纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物及其应用
阅读说明：本技术 纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物及其应用 (Composition for degrading endogenous Survivin of cells through targeted ubiquitination of nano antibody and application of composition ) 是由 马兴元 刘畅 郑文云 胡发彪 郭伟 刘秋丽 付云辉 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物,包括Survivin纳米抗体、Fc结构域、T2A多肽和TRIM21,所述组合物优选为Nb4A-Fc-T2A-TRIM21。本发明采用纳米抗体和TRIM21共表达的方式,一方面可以提供纳米抗体以结合Survivin抗原,Fc片段以结合TRIM21；另一方面如果细胞内源性TRIM21水平不足以进行蛋白质的泛素化降解,则TRIM21可得以补充,维持泛素化的正常进行。此方式达到了靶向细胞内源性Survivin的泛素化降解的目的,为下游研究Survivin降解后对细胞产生的影响打下了坚实的基础,提示具有较强的药物应用前景。(The invention provides a composition for degrading endogenous Survivin of cells through targeted ubiquitination of nano antibodies, which comprises Survivin nano antibodies, an Fc domain, a T2A polypeptide and TRIM21, wherein the composition is preferably Nb4A-Fc-T2A-TRIM 21. According to the invention, a mode of co-expression of a nano antibody and TRIM21 is adopted, on one hand, the nano antibody can be provided to be combined with Survivin antigen, and the Fc fragment is combined with TRIM 21; on the other hand, if the level of cellular endogenous TRIM21 is not sufficient for ubiquitination degradation of proteins, TRIM21 can be supplemented to maintain normal ubiquitination. The method achieves the purpose of target cell endogenous Survivin ubiquitination degradation, lays a solid foundation for downstream research on the influence of Survivin degradation on cells, and prompts a strong medicine application prospect.)
技术领域
本发明涉及生物技术肿瘤治疗领域，尤其涉及纳米抗体靶向性泛素化降解 细胞内源性Survivin的组合物及其应用。
背景技术
生存素(Survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小成员，也是作用最 强的IAP家族分子，与IAP家族的其他凋亡抑制因子相比，Survivin在结构上 是十分独特的，仅仅含有单个的BIR结构域和羧基末端的螺旋结构，并没有其 它可识别的蛋白质结构域。Survivin蛋白由BIRC5基因编码，由4个外显子和 3个内含子组成，定位于17号染色体的端粒区。Survivin在大多数人类癌细胞 中高度表达，但在正常的、终末分化的成人组织中几乎不表达，并且Survivin 蛋白具有抑制肿瘤细胞凋亡、抑制细胞自噬、促进肿瘤细胞增殖和促进肿瘤化 疗耐药等功能，从而使其成为肿瘤治疗的新靶点。研究表明，降低细胞内源性 Survivin的表达量可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡，因此，对Survivin蛋白 的降解的研究可以为开发新型抗肿瘤药物提供新思路。
如今有不少抑制Survivin表达的策略，可总结为以下四类：(1)Survivin 转录抑制剂：多种Survivin反义寡核苷酸已被设计并成功地通过载体递送到细 胞，其能显著抑制Survivin蛋白的表达，并最终促进细胞凋亡和抑制细胞增殖； 核酶是一类小的RNA分子，能够通过核内切酶的活性裂解目标RNA，但是， 由于它们的局限性(例如，易于降解和异常的细胞运输)，目前没有一个核酶 进入临床试验；此外还包括siRNA。(2)翻译后水平的Survivin抑制剂：CDK 抑制剂和Hsp90抑制剂，许多CDK抑制剂例如黄吡醚和普瓦拉诺能够抑制 Survivin在Thr34位点的有丝分裂磷酸化，从而加速Survivin的降解。(3)基 于Survivin蛋白的疫苗：用含Survivin的载体转染的肿瘤细胞凋亡的激活；由 Survivin启动子驱动的细胞毒素基因在肿瘤细胞中的表达。(4)基因治疗与 Survivin的突变体：基于T淋巴细胞对特定肿瘤相关抗原的特异性识别，早期 的研究表明，一种基于Survivin的疫苗对肝癌细胞有显著的细胞毒活性； Survivin的负显性突变体也可以通过与细胞内源Survivin形成异源二聚体，从 而抑制Survivin的功能活性。
