微生物经传代或基因改造的方式，在不破坏原有免疫原性的基础上使该致病微生物无致病性，将失去致病性的病原微生物经扩增后将培养液放入冻干机中，经低温，增加冻干机内真空度的方法，使培养液中的水分以升华的方式分离，制成保持原有微生物免疫原性的干粉。
新型的冻干灭活疫苗，根据单品种疫苗的免疫剂量先冻干成粉状或块状，使用的时候，用相应的免疫佐剂进行现配现用，在短时间内形成固定的剂型。养殖户根据自身需求，有选择地联合使用疫苗，一来很好的解决了联苗抗原含量难以满足的问题，二来解决了传统灭活疫苗免疫次数过多、免疫剂量过大的困惑。
专利CN 103735521 A，公开了一种动物用冻干灭活疫苗及其制备工艺。灭活疫苗由疫苗抗原经灭活后，再经过真空冷冻干燥工艺获得，免疫佐剂或稀释液具有良好的乳化性能。所述的疫苗抗原为PCV-2、PRRS、流行性腹泻或流感病毒的病毒性抗原，或者为猪副嗜血杆菌、链球菌或大肠杆菌的细菌性抗原，或者为支原体、球虫或附红细胞体抗原。该专利虽然公开了冻干灭活疫苗的制备方法，但并未对冻干工艺与疫苗效价的关系进行研究。
专利CN101327323A公开了一种制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗的冻干工艺。经过疫苗预冻、疫苗升华干燥、消除疫苗底部收缩升华、疫苗的不可见冰面升华、疫苗解析干燥等工艺步骤，制得冻干甲型肝炎减毒活疫苗。避免了冻干工艺在升华期内所造成的疫苗连续升温和温升突变现象，减少和消除疫苗感染性滴度损失较大问题，使疫苗残余水分达标，外形细腻饱满。但该专利工艺程序复杂，控制难度较高，且针对的是市购甲型肝炎减毒活疫苗，并不适用于鸡胚培养疫苗的冻干处理。
现有的鸡胚培养疫苗冻干工艺普遍存在如下问题：1、冻干条件优化不足，导致疫苗效价降低；2、冻干后制品外观质量不佳；3、需要加入复杂冻干保护剂。
发明内容
针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的目的在于提供一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺。本发明工艺通过对冻干温度和程序的调节，在无需加入任何冻干保护剂的情况下，可以显著改善制品外观，而且可以显著提高疫苗效价。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种鸡胚培养疫苗的冻干工艺，包括如下步骤：
将疫苗生产种毒接种鸡胚，经培养后收获病毒液，加入蔗糖作为冻干保护剂，然后经冷冻干燥处理，得到疫苗成品；所述冷冻干燥处理的工艺条件如下：
预冻干：-20℃，4h；
冻干：-40℃，120h；
第一次升温：-20℃，8h；
第二次升温：0℃，8h；
第三次升温：15℃，8h；
第四次升温：25℃，8h。
进一步地，所述疫苗生产种毒的类型不过于限制，任何可通过接种鸡胚细胞培养并收获病毒液的毒株均可，包括但不限于新城疫病毒、禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、禽腺病毒等。
进一步地，所述冻干保护剂蔗糖的加入量为病毒液质量的10％。
进一步地，所述预冻干步骤是指将温度为4～15℃的病毒液以0.5～1.5℃/min的速率降温至-20℃保温4h。
进一步地，所述冻干步骤是指以0.5～1.5℃/min的速率降温至-40℃保温120h。
进一步地，所述第一次升温是指以0.4～0.8℃/min的升温速率升温至-20℃保温8h。
进一步地，所述第二次升温是指以0.4～0.8℃/min的升温速率升温至0℃保温8h。
进一步地，所述第三次升温是指以0.5～1.0℃/min的升温速率升温至15℃保温8h。
进一步地，所述第四次升温是指以0.5～1.0℃/min的升温速率升温至25℃保温8h。
进一步优选地，所述冷冻干燥处理的工艺条件如下：
预冻干：将温度为4℃的病毒液以1℃/min的速率降温至-20℃保温4h；
冻干：以1℃/min的速率降温至-40℃保温120h；
第一次升温：以0.5℃/min的升温速率升温至-20℃保温8h；
第二次升温：以0.5℃/min的升温速率升温至0℃保温8h；
第三次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至15℃保温8h；
第四次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至25℃保温8h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明冻干工艺的关键在于将原有-40℃冻干步骤直接升温至0℃保温的过程中，增加了第一次升温至-20℃保温8h的过程。经验证增加了第一次升温过程之后所得冻干疫苗的形态得到了明显的改善，且疫苗效价得到了明显的提高。
(2)本发明的冻干工艺采用简单的蔗糖组分作为冻干保护剂，将鸡胚培养后的病毒液经冷冻干燥处理即可得到高效价疫苗，工艺简单，成本低，效果好。
附图说明
图1为实施例1(右)及对比例1(左)所得冻干疫苗的外观形态对比结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
将禽腺病毒接种于SPF鸡胚中扩繁培养，收获鸡胚尿囊液离心取上清液4℃保存。将所得上清液中加入10％蔗糖作为冻干保护剂，然后在如下工艺条件下冷冻干燥，得到疫苗成品。
冷冻干燥处理工艺条件：
预冻干：将温度为4℃的病毒液以1℃/min的速率降温至-20℃保温4h；
冻干：以1℃/min的速率降温至-40℃保温120h；
第一次升温：以0.5℃/min的升温速率升温至-20℃保温8h；
第二次升温：以0.5℃/min的升温速率升温至0℃保温8h；
第三次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至15℃保温8h；
第四次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至25℃保温8h。
对比例1
本对比例为改进前的冻干工艺，与实施例1相比，冷冻干燥处理工艺条件如下：
预冻干：将温度为4℃的病毒液以1℃/min的速率降温至-20℃保温4h；
冻干：以1℃/min的速率降温至-40℃保温120h；
第一次升温：以0.5℃/min的升温速率升温至0℃保温8h；
第二次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至15℃保温8h；
第三次升温：以0.8℃/min的升温速率升温至25℃保温8h。
1、以上实施例1(右)及对比例1(左)所得冻干疫苗的外观形态对比结果如图1所示。由图1结果可见，本发明冻干工艺改进后所得疫苗形态得到了明显的改善。
2、对以上实施例及对比例所得冻干疫苗进行红细胞凝集(HA)实验检测疫苗效价及用红细胞凝集抑制(HI)方法检测抗体效价。对比结果如下表1所示。
表1
由表1结果可见，本发明冻干工艺改进后所得疫苗效价得到了明显的提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。