阅读说明：本技术 一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法 (Method for acquiring metabolic flux of intracellular central carbon metabolic pathway under metabolic steady isotope unsteady state ) 是由 夏建业 李欢 陈敏 郑世媛 汪佳琪 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法,包括批培养模块、恒化培养模块、取样模块、处理与分析样品模块；当所述批培养模块中的OUR和CER同时出现下降时转入所述恒化培养模块；所述恒化培养模块中具体包括：流加不含同位素标记底物的营养液,同时开启排废,进行恒化培养,直至使微生物细胞处于代谢稳态时,切换成流加含同位素标记底物的营养液,保持培养条件不变；当所述同位素标记底物流入反应器内时开始快速、连续取样,同时进入所述取样模块。本发明的方法在短时间内获得一系列发酵液样品,进而处理、分析样品得到精确的胞内代谢物同位素丰度数据,对计算代谢通量起着至关重要的作用。(The invention discloses a method for acquiring metabolic flux of an intracellular central carbon metabolic pathway under a metabolic steady isotope non-steady state, which comprises a batch culture module, a chemostat culture module, a sampling module and a sample processing and analyzing module; transferring to the chemostat culture module when the OUR and the CER in the batch culture module are simultaneously reduced; the chemostat culture module specifically comprises: feeding nutrient solution without isotope labeled substrate, simultaneously starting waste discharge, performing chemostat culture, switching to feeding nutrient solution containing isotope labeled substrate when the microbial cells are in metabolic steady state, and keeping culture conditions unchanged; rapid, continuous sampling begins as the isotopically labeled substrate flows into the reactor, simultaneously entering the sampling module. The method of the invention obtains a series of fermentation liquor samples in a short time, and then processes and analyzes the samples to obtain accurate intracellular metabolite isotope abundance data, which plays an important role in calculating metabolic flux.)

一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径 代谢通量的方法

技术领域

本发明涉及计算代谢流技术领域，尤其涉及一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法。

背景技术

“多组学”技术的快速发展，使高通量地获取各种生物分子的丰度成为可能，从而可以确定不同生理状态下各个组学的变化及微妙联系。微生物系统生物学研究中各种组学得到应用，包括转录组学，测量mRNA转录水平；蛋白质组学，量化蛋白质的丰度；代谢物组学，测定细胞代谢物丰度；代谢流组学，建立细胞内代谢网络中流量分布。同时，代谢流是将“基因-蛋白质-代谢物”相互作用的综合网络反应进行量化的结果，是细胞的生理代谢状态最直接的表现。从中可知，代谢流对于微生物细胞的代谢特性研究非常重要。经过几十年的发展，微生物细胞代谢流分析方法逐渐成熟。从最早采用经典计量学的代谢流分析方法，到使用同位素丰度数据来约束的¹³C-MFA，再到最近的同位素非稳态下运用微分方程来评估代谢流的INST-MFA。在此期间，为了简化计算的复杂性，有研究人员还提出了一种创新型的EMU分解方法，推动了代谢流组学的发展。

目前，计算代谢流的理论方法已经非常成熟，但是相关的实验方法还并不完善，存在以下的问题：大容量的生物反应器，在同位素标记实验的过程中会浪费不必要的¹³C葡萄糖，导致实验成本高昂；切换底物的实验操作中，复杂的管路容易造成流加底物的空窗期，影响微生物的生理代谢状态；繁琐的取样装置，会影响取样效率，同时取样量过大会干扰代谢稳态下微生物；提取胞内代谢物的过程中容易发生泄露，影响实验结果的准确性；浓缩过程中，时间过长或温度过高易造成胞内代谢物失活等缺点。可见，当前计算代谢通量实验中面临着成本高昂、操作繁琐、稳定性较差的问题。

因此，亟需提供一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法，通过快速取样在短时间内获得一系列发酵液样品，进而处理、分析样品得到精确的胞内代谢物同位素丰度数据，同时也可以保证用该方法获取的实验数据所计算得到的代谢通量结果的准确性，对计算代谢通量起着至关重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法，通过快速取样装置在短时间内获得一系列发酵液样品，进而处理、分析样品得到精确的胞内代谢物同位素丰度数据及交换反应速率。