基于以上几种方法，目前缺乏一种在蛋白质水平急剧降解Survivin的方法， 我们想开发一种基于纳米抗体蛋白靶向的真正翻译后蛋白消耗方法，靶向细胞 内源性Survivin蛋白急剧降解，这种方法区别于DNA靶向及RNA靶向，而是 直接消耗稳定的蛋白质，并且研究Survivin降解后对细胞产生的影响。
抗体以高亲和力和特异性结合蛋白质，因此，抗体是靶向目标蛋白质的基 础。先前已有研究使用抗体来干扰蛋白质功能，然而，这需要抗体结合到一个 阻止蛋白质功能的表位上，并能有效地和内源性配体进行化学计量竞争，因此， 这种抑制方法只适用于数量非常有限的蛋白质。由于抗体结合的蛋白可被细胞 溶质抗体受体TRIM21识别，TRIM21是E3泛素连接酶，其以高亲和力结合 抗体的Fc结构域，TRIM21会将泛素-蛋白酶体系统募集到抗体结合的蛋白质 中，导致它们被降解。早在2007年就有文献提出IAP-XAFl复合物会在E3连 接酶和蛋白酶体介导下，在蛋白水平降解细胞内源性Survivin蛋白；近期也有 研究表明细胞质中的E3泛素连接酶CRL9能促进Survivin蛋白的泛素化降解 以维持细胞微管与基因组稳定性，进而抑制肿瘤进程。
本实验室前期以人源Survivin为抗原，从随机七肽与十二肽噬菌体展示文 库中筛选出一系列纳米抗体，其对Survivin的亲和力和特异性都比较强，共获 得10种嵌合纳米抗体，经亲和力测定最终得到5种与Survivin有较高亲和力 的纳米抗体，分别为Nb1A，Nb2A，Nb4A，Nb1B和Nb4B，序列分别如SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.1，SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示， 其中Nb4A为靶向Survivin最优的纳米抗体。[1.文章-Zhang N,Guo H,Zheng W,et al.Design and screening of a chimeric survivin-specificnanobody and its anticancer activities in vitro[J].Anti Cancer Drugs,2016,27(9):839-847.；2.专利- 靶向survivin纳米抗体及其制备方法和应用，马兴元，张娜，吴东，郑文云， 郭华，胡发彪；3.学位论文-华东理工大学张娜：基于驼类抗体结构的Survivin 靶向嵌合纳米抗体研制]。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物。
本发明第二个目的在于，提供含有纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物的重组质粒。
本发明第三个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性 Survivin的组合物的制备方法。
本发明第四个目的在于，提供纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性 Survivin的组合物或其重组质粒在制备治疗Survivin过表达的肿瘤的基因药物 中的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了纳米抗体靶向性泛素化降解细胞 内源性Survivin的组合物，所述组合物包括Survivin纳米抗体、Fc结构域、T2A 多肽和TRIM21，所述Survivin纳米抗体序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8任一所示。
作为一个优选方案，所述组合物为Nb4A-Fc-T2A-TRIM21，所述Nb4A的 序列如SEQID NO.1所示，所述T2A多肽前添加GSG三个氨基酸。
所述Fc为抗体的恒定区，可以是任意抗体的Fc片段，本发明所用的序列 来自抗PD-L1抗体的Fc区，序列如SEQ ID NO.2所示。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了含有纳米抗体靶向性泛素化降解 细胞内源性Survivin的组合物的重组质粒。
作为一个优选方案，所述重组质粒为 pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了所述纳米抗体靶向性泛素化降解 细胞内源性Survivin的组合物的制备方法，利用Survivin的纳米抗体对Survivin 的靶向性，以及抗体Fc区与泛素连接酶TRIM21羧基末端PRYSPRY结构域 特异性结合的能力，将纳米抗体与抗体Fc区的基因序列融合，再用T2A小肽 连接实现与TRIM21的共表达。为了保证T2A的高切割效率以及下游片段的 正确定位表达，在T2A前添加了GSG三个氨基酸。
