一种高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统及其应用
阅读说明：本技术 一种高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统及其应用 (Efficient targeted antitumor drug nano-carrier system and application thereof ) 是由 蒙青林 马士蛟 张金菊 王红光 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统,该高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统主要是通过SPDP将磁小体与重组SPA进行偶联制得；本发明提供的高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统具有较强的靶向性,尤其具有较强的靶向乳腺癌细胞(SK-BR-3)的性能。(The invention provides a high-efficiency targeted antitumor drug nano-carrier system, which is mainly prepared by coupling magnetosomes and recombinant SPA through SPDP; the efficient targeted antitumor drug nano-carrier system provided by the invention has stronger targeting property, and particularly has stronger performance of targeting breast cancer cells (SK-BR-3).)
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及一种高效靶向抗肿瘤药物纳米 载体系统及其应用。
背景技术
近年来，纳米磁珠在医学检验及治疗领域的地位日渐突出，纳米 材料的比表面积大，毒性低，具有靶向功能等特点，其在肿瘤诊断与 治疗已经成为研究热点，但是由于生物体环境比较复杂，纳米材料进 入人体后，其表面会吸附一层或多层蛋白，称之为蛋白冠(protein corona)，这一现象在纳米颗粒进入血液30s内即可完成，有研究表 明，当纳米材料连接转铁蛋白后进入生物环境中完全失去了靶向肿瘤 的能力。巨噬细胞表面含有多种受体，其能将纳米材料识别并且作为 异物将其吞噬且激活NF-kB系统，进而产生一系列的反应。使靶向效 率降低或者失去靶向性，从而导致治疗或者诊断效果大打折扣。
有研究报道，当纳米材料与血浆和富含免疫球蛋白(IgG)的血浆 孵育后，发现巨噬细胞对富含IgG的血浆孵育后纳米材料的吞噬要远 远大于对照组。另外有研究报道，非特异性吸附与化学偶联相比，化 学偶联的纳米材料被巨噬细胞吞噬的效率反而升高，为什么化学耦合 时Fab区域的暴露程度会降低，赖氨酸氨基酸残基的侧链中存在伯胺 以及每条多肽链的N-末端。绘制小鼠IgG1的赖氨酸分布表明赖氨酸残 基分布在Fc和Fab区域上(赖氨酸分布Fab：58％对Fc：42％)。这 是因为化学偶联大部分应用抗体中的氨基，这样不仅仅降低了抗体的 效价，更重要的是更多地把抗体的FC端暴露在外面让巨噬细胞识别。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明使用重组SPA对抗体的FC端进行 特异性结合，是抗体正向偶联在磁小体上，本发明提供了一种高效靶 向抗肿瘤药物纳米载体系统，该高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统主 要是通过SPDP将磁小体与重组SPA进行偶联制得。
进一步地，该高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统是通过SPDP将磁 小体与重组SPA进行偶联制得BMP-SPDP-RA，再将BMP-SPDP-RA与抗体 进行偶联制得。
进一步地，纳米载体系统是通过以下方法制备而成：
S1取SPDP溶解于二甲基亚砜中，制得溶液一，所述溶液一的浓度 为5-15mM；