为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。

本发明提供了一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法，包括批培养模块、恒化培养模块、取样模块、处理与分析样品模块；其中，

当所述批培养模块中的摄氧率(OUR)和CO₂释放速率(CER)同时出现下降时转入所述恒化培养模块；

所述恒化培养模块中具体包括：流加不含同位素标记底物的营养液，同时开启排废，进行恒化培养，直至使微生物细胞处于代谢稳态时，切换成流加含同位素标记底物的营养液，保持培养条件不变；

当所述同位素标记底物流入反应器内时开始快速、连续取样，此时进入所述取样模块；

所述处理与分析样品模块包括对样品进行处理和检测分析，以得到胞内代谢物同位素丰度数据及交换反应速率。

进一步，采用LC-MS/MS法测定胞内代谢物同位素丰度。

进一步，所述同位素标记底物为¹³C标记底物。例如，采用¹³C标记的葡萄糖。

进一步，每一次取样所消耗的时间不超过1s。

进一步，取样后，对取出的样品进行淬灭，过滤获得菌体，加入到预热的75％乙醇溶液中，于95℃水浴反应，提取胞内代谢物，冷却至常温，抽滤得到含有胞内代谢物的滤液，浓缩，去除乙醇，定容，得到胞内代谢物样品。

进一步，取样后，对取出的样品放入-40℃冷甲醇内进行淬灭，过滤，获得菌体，加入到预热至70-75℃的75％乙醇溶液中，于95℃水浴反应3min，后迅速冷却至常温，抽滤，得到含有胞内代谢物的滤液；在30℃、真空度为100的条件下浓缩，去除乙醇，加入超纯水定容，得到胞内代谢物样品。

进一步，所述浓缩为：使用旋转蒸发仪，在30℃、真空度为100的条件下浓缩滤液，去除乙醇，防止干扰后续分析样品。

进一步，所述胞内代谢物样品置于-80℃储存。

进一步，所述恒化培养模块中，摄氧率(OUR)和CO₂释放速率(CER)都趋于一个常数时达到代谢稳态。

进一步，所述胞内代谢物样品在进样前进行预处理，包括如下步骤：取胞内代谢物样品，调节至室温，吸取15μL，于0.22μm快速过滤，去除气泡，得到预处理后样品，以用于进样、分析。

进一步，在所述处理与分析样品模块中，采用LC-MS/MS法对所述预处理后样品进行胞内代谢物同位素丰度的检测分析，以获得所述胞内代谢物同位素丰度的数据；其中，检测采用的流动相包括流动相A和流动相B，流动相A为含有5mmol/L乙酸二丁基铵(DBAA)的5％乙腈，流动相B为含有5mmol/L乙酸二丁基铵(DBAA)的84％乙腈。

进一步，所述预处理后样品在LC-MS/MS检测中的进样条件为：

0-20分钟：只通入流动相A；

20-22分钟：通入80％的流动相A和20％的流动相B；

22-32分钟：只通入流动相B，直至检测结束。

进一步，所述流动相的流速为0.2mL/min；每个样品的进样量为2μL。

进一步，在所述方法中，采用HPLC法测定测定胞外副产物，以得到胞外代谢物的浓度，用于计算交换反应的速率；其中，流动相为3M H₂SO₄，流速为0.4L/min。

本发明中，运用三通和止水夹来调控向反应器中添加不同补料(营养液)。例如，使用一个耐高温的三通用于连接反应器及装有补料的容器，三通的第一端连接至反应器内，三通的第二端连接不含所述同位素标记底物的容器内，三通的第三端连接含有所述同位素标记底物的容器内。

本发明中，使用LC/MS-MS仪器分析样品，获得胞内代谢物同位素丰度数据。

本发明中，测量胞外代谢物的浓度，用于计算交换反应的速率。采用HPLC用于测定胞外副产物，使用的是Agilent Technologies Hi-Plex H柱子(300*7.7mm)，配有保护柱(50*7.7mm)，流动相为3M H₂SO₄，流速为0.4L/min。