其中所述T2A小肽来自眀脉扁刺蛾β四体病毒衣壳蛋白，T2A序列如SEQ ID NO.3所示，所述的TRIM21序列如SEQ ID NO.4所示。
为了实现上述第四个目的，本发明提供了所述纳米抗体靶向性泛素化降解 细胞内源性Survivin的组合物或其重组质粒在制备治疗Survivin过表达的肿瘤 的基因药物中的应用。
作为一个优选方案，所述Survivin过表达的肿瘤包括肺癌、胰腺癌、肝癌、 乳腺癌以及膀胱癌。因为Survivin在大多数肿瘤细胞中异常表达，并且发挥着 抗凋亡和促增殖的功能，本发明中的组合物Nb4A-Fc-T2A-TRIM21是靶向所 有细胞中的Survivin以降解细胞内源性Survivin为目的，没有细胞特异性，对 于Survivin过表达的肿瘤细胞均有降低其内源Survivin蛋白表达量的效果，当 肿瘤细胞中的Survivin被降解后，会诱导细胞凋亡。
Western-Blot分析发现，Nb4A-Fc-T2A-TRIM21能大量降解细胞内源性 Survivin蛋白，其降解Survivin的能力是Nb4A的3.72倍，TRIM21的2.84倍； 并且利用蛋白酶体抑制剂MG132验证了该方法对Survivin的降解是由泛素-蛋 白酶体途径介导的。流式检测细胞凋亡率发现，Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对 MCF-7细胞的凋亡率达到58.52％，是单独的Nb4A和TRIM21的两倍多，然 而对Survivin低表达的L-02细胞的凋亡率仅为14.56％，表明 Nb4A-Fc-T2A-TIRM21可以通过降解癌细胞中的Survivin进而促进细胞凋亡。
本发明选取利用噬菌体展示文库筛选出的针对Survivin的纳米抗体靶向Survivin抗原，抗体以高亲和力和特异性结合蛋白质，尤其Nb4A更是具有分 子量小的优势，更优的特异性，更强的识别抗原表位的能力。本发明实施例中 以Nb4A纳米抗体为例，利用Nb4A与Fc区融合，运用T2A与TRIM21共表 达。T2A是由54个碱基编码的18个氨基酸的多肽，来自于眀脉扁刺蛾β四体 病毒(Thoseaasigna virus)衣壳蛋白，因为真核生物的核糖体不能在甘氨酸(Gly) 和脯氨酸(Pro)两个氨基酸之间形成肽键，故能够形成两个单独的多肽链。 为了保证T2A的高切割效率以及下游片段的正确定位表达，在T2A前加上 GSG三个氨基酸，将其运用到本设计上实现了在同一真核细胞中Nb4A-Fc和 TRIM21的共表达，可以达到由泛素连接酶TRIM21介导的细胞内源性Survivin 降解的目的。
本发明选取的TRIM21是E3泛素连接酶，其PRYSPRY结构域以高亲和 力结合抗体的Fc结构域，Fc结构域是抗体的重链恒定区，其中重叠的-CH2- 和-CH3-结构域可与TRIM21结合。TRIM21将泛素-蛋白酶体系统募集到纳米 抗体Nb4A结合的Survivin中，导致Survivin被急剧降解，从而抑制了Survivin 在抗凋亡中的作用，促进肿瘤细胞凋亡的发生。
本发明的优点在于：我们采用纳米抗体和TRIM21共表达的方式，一方面 可以提供纳米抗体以结合Survivin抗原，Fc片段以结合TRIM21；另一方面如 果细胞内源性TRIM21水平不足以进行蛋白质的泛素化降解，则TRIM21可得 以补充，维持泛素化的正常进行。此方式达到了靶向细胞内源性Survivin的泛 素化降解的目的，为下游研究Survivin降解后对细胞产生的影响打下了坚实的 基础。本发明建立了一种直接在蛋白水平降解内源性Survivin的平台，为临床 上靶向Survivin的肿瘤治疗提供新的策略。
附图说明
图1为纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的流程示意图。
图2为抗体Fc片段氨基酸序列和3D结构的一致性分析，A图是运用 Muscle软件将抗PD-L1抗体的Fc区氨基酸序列与人源IgG的Fc区氨基酸序 列做一致性分析，其中，1：人源IgG的Fc区氨基酸序列，2：抗PD-L1抗体 的Fc区氨基酸序列；B图是运用I-TASSER对两个Fc片段进行蛋白3D结构 预测的结果。
图3为Nb4A与Fc片段融合前后的蛋白3D结构，A图是Nb4A蛋白的 3D结构预测结果；B图是Fc片段的3D结构预测结果；C图是Nb4A-Fc融合 蛋白的3D结构预测结果。
图4为表达质粒构建体设计与示意图，A图为重组质粒pcDNA3.1(+)-Nb4A 构建示意图，B图为重组质粒pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc构建示意图，C图为重组 质粒pcDNA3.1(+)-TRIM21构建示意图，D图为重组质粒 pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21构建示意图。
图5为纳米抗体Nb4A基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL 1000Marker；泳道1：PCR扩增的Nb4A基因片段。
图6为Nb4A-Fc基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL 2000 Marker；泳道1：重叠延伸PCR扩增的Nb4A-Fc基因片段。
图7为TRIM21基因重叠延伸PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M： DL2000Marker；泳道1：PCR扩增的TRIM21基因片段。