S2取磁小体加入PBS中混匀制得溶液二，所述磁小体与所述SPDP 的质量比为0.5-1.5:1，所述磁小体在PBS中的浓度为1mg/0.8-1ml；
S3将溶液二加入到溶液一中超声混匀并偶联，制得第一混合溶液；
S4磁力吸附第一混合溶液，吸附后弃上清除去未结合的SPDP，再 用PBS清洗，制得BMP-SPDP；
S5将质量比为0.5-1.5:1的BMP-SPDP与重组SPA进行混合超声混 匀偶联，制得第二混合溶液；
S6磁力吸附第二混合溶液，洗掉未结合的重组SPA，再用PBS清 洗三遍，制得BMP-SPDP-RA。
其中，SPDP为双功能试剂3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚 胺酯，BMP为磁小体，RA代表与BMP-SPDP偶联的重组SPA。
进一步地，步骤S3和步骤S5的超声条件为均为超声1min，间歇 1min，重复30次。
进一步地，纳米载体系统的制备方法还包括步骤S7将所述 BMP-SPDP-RA与抗体进行偶联，步骤S7所述将BMP-SPDP-RA与抗体进 行偶联具体包括以下步骤：
S71取质量比为0.5-1.5:1的BMP-SPDP-RA和抗体放置于37℃的 摇床中混合1.5-2.5h，制得第三混合液；
S72磁力吸附将所述第三混合液，再用PBS清洗掉未结合的抗体， 制得BMP-SPDP-RA-TZ，即得纳米载体系统。
其中，TZ代表与BMP-SPDP-RA偶联的抗体-曲妥珠单抗。
进一步地，磁小体(野生型)使用前进行纯化，所述纯化包括以 下步骤：
(1)取菌泥与PBS按质量体积比1:10-20进行溶解；
(2)将步骤(1)的溶液用超声波细胞粉碎机超声，再用磁铁吸 附超声后的混合溶液中的磁小体，弃上清，再次加入PBS进行超声处 理、磁铁吸附，重复以上步骤直至上清蛋白浓度不再降低；即得BMP-WT。
其中，BMP-WT代表纯化后的磁小体。
进一步地，还需要将磁小体放置于蒸馏水中超声波清洗，磁铁吸 附，将吸附的磁小体用蒸馏水悬浮，液氮速冻后经冷冻干燥机冷冻干 燥，-20℃条件下保存备用。
进一步地，PBS的浓度为10mM，所述PBS的pH为7.4。
进一步地，步骤(2)具体步骤如下：
(21)将步骤(1)的混合溶液放置于容器内，用超声波细胞粉碎 机超声，超声条件为6号变幅杆，60％功率，超声3s，间歇5s，共超 声30min；
(22)在容器的底部放置磁铁，置于4℃条件下过夜吸附磁小体；
(23)弃上清，再加入PBS用超声波细胞粉碎机超声，超声条件 为50％功率，超声3s，间歇5s，共超声20min，磁力吸附6h；
弃上清，再加入PBS用超声波细胞粉碎机超声，超声条件为40％ 功率，超声3s，间歇5s，共超声20min，重复以上步骤直至上清蛋白 浓度不再降低，并随着超声次数的增加减小功率和超声时间。
进一步地，纯化后的磁小体还需使用蛋白酶K-tris进行处理，具 体包括以下步骤：
(3)用浓度为0.5-1.5mg/ml的蛋白酶K-tris溶液悬浮磁小体， 置于水浴锅(56℃恒温水浴)中处理2-4h；
(4)取出，磁力吸附收集磁小体，即得。
进一步地，重组SPA蛋白的序列如下：
CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKG SGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK。
进一步地，SPA重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的， 所述重组蛋白的合成方法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的B domain的N端添加一个半胱氨酸引入 巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamH Ⅰ与HindⅢ酶 切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化 进入E·coli BL21内；
(d)用IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白。
本发明还提供了纳米载药系统在制备靶向抗肿瘤药物的产品中的 应用。