本发明中，葡萄糖试剂盒的方法测量葡萄糖浓度。

本发明中，同位素标记实验开始之后，需对生物反应器进行连续快速的取样，取一次样品所消耗的时间在1s左右。样品要及时淬灭，保证微生物胞内不再发生反应。

本发明中，流加营养液进行恒化培养达到五个洗脱体积以上时达到代谢稳态。

本发明中，采用一个快速取样装置连接反应器的取样口进行取样，该装置具有操作简单的特点。

本发明中，所采用的原料均为市售产品。

本发明中，所述方法中的步骤，除另有规定外，可以采用常规方法步骤。

本发明的有益效果在于：

本发明在培养微生物达到代谢稳定的生理状态下，采用同位素标记的实验方法，通过快速取样装置在短时间内获得一系列发酵液样品，进而处理、分析样品得到精确的胞内代谢物同位素丰度数据及交换反应速率。利用本发明获得数据应用于代谢通量的计算中，能够准确地计算出代谢通量。

所述批培养模块用于培养微生物；所述恒化培养模块用于培养微生物达到代谢稳态及进行同位素标记实验；所述取样模块用于从生物反应器中取出发酵液样品；所述处理与分析样品模块用于获得胞内代谢物的同位素丰度及交换反应速率数据。经该方法获得的实验数据，可用于计算胞内代谢通量。本实验方法具有操作简单、节约成本及稳定性良好等优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例2中的相关性数据表格图。

图2为本发明中计算代谢通量的步骤示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法，包括批培养模块、恒化培养模块、取样模块、处理与分析样品模块；其中，

当所述批培养模块中的摄氧率(OUR)和CO₂释放速率(CER)同时出现下降时转入所述恒化培养模块；

所述恒化培养模块中具体包括：流加不含同位素标记底物的营养液，同时开启排废，进行恒化培养，直至使微生物细胞处于代谢稳态时，切换成流加含同位素标记底物的营养液，保持培养条件不变；

当所述同位素标记底物流入反应器内时开始快速、连续取样，此时进入所述取样模块；

所述处理与分析样品模块为：对样品进行处理和检测分析，得到胞内代谢物同位素丰度数据及交换反应速率。

本实施例中，所述同位素标记底物为¹³C标记底物。每一次取样所消耗的时间不超过1s。

本实施例中，取样后，对取出的样品进行淬灭，过滤获得菌体，加入到预热的75％乙醇溶液中，于95℃水浴反应，提取胞内代谢物，冷却至常温，抽滤得到含有胞内代谢物的滤液，浓缩，去除乙醇，定容，得到胞内代谢物样品。

所述恒化培养模块中，摄氧率(OUR)和CO₂释放速率(CER)都趋于一个常数时达到代谢稳态。

实施例2

本实施例提供了一种用于代谢稳态同位素非稳态下获取胞内中心碳代谢途径代谢通量的方法，包括批培养模块、恒化培养模块、取样模块、处理与分析样品模块。

所述的方法的具体步骤如下：

在1L生物反应器内培养微生物(酿酒酵母CEN.PK113-7D菌株)，进行批培养，当批培养结束时，即摄氧率(OUR)和CO₂释放速率(CER)同时出现下降时，向反应器流加不带同位素标记底物的营养液，同时开启排废，进行恒化培养；

当恒化培养达到五个洗脱体积以上，反应器内的微生物处于代谢稳态(OUR、CER都趋于一个常数)，向反应器补入带同位素标记底物的营养液；

当带有同位素标记的底物流入反应器内时，开始快速取样；使用快速取样装置控制取样，罐压作为取样的推动力，完成快速、连续取样；

将取样的发酵液(体积约为1mL)从发酵罐内迅速取出后，放入到已经提前称重的含20mL冷甲醇(-40℃)的离心管内进行淬灭，迅速漩涡震荡、充分混匀；将含已淬灭发酵液的离心管迅速称重；之后经配有纤维素滤膜(尺寸为47mm；孔径为0.8μm)的抽滤装置进行快速抽滤，10mL的冷甲醇(-40℃)用于润洗离心管；此时，滤膜上为经淬灭后的菌体，之后，将带菌体的滤膜迅速转移到含20mL预热的(75℃)乙醇溶液(75％v/v)的离心管中；