图8为Nb4A-Fc-T2A-TRIM21基因重叠延伸PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳 图，泳道M：DL 5000Marker；泳道1：重叠延伸PCR扩增的 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21基因片段。
图9为质粒pcDNA3.1(+)双酶切前后的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DL 1000Marker；泳道1：pcDNA3.1(+)质粒；泳道2：pcDNA3.1(+)质粒双酶切后。
图10为Western-blot分析细胞内源性Survivin的变化，分别将转染重组质 粒pcDNA3.1(+)-Nb4A、pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc、pcDNA3.1(+)-TRIM21、 pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21和pcDNA3.1(+)质粒转染于MCF-7细胞， 同时设置空白对照和Lipofectamine3000阴性对照组，48h后，Western Blot 检测细胞内Survivin的降解情况。A图为Western-blot结果图，B图是对各组 细胞内源性Survivin表达量的柱形统计图(**P<0.01，***P<0.001与对照 组比较，#P<0.05，mean±SD，n＝3)。其中，Control为空白对照；pcNDA3.1(+)代表转染质粒pcNDA3.1(+)的阴性对照组；Nb4A代表转染重组质粒 pcNDA3.1(+)-Nb4A的实验组；Nb4A-Fc代表转染重组质粒 pcNDA3.1(+)-Nb4A-Fc的实验组；TRIM21代表转染重组质粒 pcNDA3.1(+)-TRIM21的实验组；Nb4A-Fc-T2A-TRIM21代表转染重组质粒 pcNDA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的实验组；Lipofectamine3000代表只有转 染试剂不含DNA的对照组。(在之后的内容中，出现上述的各组名称均代表与 此相同的含义)。
图11为Hoechst 33258核染观察细胞核形态的变化，A图为不同重组质粒 转染于MCF-7细胞24h后的核染结果；B图为不同重组质粒转染于MCF-7细 胞48h后的核染结果；C图为不同重组质粒转染于L-02细胞24h后的核染结 果；D图为不同重组质粒转染于L-02细胞48h后的核染结果。(Bar＝100μm)。
图12为Annexin V/PI双染法检测不同质粒对MCF-7细胞和L-02细胞的 促凋亡能力，A图为流式检测不同质粒转染MCF-7细胞48h后对细胞的促凋 亡能力；B图为各组的MCF-7细胞凋亡率的统计(***P<0.001与对照组相 比，mean±SD，n＝3)；C图为流式检测Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对L-02细胞的 促凋亡能力。图13为蛋白酶体抑制剂MG132验证survivin通过泛素-蛋白酶体 途径介导的降解。
图13为Western Blot分析MG132对重组质粒降解Survivin能力的干预， 0.5μM的MG132预处理MCF-7细胞3h，分别将转染重组质粒 pcDNA3.1(+)-Nb4A、pcDNA3.1(+)-TRIM21、 pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21转染于MCF-7细胞，设置空白对照组(同 样用0.5μM的MG132处理，但不作转染)，48h后，Western Blot检测细胞内 Survivin的表达水平。
图14为MG132对重组质粒促凋亡能力的影响，A图为在有无MG132的 干预下，流式细胞仪检测不同质粒转染MCF-7细胞48h后的细胞凋亡率(上 层为加0.5μM MG132的流式细胞仪检测结果，下层为无MG132的流式细胞 仪检测结果)；B图为各组的MCF-7细胞在有无MG132的干预下细胞凋亡率 的对比(***P<0.00，与+MG132组相比，mean±SD，n＝3)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方 法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的实验材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
实施例1.基于细胞内源性Survivin泛素化降解系统 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的理论设计
(1)纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的设计方案，如图1 所示，本设计首先融合Survivin的纳米抗体Nb4A与抗体的Fc片段，然后运 用T2A小肽实现Nb4A-Fc与TRIM21的共表达。如图1所示，纳米抗体Nb4A 会靶向Survivin蛋白，TRIM21羧基末端的PRYSPRY结构域会与Fc片段特异 性结合，从而会引发Survivin蛋白通过泛素-蛋白酶体途径发生大量降解。