本发明还提供了纳米载药系统在制备靶向SK-BR-3的产品中的应 用。
本发明提供了纳米材料偶联抗体且能有效避免被血液中的巨噬细 胞大量吞噬而造成靶向效率过低现象；同时将其暴露在生物环境中时， 如血浆中时，纳米材料依然具有良好的靶向性能。
说明书附图
图1.示出了重组蛋白SPA的亲和层析图；
图2.示出了蛋白酶K-tris处理后的磁小体的电镜图；
图3.示出了磁小体在蛋白酶K-tris处理前后的电泳图；
图4.示出了BMP-SPDP-RA-TZ偶联曲妥珠单抗量；
图5.示出了诱导人单核细胞成为巨噬细胞的光镜图；
图6.示出了巨噬细胞与BMP-SPDP-RA-IgG；BMP-WT；BMP-GA-IgG 共孵育后普鲁士蓝染色图；
图7.示出了巨噬细胞与BMP-SPDP-RA-IgG；BMP-GA-IgG；BMP-WT 平均荧光强度图；
图8.示出了巨噬细胞与BMP-SPDP-RA-TZ；BMP-SPDP-RA-TZ plasma； BMP-SPDP-RA-TZ IgG plasma；BMP-GA-TZ；BMP-GA-TZ plasma； BMP-GA-TZ IgG plasma共孵育后普鲁士蓝染色图；
图9.示出了乳腺癌细胞SK-BR-3/MDA-MB-468细胞表面HER2表达 的免疫荧光图像；
图10.示出了巨噬细胞与BMP-SPDP-RA-TZ；BMP-SPDP-RA-TZ plasma；BMP-SPDP-RA-TZ IgG plasma；BMP-GA-TZ；BMP-GA-TZ plasma； BMP-GA-TZ IgG plasma共孵育后细胞平均荧光强度图；
其中，图5中的A是正常的THP-1细胞(10x)；B是正常THP-1细胞(20x)； C是100ng/mL PMA诱导72h(10x)；D是100ng/mLPMA诱导72h(20x)。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统，该纳米 载药系统是通过SPDP将磁小体与重组SPA进行偶联制得BMP-SPDP-RA， 再将BMP-SPDP-RA与抗体进行偶联制得，具体通过以下方法制备而成：
S1取1mg的SPDP溶解于含有100μL二甲基亚砜的体积为1.5ml的 EP管中，制得溶液一；
S2取1mg磁小体，加入900μL的浓度为10mM、pH为7.4的PBS中 混匀，制得溶液二；
S3将溶液二加入到含有溶液一的EP管中超声混匀并偶联，超声 1min，间歇1min，重复30次，制得第一混合溶液；
S4将步骤S3内置第一混合溶液的EP管置于磁力架上，磁力吸附 1min，吸附后弃上清，再用pH为7.4的PBS清洗三遍，制得BMP-SPDP；
S5将1mg的BMP-SPDP与1mg重组SPA进行混合超声混匀偶联，超 声1min，间歇1min，重复30次，制得第二混合溶液；
S6将步骤S5的内置第二混合溶液的EP管放置于磁力架上磁力吸 附1min，洗掉未结合的重组SPA，再用pH为7.4的PBS清洗三遍，制 得BMP-SPDP-RA；
其中，重组SPA蛋白的序列如下：
CGSGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKG SGSGSADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNAAIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK；
该重组蛋白是在对来自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 的SPA基因的结构进行改造的基础上进行的，所述重组蛋白的合成方 法包括以下步骤：
(a)在天然SPA基因的Bdomain的N端添加一个半胱氨酸引入 巯基；
(b)在引入巯基的SPA基因的两端分别添加BamH Ⅰ与HindⅢ酶 切位点；
(c)将步骤(b)的SPA基因克隆进入PET28(a+)载体，并转化 进入E·coli BL21内；
(d)加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达；
(e)用亲和层析柱进行分离纯化得到纯净蛋白，即得重组蛋白， 重组蛋白SPA的亲和层析图见图1；
磁小体使用前进行纯化，所述纯化包括以下步骤：
