一类5-芳基烟酰胺类lsd1/hdac双靶点抑制剂、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一类5-芳基烟酰胺类lsd1/hdac双靶点抑制剂、其制备方法及应用 (5-aryl nicotinamide LSD1/HDAC double-target inhibitor, preparation method and application thereof ) 是由 关圆圆 于童 胡姱 赵媛 段迎超 张少杰 靳林峰 于 2021-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一类5-芳基烟酰胺类LSD1/HDAC双靶点抑制剂、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用,属于药物化学技术领域。所述的化合物具有如下通式：其中,R-(1)优选OH、CH-(3)和H；R-(2)优选OH、OCH-(3)、F、CN、H和CH-(3)。其对LSD1和HDAC1均具有较强的抑制活性,大多数化合物对HDAC1的IC-(50)小于10 nM,优于阳性药物SAHA。多个化合物对人结肠癌HCT-116细胞株、人胃癌MGC-803细胞株和人白血病THP-1、MOLT-4和MV4:11细胞株的体外抗肿瘤活性IC-(50)小于1.0μM,其中化合物I-4对THP-1的体外抗肿瘤活性是SAHA的6倍。该类化合物为LSD1/HDAC双靶点抑制剂类药物的研发提供了基础。(The invention relates to a 5-aryl nicotinamide LSD1/HDAC double-target inhibitor, a preparation method thereof and application thereof in preparing antitumor drugs, belonging to the technical field of pharmaceutical chemistry. The compounds have the following general formula: wherein R is 1 OH and CH are preferred 3 And H; r 2 OH and OCH are preferred 3 F, CN, H and CH 3 . It has strong inhibitory activity to LSD1 and HDAC1, and most compounds have IC to HDAC1 50 Less than 10nM, better than the SAHA positive drug. Multiple compounds to the human colonIn vitro antitumor activity IC of cancer HCT-116 cell line, human gastric cancer MGC-803 cell line and human leukemia THP-1, MOLT-4 and MV4:11 cell line 50 Less than 1.0 μ M, wherein Compound I-4 has 6-fold greater in vitro anti-tumor activity against THP-1 than SAHA. The compounds provide a foundation for the research and development of LSD1/HDAC double-target inhibitor medicines.)
技术领域
本发明具体涉及一类5-芳基烟酰胺类LSD1/HDAC双靶点抑制剂、其制备方法及在制备抗肿瘤药物中的应用，属于药物化学技术领域。
背景技术
组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)是第一个被发现的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。LSD1由Tower结构域、C端的FAD(Flavin adenine dinulcleotide,FAD)依赖的胺氧化酶结构域以及N端SWIRM结构域共同组成。LSD1以FAD为辅酶，特异性的去除组蛋白H3K4(组蛋白3赖氨酸4)和 H3K9(组蛋白3赖氨酸9)上的单、双甲基化标记。此外，LSD1还能去除非组蛋白如p53、DNMT1、STAT3、E2F1、MYPT1、ERa和HIF-1的甲基化修饰，进一步调节其下游基因的稳定性和活性。大量的研究表明，LSD1在淋巴瘤、急性髓系白血病、前列腺癌、肺癌、胃癌、雌激素受体阴性乳腺癌、口腔癌、结肠癌、滑膜肉瘤和神经母细胞瘤等多种肿瘤中的表达量显著升高，并且和肺癌、急性髓系白血病、结肠癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤的不良预后密切相关。通过 RNA干扰技术下调LSD1的表达量或用小分子抑制剂抑制LSD1的活性，可以使表观沉默的肿瘤抑制基因重新表达，抑制癌细胞的增殖、转移和侵袭，是目前抗肿瘤药物研发的热点靶蛋白之一，目前已有多个LSD1小分子抑制剂处于I 期、II期临床试验，用于治疗急性髓系白血病和非小细胞肺癌。
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)是一类负责从组蛋白尾部去除乙酰基的表观遗传调控蛋白。HDAC在真核生物中调控多种细胞过程，包括细胞凋亡、细胞周期、生长和分化。目前大量的研究证实，HDAC的异常表达与多种癌症的发生、发展密切相关。在白血病、淋巴癌、宫颈癌、结直肠癌，乳腺癌等多种恶性肿瘤中，HDAC家族成员的表达与活性都有明显上调，并且白血病、淋巴癌、宫颈癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的不良预后与HDAC的高表达呈正相关。在过去的二十年里，HDAC一直是癌症治疗的热点靶蛋白之一。目前已经有5种 HDAC抑制剂被FDA和CFDA批准上市治疗恶性淋巴瘤、骨髓瘤等多种肿瘤，包括：美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的伏立诺他(Vorinostat)、罗米地辛(Romidepsin)、帕比司他(Panobinostat)、贝利司他(Belinostat)和中国食品药品监督管理局(CFDA)批准上市的西达本胺(Chidamide)。此外，还有多个HDAC抑制剂候选药物正在进行临床试验。
