阅读说明：本技术 一种核酸检测设备及其使用方法 (Nucleic acid detection equipment and use method thereof ) 是由 陈诗浩 杨竹根 曾晨光 杨习锋 于 2020-05-25 设计创作，主要内容包括：发明解决了目前核酸检测设备不能便携或者集成度不高,检测流程复杂、耗时长、检测人员要求高的问题,提供了一种简单便携、快速、低成本进行有效检测的设备以及该设备的使用方法,一种核酸检测设备,其特征在于,包括：第一保护层；加样层,由加样区以及与所述加样区相连的通道构成；反应层,包括独立的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区；第二保护层,为疏水的透明薄膜；所述的第一保护层、加样层、反应层、第二保护层按照顺序集成在一起,所述的加样区位于所述的加样孔的下部,所述的通道末端分别与所述的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区相连；一种核酸检测设备的使用方法,具体使用步骤如下：制备样品溶液；加样；观测。(The invention solves the problems that the existing nucleic acid detection equipment cannot be portable or has low integration level, complex detection process, long time consumption and high requirement on detection personnel, provides simple, portable, rapid and low-cost equipment for effective detection and a using method of the equipment, and is characterized by comprising the following steps: a first protective layer; the sample adding layer consists of a sample adding area and a channel connected with the sample adding area; the reaction layer comprises a sample detection area, a negative control area and a positive control area which are independent; the second protective layer is a hydrophobic transparent film; the first protective layer, the sample adding layer, the reaction layer and the second protective layer are integrated together in sequence, the sample adding region is positioned at the lower part of the sample adding hole, and the tail end of the channel is respectively connected with the sample detection region, the negative control region and the positive control region; a method for using nucleic acid detection equipment comprises the following specific steps: preparing a sample solution; sample adding; and (6) observing.)

一种核酸检测设备及其使用方法

技术领域

本发明涉及即时检测技术领域，具体涉及一种核酸检测设备及其使用方法。

背景技术

流行性疾病尤其是病毒性流行性疾病如人类免疫缺陷病毒（HIV），寨卡病毒（ZIKV），甲型流行性感冒（H1N1），新型冠状病毒（SARS-CoV-2）等正在世界范围内威胁着人类的健康。针对流行性疾病最有效的防治措施则是早检测，早诊断。

目前临床用于流行性疾病的病原体检测主要是基于核酸扩增的基因诊断技术，如聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增 (LAMP)、重组酶聚合酶 扩增技术(RPA)等。这些技术的主要实施流程主要包括从样品中提取核酸，纯化核酸，扩增核酸，检测信号，这往往需要特定的实验室，熟练的实验人员以及昂贵的实验仪器，且通常也很费时。为了在更大范围内对病原体进行检测，尤其是资源匮乏的地区或人流量较大的区域，发明人认为，为了对流行性疾病进行更有效的防治，我们需要建立成本更低，操作更简洁的检测设备/方法。

微流控芯片技术作为新兴的技术，目前已逐渐向集成化的方向发展，将其应用于核酸检测技术中，会带来重要的革新。其中，纸基微流体芯片加工简单，成本低廉、轻便易携、可生物降解，其多孔结构可进行自发地毛细孔虹吸作用无需额外流体驱动力，可以作为良好的核算检测平台，目前已有多种不同设计的纸基芯片应用于核酸检测中。但是，暂时还没有高度集成一体化的装置，通常需要核酸提前进行提取纯化，需要提前混合扩增试剂或者后续添加反应试剂，扩增反应与信号检测分离，这些缺陷均会限制其使用环境，且对使用人员能力要求较高。发明人基于对微流控技术的研究经验与学术基础，建立了一种具有高度的集成化，轻便、简单的核酸检测设备，其可以实现更快速、更方便的核酸检测。

发明内容

本发明解决了目前核酸检测设备不能便携或者集成度不高，检测流程复杂、耗时长、检测人员要求高的问题，提供了一种简单便携、快速、低成本进行有效检测的设备以及该设备的使用方法。