将含有滤膜的离心管拧紧，(溶解)充分混匀后，转移到95℃的水浴锅内反应3min，进行胞内代谢物的抽提；反应结束后，将离心管迅速转移到冰盒，冷却至常温，经抽滤装置将滤膜移除，得到含有胞内代谢物的滤液；然后，把装有滤液的离心管放入旋转蒸发仪，实现乙醇-水混合液的迅速蒸发，完成胞内代谢物提取液的浓缩；最后，得到小于600μL的浓缩液，加入超纯水到离心管中定容至600μL，充分混匀溶解后，将溶液转移至1.5mL EP管内，该样品在后文中称为胞内代谢物样品；

进样检测前，先对胞内代谢物样品进行预处理：将胞内代谢物样品从-80℃的冰箱取出，待升至室温、彻底融化后，用注射器吸取15μL，经0.22μm水系尼龙滤头快速过滤至干净的液相小瓶，盖好盖子，甩动液相小瓶几次，确保小瓶内没有气泡，即可得到含有预处理后样品的液相小瓶；

将含有预处理后样品的液相小瓶用于进样、分析：采用LC-MS/MS仪器来测定胞内代谢物同位素丰度，在该检测系统中，流动相分成两个部分，分别是含有5mmol/L DBAA(乙酸二丁基铵)5％的乙腈及含有5mmol/L DBAA 84％的乙腈，流动相的流速为0.2mL/min。检测物质时，前期0-20分钟只通过含有5mmol/L DBAA 5％的乙腈，之后再通入20％含有5mmol/L DBAA 84％的乙腈，持续2分钟；接着再次通入100％含有5mmol/L DBAA 5％的乙腈10分钟，直至检测结束。每个样品的进样量为2μL。

本实施例中，1L生物反应器的顶端有一个取样口，用于从反应器内吸取发酵液。采用一个快速取样装置连接反应器的取样口进行取样，具有操作简单的特点。

本实施例中，实验结果如下表所示，表中所呈现的代谢通量都是相对值。通过实验获得胞内代谢物同位素丰度数据，计算得到酿酒酵母在三个不同稀释速率下的胞内代谢通量，见表1所示。

表1

本实施例中，通过本发明的代谢稳态同位素非稳态下获取胞内代谢通量的实验方法，可以获得胞内中心碳代谢的代谢通量(实验结果见表1所示)。对此，将该方法获得的实验结果与已发表的文献值进行对比，对比结果如图1所示。

图1中，B表示通过本发明的方法获得的代谢通量，C表示文献值，两者进行相关性分析(Pearson相关性，Spearman)，p值分别为6.51×10^-4、3.63×10^-7，远远小于0.05，表明B与C是显著相关，说明本发明的方法获得的代谢通量与文献所报道的值非常接近，进一步证明了本发明的方法在获取代谢通量方面具有相当高的准确性与科学性。

本发明中，通过利用所述方法可以获得胞内代谢物同位素丰度数据及交换反应速率，并将获得数据应用于代谢通量的计算中，且计算出的代谢通量具有相当高的准确性。

在计算代谢通量的开源程序中，(如图2所示)其步骤如下：通过代谢网络模型与矩阵等式(AX＝B)，可以获得一系列反应通量估计值；将通量的估计值代入到计算各代谢物同位素丰度的程序中，进而可得一系列代谢物同位素丰度的模拟值；经过同位素标记实验，可以获得同位素丰度随时间变化的实验值，将丰度的模拟值与实验值进行对比、拟合，利用非线性优化算法对代谢流量进行寻优，使得丰度模拟值与实验值之间的残差平方和最小，从而找到拟合效果最佳的一组，则就认为该组的通量值为代谢流的最优解。通过以上三步，结合实验测量值，可以求解代谢模型中每个反应的代谢通量。

综上所述，本发明的实验方法操作简单、准确性高，并且还可以降低实验成本。通过不同的三通连接方式及快速取样装置的应用，大大地提高了实验效率，简化实验操作；同时，优化了处理样品的实验方法，保证了实验结果的准确性。为后续研究代谢流领域提供了一种简单有效的实验方法。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。