(1)取10g菌泥，加入100g浓度为10mM、pH为7.4的PBS用玻 璃棒搅拌使菌泥充分溶解；
(2)将步骤(1)的溶液用超声波细胞粉碎机超声，再用磁铁吸 附超声后的混合溶液中的磁小体，弃上清，再次加入PBS进行超声处 理、磁铁吸附，重复以上步骤直至上清蛋白浓度不再降低，即得BMP-WT； 步骤(2)具体包括以下步骤：
(21)将步骤(1)的溶液放入烧杯中，用超声波细胞粉碎机超声， 选用6号变幅杆，60％功率进行超声处理，超声3秒，间歇5秒，共超 声30min，(22)在烧杯底部放磁铁，置于4℃条件下过夜吸附磁小体， (23)弃上清，再次加入浓度为10mM、pH为7.4的PBS进行超声处理， 超声条件为50％功率，超声3秒，间歇5秒，共超声20min，磁力吸附 6h，(24)弃上清，再次加入浓度为10mM、pH为7.4的PBS进行超声 处理，超声条件为40％功率，超声3秒，间歇5秒，共超声20min，重 复以上步骤直至上清蛋白浓度不再降低，并随着超声次数的增加减小功率和超声时间，即得BMP-WT；
检测步骤(2)所得上清液中OD260、OD290，计算上清液中蛋白含量， 计算公式为：上清蛋白浓度C(mg/ml)＝1.45OD290-0.74OD260；计算结 果为：上清液中蛋白含量为0.05mg/ml；
磁小体保存：将步骤(2)制得的磁小体放置于蒸馏水中超声波清 洗两次，磁铁吸附，将吸附的磁小体用蒸馏水悬浮，液氮速冻后经冷 冻干燥机冷冻干燥，-20℃条件下保存备用；
纯化后的磁小体还需使用蛋白酶K-tris进行处理，具体包括以下 步骤：
(3)将保存的磁小体分装至10ml离心管中，用浓度为1mg/ml的 蛋白酶K-tris溶液悬浮磁小体，置于水浴锅中，在56℃条件下处理 3h；
(4)将离心管从水浴锅中取出，磁力吸附收集磁小体，即得；
其中，蛋白酶K-tris购自上海罗氏制药有限公司；货号： 3115879001；
对使用蛋白酶K-tris处理后的磁小体进行电镜检测，结果见图 2，并检测磁小体在蛋白酶K-tris处理前后的电泳图，结果见图3；
实施例2
本实施例提供了一种高效靶向抗肿瘤药物纳米载体系统，该纳米 载体系统的制备方法包括实施例1的所有步骤和步骤S7将所述 BMP-SPDP-RA与抗体进行偶联，本实施例中的抗体为曲妥珠单抗(曲妥 珠单抗)，购自上海罗氏制药有限公司；将BMP-SPDP-RA与曲妥珠单 抗进行偶联具体包括以下步骤：
S71取1mg BMP-SPDP-RA与曲妥珠单抗1mg进行偶联，置于37℃ 摇床中混合2h；
S72混合均匀后置于磁力架上磁力吸附1min，然后用PH为7.4的 PBS清洗三遍，洗掉多余未结合的曲妥珠单抗，即得BMP-SPDP-RA-TZ。
试验例1 BMP-SPDP-RA偶联曲妥珠单抗的含量检测
使用BCA检测试剂盒检测实施例2的BMP-SPDP-RA偶联曲妥珠单 抗的含量，同时用戊二醛来偶联磁小体与曲妥珠单抗作为对照，具体 方法如下：取1mg的BMP-SPDP-RA加入1mg/ml的曲妥珠单抗(曲妥珠 单抗用PBS溶解)，留样检测，按照偶联步骤进行偶联，磁力吸附后 上清留样，进行上清蛋白含量检测，偶联之前曲妥珠单抗的量-偶联之 后曲妥珠单抗的量即为每毫克磁小体偶联曲妥珠单抗的量，试验结果 见图4，结果显示，结果显示，BMP-SPDP-RA-TZ可偶联522.5μg曲妥 珠单抗，BMP-GA-TZ可偶联530.1μg曲妥珠单抗，两者在统计学上没有 显著性差异。
试验例2 磁小体与巨噬细胞相互作用
2.1 单核细胞(THP-1)诱导为巨噬细胞
取人单核细胞(THP-1)，购自北京北纳创联生物技术研究院，用 终浓度为100ng/mL的乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)诱导其成为巨噬细胞， 诱导结果如图5所示，由图5可知，人单核细胞(THP-1)由悬浮的卵 圆形变成贴壁的长梭形和不规则型，表明单核细胞成功诱导为巨噬细 胞。
2.2 巨噬细胞和磁小体共孵育
制备BMP-GA-IgG：1、将戊二醛用PBS稀释5倍，制备成终浓度为 5％的戊二醛溶液；取1mgBMP-WT置于1.5mL EP管中，加入1mL5％的戊 二醛溶液，在超声波清洗器中超声1min，间歇1min，重复30次，用 PBS洗掉未结合的戊二醛溶液，即得BMP-GA；在EP管中加入1mg/ml的IgG溶液，在超声波清洗器中超声1min，间歇1min，重复30次， 用PBS洗掉未结合的IgG溶液，即得BMP-GA-IgG；GA代表戊二醛；