根据本发明的第一个方面，提供了一种核酸检测设备，其特征在于，包括：

第一保护层，为疏水的透明薄膜，所述薄膜中间开有一个加样孔；

加样层，由加样区以及与所述加样区相连的通道构成，所述的通道数量至少为三条；

反应层，包括独立的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区，所述的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区的数量至少有一个，所述的样品检测区固着有LAMP扩增反应试剂、目标核酸的引物、检测试剂的冻干粉，所述的阴性对照区与所述样品检测区的区别是不含有目标核酸的引物，所述的阳性对照区与所述样品检测区的区别是增加有目标核酸的阳性对照物；

第二保护层，为疏水的透明薄膜；

所述的第一保护层、加样层、反应层、第二保护层按照顺序集成在一起，所述的加样区位于所述的加样孔的下部，所述的通道末端分别与所述的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区相连。

进一步的，所述的加样层、反应层材料为多孔纤维材料，纤维孔径0.2-30μm，所述的多孔纤维材料包括亲水性的滤纸，或者是由以下一种或多种组成的滤膜：醋酸纤维素、硝酸纤维素、混合纤维素。

进一步的，所述的LAMP扩增反应试剂包括：DNA扩增酶，RNA逆转录酶、dNTPs，MgSO4，Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, Triton X-100, MnCl2， 所述的检测试剂包括：荧光探针、PH敏感型指示剂、钙黄绿素。

进一步的，所述的疏水透明薄膜包括：PDMS、PCL、PP、PET。

进一步的，所述的通道的宽度为1-8mm，所述的第一保护层、第二保护层的尺寸为10-60mm。

进一步的，所述的加样孔上覆盖有透明胶。

进一步的，所述的加样层结构以及所述的反应层独立的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区的加工方法包括：剪裁。

基于本发明第一方面的核酸检测设备，提出本发明的第二个方向，提供一种核酸检测设备的使用方法，其特征在于，具体使用步骤如下：

（1）制备样品溶液：

将待检样品浸泡/混合于无酶水、生理盐水、细胞裂解液中形成样品溶液；

（2）加样：

将样品溶液通过加样孔加入到加样区，待液滴被全部吸收后，将设备置

于65℃的加热装置中进行恒温加热；

（1）观测：

每10 min对检测层进行观察比对，直至获得比对结果。

进一步的，所述的待检样品包括：拭子样品、血液样品、尿液样品，所述的细胞裂解液包括：Triton，尿素，SDS，甲酰胺。

本发明的有益效果如下：

（1）该发明是基于纸基的装置，可实现快速高通量检测；

（2）设备结构简单，加工中无需热蜡打印，紫外光刻等纸基微流体设备传统加工方法，加工简单易行；

（3）设备为高度集成装置，只需要一次加样/试剂即可进行直接检测；

（4）设备无需其他核酸提取纯化装置，只需配套生理盐水或细胞裂解液即可，无需过多配液等操作，无需严格的实验室环境和极为熟练的操作人员，且免除了繁琐费时的提取过程；

（5）所有反应试剂和检测试剂均集成于设备上，检测时不需要配置试剂，可避免试剂污染。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 提供的附图获得其他的附图

图1为本发明实施例2的核酸检测设备的示意图；

图2为本发明实施例2的核酸检测设备的组装示意图。

具体符号说明：

1-第一保护层；2-加样层；3-反应层；4-第二保护层。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获的的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1：

核酸检测设备，包括第一保护层和第二保护层，两者均用疏水的透明薄膜材料制成，第一保护层的中间开有一个加样孔，集成时是第一保护层和第二保护层固定在一起，由此可以固定位于其中间的夹层。

中间有两层夹层，为特定的形状，分别是加样层和反应层。加样层是由一个加样区以及与加样区相连的通道构成的，通道的数量至少有三条，反应层是由至少三个的独立区构成的，其中至少有一个样品检测区、至少一个阴性对照区以及至少一个阳性对照区，反应层的每个独立区都与加样层的通道的另一端相连；样品检测区含有LAMP扩增反应试剂、目标核酸的引物、检测试剂的冻干粉，与样品检测区相比，阴性对照区不设有目标核酸的引物，而阳性对照区增加了目标核酸的阳性对照物。组装时，加样层的加样区位于第一保护层加样孔的下面，加样层的通道末端连接反应层的各个独立区块，加样层和反应层的固定是通过第一保护层和第二保护层达成的。