(2)基因序列的获取：基因序列的获取通常是基因工程的第一步，本实 验所需的基因序列分别用以下几种方式获取：Nb4A(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)是本实验前期以人源Survivin为抗原，利用噬菌体展示文库筛选 出的纳米抗体，基因序列已确定，并将其克隆在了pET-24a(+)质粒上；Fc片段 (氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)来源于实验室前期已合成的抗PD-L1的 抗体，并运用Muscle软件将其氨基酸序列与PDB数据库(https://www.rcsb.org/) 中公布的人源IgG的Fc区氨基酸序列做一致性分析，结果如图2所示，抗PD-L1 抗体的Fc区氨基酸序列与人源IgG的Fc区氨基酸序列一致性为96.89％，仅 有位于中间的7处氨基酸不同，其N端与羧基C末端与IgG都是完全一致的， 这并不会影响Fc片段羧基末端PRYSPRY结构域与TRIM21结合的能力；并 且由两个Fc片段的3D结构模拟结果发现，高级结构是相同的，该片段理论上 也会发挥预期的功能；TRIM21的基因序列从购买的pGEM-TRIM21载体上获 得；T2A(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)是一段由54个碱基编码的18个 氨基酸的小肽，羧基末端是甘氨酸-脯氨酸序列，由于真核生物的核糖体不能 在甘氨酸和脯氨酸之间形成肽键，从而能够使其连接的片段形成两个单独的多 肽链，为了保证T2A的高切割效率以及下游片段的正确定位表达，在本实验 中T2A前添加了GSG三个氨基酸。
(3)蛋白3D结构的预测：为了证明本实验设计理论上的可行性，用 I-TASSER进行蛋白3D结构的预测。如图3所示，Nb4A-Fc在融合前后Nb4A 的CDR3没有发生任何变化，Nb4A和Fc融合后并不会影响Nb4A的功能活性， 对比A图和B图可以看出在融合前后Fc片段的结构基本没有发生变化，即不 会影响Fc功能的发挥。因此，Nb4A-Fc融合蛋白理论上不会影响Nb4A和Fc 各自的功能，Nb4A-Fc融合蛋白既可以发挥Nb4A靶向Survivin蛋白的功能， 也可以发挥Fc特异性结合TRIM21的功能，这种设计是可行的。
实施例2.重组质粒pcDNA3.1(+)-Nb4A、pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc、 pcDNA3.1(+)-TRIM21和pcDNA3.1(+)-Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的构建
主要材料
表1实验所用质粒与菌株
Table 1Plasmids and strains used in experiments
主要试剂
表2实验所用酶类与试剂
Table 2Enzymes and reagent used in experiments
引物设计
根据目的序列分别设计相应的引物，引物序列如表3所列，其中所用的F 代表某个片段的上游引物；F1和F2分别代表某两个片段重延伸PCR时第一个 片段的上游引物和第二个片段的上游；R1和R2分别代表某两个片段重延伸 PCR时第一个片段的下游引物和第二个片段的下游；R代表某个片段的下游引 物；下划线为相应的酶切位点。
表3引物序列
Table 3Sequences of Primers
以pcDNA3.1(+)-Nb4A(Bam HI/Xho I)重组质粒的构建为例，重组质粒构 建示意图如图4所示。
PCR反应体系：
模板：1μl，正向引物：1μl，反向引物：1μl，PrimeSTAR Max Premix(2×)： 25μl，ddH2O：22μl，总体积50μl。
PCR反应条件：
(1)预变性：94℃，2min；(2)变性：94℃，30sec，退火：63℃，5sec， 延伸：72℃，45sec，30个循环；(3)终延伸：72℃，10min。
琼脂糖凝胶电泳检测目的片段PCR扩增情况，并凝胶DNA小量回收试剂 盒回收纯化目的片段，各目的基因片段的电泳图如图5-8所示。将回收的PCR 目的产物与pcDNA3.1(+)载体用限制性内切酶Bam HI/Xho I分别双酶切。
双酶切PCR目的产物的体系：Nb4A基因片段：6μl，10×H buffer：5μl， Bam HI：1μl，Xho I：1μl，ddH2O：37μl，总体积50μl。
双酶切载体：pcDNA3.1(+)质粒：5μl，10×H buffer：5μl，Bam HI：1μl， Xho I：1μl，ddH2O：38μl，总体积50μl。
将酶切Nb4A基因片段与pcDNA3.1(+)载体在16℃恒温水浴中过夜连接。 质粒酶切前后的电泳图如图9所示。
连接体系：Nb4A基因片段：4μl，pcDNA3.1(+)载体：6μl，T4 ligase：0.5 μl，T4ligase buffer：1.1μl，总体积11.6μl。
将连接产物转化至感受态E.coli DH5α，挑取单菌落，LB培养基试管摇菌， 通过菌液PCR验证是否有目的条带，将能扩增出目的条带的菌液送样测序。 基因测序正确，pcDNA3.1(+)-Nb4A重组质粒构建成功。
试验实施例3：Western-blot检测细胞内源性Survivin的变化