制备BMP-SPDP-RA-IgG：取1mg BMP-SPDP-RA与1mgIgG进行偶联， 置于37℃摇床中混合2h；混合均匀后置于磁力架上磁力吸附1min，然 后用PH为7.4的PBS清洗三遍，洗掉多余未结合的IgG，即得 BMP-SPDP-RA-IgG；
IgG购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo Fisher货号：4506)；
将空白细胞(未经过任何处理的人单核细胞)、BMP-GA-IgG、BMP-WT 和BMP-SPDP-RA-IgG分别与巨噬细胞共孵育，终浓度为10μg/mL，共孵 育4h，并用单独的吞噬细胞做对照，用普鲁士蓝染色观察胞内磁小体 的含量，结果图6所示，
由图6可知，当免疫球蛋白(IgG)正向偶联时，巨噬细胞对其吞 噬效率降低，当选用戊二醛作为双功能试剂时，巨噬细胞对其吞噬效 率明显高于BMP-SPDP-RA-IgG组。
2.3流式细胞术检测巨噬细胞对磁小体的吞噬效率
将空白细胞(未经过任何处理的人单核细胞)、BMP-SPDP-RA-IgG、 BMP-GA-IgG用异硫氰酸荧光素(FITC)染色，分别以终浓度10μg/mL 与巨噬细胞孵育4小时，用PBS清洗三次后收集细胞，用流式细胞术 对荧光强度进行检测，结果如图7所示，由图7可知，BMP-SPDP-RA-IgG 与BMP-GA-IgG相比，巨噬细胞的吞噬效率显著降低，具有显著性的差 异，表明IgG的偶联方向影响巨噬细胞对其识别和吞噬能力。
试验例3 与乳腺癌细胞(SK-BR-3)相互作用
3.1 SK-BR-3细胞表面蛋白HER2检测
通过兔抗HER2一抗和Alexa Fluor 488标记的抗兔二抗进行细胞 表面HER2鉴定，两种抗体均购自Thermo Fisher，SK-BR-3细胞表达 高表达人表皮生长因子受体-2(HER2)，而MDA-MB-468不表达HER2， 结果如图8所示，由图8可以看出，SK-BR-3细胞株正确且高表达HER2。
3.2SK-BR-3细胞相互作用
将BMP-GA-TZ和实施例2的BMP-SPDP-RA-TZ分别与血浆(Plasma) 和富含IgG血浆(IgG-Plasma)孵育两小时后与SK-BR-3细胞共孵育， 富含IgG血浆是在正常血浆中额外添加IgG，添加量为6mg/ml，IgG 购自Sigma.货号4506；本试验例中的SK-BR-3细胞由国家纳米科学中 心赠予；普鲁士染色后光学显微镜下观察，结果如图9所示，CK为空 白，由图9可知，当BMP-SPDP-RA-TZ、BMP-GA-TZ与血浆和富含IgG 血浆孵育后，SK-BR-3对BMP-SPDP-RA-TZ吞噬效率并没有表现出很明 显的差异，但是对BMP-GA-TZ的吞噬效率显著降低，表明蛋白冠的存 在使SK-BR-3对BMP-SPDP-RA-TZ的吞噬没有很明显的影响，但是严重 影响了SK-BR-3对BMP-GA-TZ的吞噬能力，表明蛋白冠的存在使 BMP-GA-TZ降低了靶向SK-BR-3的能力。
3.3 流式细胞术检测SK-BR-3对BMP-SPDP-RA-TZ、BMP-GA-TZ的吞 噬效率检测
将BMP-GA-TZ和实施例2的BMP-SPDP-RA-TZ用异硫氰酸荧光素 (FITC)染色两小时，以终浓度10μg/mL与SK-BR-3共孵育4h，收集 细胞进行荧光强度检测；结果如图10所示，由图10可知，当 BMP-SPDP-RA-TZ、BMP-GA-TZ与血浆和富含IgG的血浆孵育后，靶向 SK-BR-3的效率由不同程度的下降，当与血浆孵育后，SK-BR-3的荧光 强度在BMP-SPDP-RA-TZ与BMP-GA-TZ表现出了非常显著性差异，经过 富含IgG的血浆孵育后，其表现除了相同的趋势，表明在经过血浆孵 育后，BMP-SPDP-RA-TZ依然具有较强的靶向SK-BR-3的性能。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非 限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通 技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利 要求范围当中。