另外，加样层和反应层的材料是多孔纤维的亲水材料，纤维孔径是0.2-30μm。

通过多孔纤维亲水材料和保护层疏水材料的使用，构建了一条样品流动的渠道，其经过加样孔进入加样区，通过与之相连的通道流入反应层的样品检测区、阴性对照区、阳性对照区，各区域固定的检测试剂有所区别，通过对比各个区域的结果即可确定样品的阴性/阳性，样品流动的驱动力来自于多孔纤维本身的毛细虹吸作用，此外，核酸检测过程中也不需要再设计纯化步骤，其原因还是多孔纤维材料的使用，在溶液样品流动的整个过程中，样品溶液中尺寸较大的杂质如细胞碎片等会被纤维吸附过滤，从而达到核酸纯化的效果。

多孔纤维材料作为亲水的材料，经过图案设计跟加工做成亲水区和疏水区，疏水区作为屏障，避免液体溶液流动到亲水区以外的区域，通过将三层多孔纤维材料处理成特定的图案进行叠加组合，构建一条液体样品流动的渠道，即可实现样品通过加样区、转样区、通道分别流入样品检测孔和阴性对照孔，检测孔跟对照孔均含有扩增试剂和指示剂，不同的是检测孔含有引物，最后通过对比样品检测孔和隐形对照孔的检测结果即可确定阴性/阳性。

据本领域技术人员的知识和经验，凡是能够达到上述效果的多孔纤维均能得到检测结果；只要能够在多孔纤维材料上制造出疏水区的材料均可选择。多孔材料可以选择亲水性的滤纸、醋酸纤维素滤膜、硝酸纤维素滤膜、混合纤维素滤膜；疏水区的材料可以选择石蜡、聚羟基丁酸脂。至于扩增反应试剂和指示剂的选择可以根据具体的病毒核酸特性结合文献以及经验选择合适的。

实施例2：

使用核酸检测设备检测zikv病毒。

（1）核酸检测设备的制作与组装

如附图1所示，设备分为四层，第一层为第一保护层1，第四层为第二保护层2，第一保护层的正中心有直径6mm的加样孔，加样孔上覆盖有透明胶；第二层为加样层2、第三层为反应层3，加样层2和反应层3是用醋酸纤维素的滤膜裁剪而成的，其中，醋酸纤维素滤膜的孔径是15μm，具体的裁剪要求是，加样层2的加样区的尺寸与反应层3三个独立区块的直径为5mm，加样层2加样区的外面裁剪有三条长度为30mm、宽度3mm的通道，组装时反应层3的区块位于加样层2通道的末端，进一步通过第一保护层1和第二保护层2进行固定。

反应层的三个区块分别为样品检测区、阴性对照区、阳性对照区，其分别通过冻干法固定不同的反应试剂，具体成份如下：

样品检测区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉，引物混合物

阴性对照区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉

阳性对照区：2X比色RT-LAMP预混液冻干粉，引物混合物，病毒标准品。

其中引物混合物包括：

F3（正向外引物）：5'-CGGATGGGATAGGCTCAAAAAA-3'

B3（反向外引物）：5'-ATGGACCTCCCGTCCTTG-3'，

FIP（正向内引物）：

5'- CCTGAGGGCATGTGCAAACCTAGAATGGCAGTCAGTGGAGAT-3'

BIP（反向内引物）：

5'-ACCCTCAACTGGATGGGACAACTGGAGCTTGTTGAAGTGGTG-3

LoopF（正向环引物）：5'-CATCAATTGGCTTCACAACGC-3

LoopB（反向环引物）环引物：5'- GGGAAGAAGTTCCGTTTTGCTC-3'。

（2）使用核酸检测设备进行检测的方法

S1：待检测样品为zika RNA标样与血液样品混合制得样品溶液；

S2: 揭开加样孔表面的透明胶，将样品溶液滴加至加样区，待溶液被完全吸收以后，重新粘贴好透明胶；

S3：15分钟以后，将设备至于加热板上，加热板温度设置为68 ℃，加热30分钟后观察反应区的颜色变化。

（3）实验结果

样品检测区为黄色，阴性对照区为红色，阳性对照区为黄色，说明样品为阳性。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。