细胞的复苏，换液，传代及冻存见《精编细胞生物学实验指南》。
表4 Western-blot所用试剂
Table 4Western-blot reagents
将本发明构建的重组质粒按照上述方法转染至MCF-7细胞中，48h后检 验细胞内Survivin的变化情况。实验步骤为：
(1)SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白见《精编蛋白质科学实验指南》第十 章10.1单元和10.4单元。
(2)每个离心管加入200μL的细胞裂解液NP40，用移液器将细胞团吹 打均匀，冰育裂解30min，每隔5min将细胞重悬，使得细胞裂解完全。
(3)30min后，3000rpm，4℃离心10min，收集上清液，去除沉淀。用 BCA法测定蛋白浓度(具体步骤参照BCA法微量蛋白浓度测定试剂盒说明 书)，根据测定的蛋白浓度，定量总蛋白浓度，确定上样体积。
(4)上样。Maker孔加5μL三色预染maker，加样孔加入经4×Loading buffer 煮沸过的蛋白样，加入1×上样缓冲液到上样槽，插入电极，调节电压为80V， 大约经过30min后，溴酚蓝跑过浓缩胶后调节电压为120V，大约经过90min 后，溴酚蓝跑到玻璃板底部。
(5)将SDS-PAGE蛋白电泳胶小心地从玻璃板上剥离下来，根据三色预 染maker的位置，切除浓缩胶部分，切下β-actin和Survivin蛋白分子量大小的 胶部分。
(6)转膜。200mA，50min。
(7)转膜结束后，将PVDF膜放置于封闭液中，室温震荡2h。去掉封闭 液，将稀释好的β-actin抗体，Survivin抗体孵育于膜上，4℃过夜。
(8)TBST清洗3次，每次室温震荡5min。
(9)孵二抗，室温震荡1h。
(10)TBST清洗3次，洗净残留的二抗。
(11)ECL显色，将PVDF膜放置于凝胶成像仪中，覆盖ECL发光显色 液，选择合适的曝光时间曝光拍照。
根据图10所示的Western-blot检测结果，与空白对照相比，除阴性对照Lipofectamine 3000组和pcDNA3.1(+)组外，其他实验组中细胞内源性Survivin 的表达量均有不同程度的降低，其中Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞内源性 Survivin的表达量最低，即对Survivin的降解能力最强，其降解Survivin的能 力是Nb4A组的3.72倍，Nb4A-Fc组的2.76倍，TRIM21组的2.84倍，同时 也反映出，通过外源物质Nb4A-Fc-T2A-TRIM21可以使细胞内源性Survivin 在蛋白水平发生大量的降解，进而可导致细胞凋亡的发生。
试验实施例4：基于纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin技术 在促进细胞凋亡方面的应用
1.Hoechst 33258核染观察细胞核形态的变化
将本发明构建的重组质粒按照上述方法转染至MCF-7细胞和L-02细胞 中，24h和48h后分别用Hoechst33258染色，观察细胞核的变化。具体过程 见《精编细胞癌生物学实验指南》第十一章单元11.4。
如图11核染结果所示，在经过24h和48h后，空白组和阴性对照组的细 胞的细胞核均保持一定形态，呈现出正常的蓝色，核为椭圆形且清晰，边缘完 整而且光滑；在L-02细胞中，转染24h和48h后，与对照组各细胞的细胞核 相比，实验组各细胞的细胞核形态均没有发生显著变化，细胞核清晰完整；在 MCF-7细胞中，转染24h后，与对照组相比，实验组中Nb4A-Fc-T2A-TRIM21 组的细胞核有稍微的变化，细胞核形态开始变得不规则，颜色淡化，说明细胞 可能有发生凋亡的趋势，其他组无明显变化，而转染48h后，实验组中 Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞核发生明显变化，细胞核呈现碎块状，形状大 小不规则均一，有核浓缩、核溶解和核碎裂的现象，其他实验组也发生了低程 度的这种变化，但均没有Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的变化显著，说明细胞发 生了不同程度的凋亡，并且Nb4A-Fc-T2A-TRIM21实验组的凋亡程度应该是 最强的，但此结论还需要通过流式细胞仪定量检测各组细胞的凋亡率来进一步 证明。
2.流式细胞仪定量检测细胞凋亡率
将本发明构建的重组质粒按照上述方法转染至MCF-7细胞和L-02细胞 中，48h后收集细胞使用流式细胞仪通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡， 实验步骤为：
(1)收集6孔板中所有的死活细胞，PBS洗涤2次，留取细胞沉淀。
(2)每管加入200μL Annexin V-FITV/PI双染试剂盒中的结合缓冲液，轻 轻吹打至细胞完全分散重悬，加入5μL的Annexin V-FITC，轻轻上下混匀， 室温避光孵育15min。
(3)避光孵育15min后，加入10μL的PI，轻轻上下摇晃室温避光孵育 10min。之后，放入冰盒避光冰育10min后，用流式细胞仪检测各样品。
流式检测结果如图12所示，在转染Survivin高表达的MCF-7细胞48h 后，Nb4A-Fc-T2A-TIRM21组的细胞凋亡率(处在早晚期凋亡的细胞和死细胞 占总细胞的比例)最高，达到58.52％，是单独的Nb4A和TRIM21的两倍多， 促凋亡能力最强，而空白对照和阴性对照的细胞凋亡率均不超过10％，在正常 的范围内；然而在转染Survivin低表达的L-02细胞48h后，实验组 Nb4A-Fc-T2A-TIRM21的细胞凋亡率仅为14.56％，这说明 Nb4A-Fc-T2A-TIRM21对细胞的凋亡具有很强的促进作用。由于本设计 Nb4A-Fc-T2A-TIRM21会靶向细胞内源性Survivin的泛素化降解，并且 Western-blot结果显示Nb4A-Fc-T2A-TRIM21可以使细胞内源性Survivin在蛋 白水平发生大量的降解，所以该促凋亡作用是因Survivin被降解而造成的。
3.蛋白酶体抑制剂MG132验证Survivin是通过泛素-蛋白酶体途径的降 解。
本发明使用0.5μmol/L的MG132，预先处理细胞3h，再与质粒共处理48h 后，按照上述方法检测细胞中Survivin的变化和细胞凋亡。
如图13，Western Blot结果显示，当MCF-7细胞用0.5μM的MG132干预 后，与Control组相比，Nb4A组、TRIM21组和Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组中 Survivin蛋白的表达量几乎均没有发生变化，该结果与未加MG132的实验结 果存在显著的差异。在无MG132干预的情况下，Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的降 解能力最强，而在MG132干预下，其对Survivin蛋白均没有发生明显降解， 说明蛋白酶体抑制剂MG132抑制了Survivin的降解。这是由于MG132选择性的抑制Proteasome，进而抑制泛素-蛋白酶体途径，因此结合本实验结果可以证 明Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对Survivin的降解是通过泛素-蛋白酶体途径介导。
如图14，流式检测细胞凋亡率发现，与没有MG132存在的结果相比，在 MG132的干预下，Nb4A组细胞凋亡率由27.42％下降为19.09％，仅仅降低了 7.33％，TRIM21组的细胞凋亡率由26.59％下降为13.98％，降低了近二分之一， 而Nb4A-Fc-T2A-TRIM21组的细胞凋亡率由58.52％下降为15.15％，差异最为 显著，说明蛋白酶体抑制剂MG132抑制了Nb4A-Fc-T2A-TRIM21对Survivin 蛋白的降解，进而Nb4A-Fc-T2A-TRIM21的促凋亡功能也受到抑制。结合 Western-blot结果，表明本设计Nb4A-Fc-T2A-TRIM21是通过泛素-蛋白酶体途 径介导Survivin的泛素化降解。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 纳米抗体靶向性泛素化降解细胞内源性Survivin的组合物及其应用
<130> /
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala
20 25 30
Val Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gln Leu Pro Phe His His Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 4
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Ser Ala Ala Arg Leu Thr Met Met Trp Glu Glu Val Thr Cys
1 5 10 15
Pro Ile Cys Leu Asp Pro Phe Val Glu Pro Val Ser Ile Glu Cys Gly
20 25 30
His Ser Phe Cys Gln Glu Cys Ile Ser Gln Val Gly Lys Gly Gly Gly
35 40 45
Ser Val Cys Pro Val Cys Arg Gln Arg Phe Leu Leu Lys Asn Leu Arg
50 55 60
Pro Asn Arg Gln Leu Ala Asn Met Val Asn Asn Leu Lys Glu Ile Ser
65 70 75 80
Gln Glu Ala Arg Glu Gly Thr Gln Gly Glu Arg Cys Ala Val His Gly
85 90 95
Glu Arg Leu His Leu Phe Cys Glu Lys Asp Gly Lys Ala Leu Cys Trp
100 105 110
Val Cys Ala Gln Ser Arg Lys His Arg Asp His Ala Met Val Pro Leu
115 120 125
Glu Glu Ala Ala Gln Glu Tyr Gln Glu Lys Leu Gln Val Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Leu Arg Arg Lys Gln Glu Leu Ala Glu Lys Leu Glu Val Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ile Lys Arg Ala Asp Trp Lys Lys Thr Val Glu Thr Gln Lys Ser
165 170 175
Arg Ile His Ala Glu Phe Val Gln Gln Lys Asn Phe Leu Val Glu Glu
180 185 190
Glu Gln Arg Gln Leu Gln Glu Leu Glu Lys Asp Glu Arg Glu Gln Leu
195 200 205
Arg Ile Leu Gly Glu Lys Glu Ala Lys Leu Ala Gln Gln Ser Gln Ala
210 215 220
Leu Gln Glu Leu Ile Ser Glu Leu Asp Arg Arg Cys His Ser Ser Ala
225 230 235 240
Leu Glu Leu Leu Gln Glu Val Ile Ile Val Leu Glu Arg Ser Glu Ser
245 250 255
Trp Asn Leu Lys Asp Leu Asp Ile Thr Ser Pro Glu Leu Arg Ser Val
260 265 270
Cys His Val Pro Gly Leu Lys Lys Met Leu Arg Thr Cys Ala Val His
275 280 285
Ile Thr Leu Asp Pro Asp Thr Ala Asn Pro Trp Leu Ile Leu Ser Glu
290 295 300
Asp Arg Arg Gln Val Arg Leu Gly Asp Thr Gln Gln Ser Ile Pro Gly
305 310 315 320
Asn Glu Glu Arg Phe Asp Ser Tyr Pro Met Val Leu Gly Ala Gln His
325 330 335
Phe His Ser Gly Lys His Tyr Trp Glu Val Asp Val Thr Gly Lys Glu
340 345 350
Ala Trp Asp Leu Gly Val Cys Arg Asp Ser Val Arg Arg Lys Gly His
355 360 365
Phe Leu Leu Ser Ser Lys Ser Gly Phe Trp Thr Ile Trp Leu Trp Asn
370 375 380
Lys Gln Lys Tyr Glu Ala Gly Thr Tyr Pro Gln Thr Pro Leu His Leu
385 390 395 400
Gln Val Pro Pro Cys Gln Val Gly Ile Phe Leu Asp Tyr Glu Ala Gly
405 410 415
Met Val Ser Phe Tyr Asn Ile Thr Asp His Gly Ser Leu Ile Tyr Ser
420 425 430
Phe Ser Glu Cys Ala Phe Thr Gly Pro Leu Arg Pro Phe Phe Ser Pro
435 440 445
Gly Phe Asn Asp Gly Gly Lys Asn Thr Ala Pro Leu Thr Leu Cys Pro
450 455 460
Leu Asn Ile Gly Ser Gln Gly Ser Thr Asp Tyr
465 470 475
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala
20 25 30
Val Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 6
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala
20 25 30
Val Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Thr Lys Ser Asn Leu Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Gly Val Tyr Lys Val Ala Tyr Asp Trp Gln His Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala
20 25 30
Val Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Pro Thr Val Ser Asp Trp Met Pro Ile Tyr Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala
20 25 30
Val Pro Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe
35 40 45
Val Ala Ala Ile Ser Gln Leu Pro Phe His His Tyr Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Ser Pro Thr Val Ser Asp Trp Met Pro Ile Tyr Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120