LSD1和HDAC抑制剂均可以使肿瘤细胞内某些被外源沉默了的基因得以重新表达，诱发细胞凋亡，LSD1和HDAC之间存在着密切的串话关联关系。 LSD1通过其Tower结构域与组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC5等相互作用，构成NuRD、CoREST、Sin3A等共抑制复合体的一部分，并相互依赖地发挥去甲基酶和去乙酰酶活性，参与调控多种基因的转录。例如，LSD1与 Sin3A/HDAC复合物可以协同抑制一系列促凋亡基因，维持乳腺癌对化疗的敏感性。在人乳腺癌细胞中，HDAC5可以通过上调USP28的表达促进LSD1的稳定性与去甲基化活性。在膀胱癌、乳腺癌、肺癌等多种癌症中，降低LSD1 的表达量或者抑制LSD1的活性，可以显著增强癌细胞对HDACs抑制剂的敏感性。用小分子抑制剂同时抑制LSD1和HDAC的活性具有协同的抗肿瘤效应。因此，发现新型、高活性的LSD1/HDAC双靶点抑制剂，通过双重抑制LSD1 和HDAC的活性，发挥“1+1>2”的协同抗肿瘤作用，有望发现新型高效的抗肿瘤先导化合物，为癌症的治疗提供一种新的策略。为了发现新型的 LSD1/HDAC双靶点抑制剂，探索合成一类5-芳基烟酰胺类化合物，验证其 LSD1、HDAC双重抑制活性和体外抗肿瘤活性为本申请的出发点，目前尚未见有该类化合物的合成、LSD1/HDAC抑制活性及抗肿瘤活性的报道。
发明内容
由上述可知，本发明的一个目的在于提供一类5-芳基烟酰胺类化合物，为新药物筛选提供可能。
本发明的另一个目的在于提供此类5-芳基烟酰胺类化合物的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供所述5-芳基烟酰胺类化合物以LSD1/HDAC 为靶点在制备抗肿瘤药物中的应用。
为实现上述目的，本发明所涉及的5-芳基烟酰胺类化合物的结构通式为：
通式I中，R1为OH、CH3、F、H中的任意一个；R2为OH、OCH3、F、CN、H、CH3中的任意一个。
优选：通式I中，R1、R2所代表的取代基如下表所示：
为实现上述第二个目的，本发明化合物的合成反应流程如下所示：
通式I化合物的合成路线：
化合物3的制备方法：化合物1和4-氨甲基苯甲酸甲酯盐酸盐(化合物2) 在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐 (HBTU)和碱性化合物存在下，室温搅拌反应，反应结束后，反应体系加入水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物经硅胶柱柱层析分离纯化，得化合物3。其中，所述碱性化合物选自叔丁醇钾、N,N-二异丙基乙胺、三乙胺中的一种；
化合物4的制备方法：化合物3和各种取代苯硼酸，在甲苯中，碱性化合物和钯催化剂存在下，加热搅拌反应，反应结束后，反应体系加入水和乙酸乙酯萃取，合并有机相，分别用水、饱和NaCl水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩，浓缩物经硅胶柱柱层析分离，得化合物4。其中，所述碱性化合物选自碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸铯、磷酸钾中的一种，所述的钯催化剂选自四(三苯基膦)钯、醋酸钯、双(二亚苄基丙酮)钯、二氯化钯中的一种；
化合物I的制备方法：在二氯甲烷溶液中，化合物4和NH2OK/NH2OH的甲醇溶液反应，反应结束后，反应体系减压浓缩，浓缩物用水溶解，用稀盐酸调pH为5-6，抽滤，收集固体，干燥，用甲醇重结晶得化合物I。
本发明优点：本发明合成的5-芳基烟酰胺类化合物均具有较强的 LSD1/HDAC双重抑制活性和体外抗肿瘤活性，且对LSD1具有很好的选择性。多个化合物对HDAC1的抑制活性小于10nM，优于对照药物SAHA。多个化合物对人结肠癌HCT-116细胞株、人胃癌MGC-803细胞株和人白血病THP-1、 MOLT-4和MV4:11细胞株的体外抗肿瘤活性IC50小于1.0μM，特别是化合物 I-4对THP-1的体外抗肿瘤活性是SAHA的6倍。本发明化合物代表着一类具有全新结构的LSD1/HDAC双靶点抑制剂，为LSD1/HDAC双靶点抑制剂类药物的研发提供了基础，为LSD1、HDAC的生物学功能研究提供了有效工具，可作为进一步候选或者先导化合物用于开发抗肿瘤、抗病毒、抗艾滋病等疾病治疗药物，且合成方法简单，有利于推广应用。
具体实施方式
下面结合反应路线举实施例对本发明技术方案作详细说明。
实施例1 2-((5-烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(3)的合成
在50毫升两口烧瓶中加入化合物1(404.02mg,2.0mmol),化合物2(443.63 mg,2.2mmol),HBTU(834.33mg,2.2mmol),N2保护,用无水DMF(8mL)溶解, 加入N,N-二异丙基乙胺(568.66mg,4.4mmol),加毕,室温下搅拌反应1.5h,然后将反应体系加入水和乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯层,分别用水、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,干燥完毕,过滤,滤液减压浓缩,浓缩物经硅胶柱柱层析分离纯化(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得化合物3(434.4mg),白色固体,产率:62.2％,Mp: 160-161℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.43(t,1H,J＝6.0Hz),9.04(d,1H,J ＝2.0Hz),8.89(d,1H,J＝2.0Hz),8.49(t,1H,J＝2.0Hz),7.95(d,2H,J＝8.0Hz), 7.49(d,2H,J＝8.4Hz),4.59(d,2H,J＝6.0Hz),3.85(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.54,163.99,153.14,147.58,145.08,137.88,131.63,129.77,128.72,127.96,120.58,52.56,43.01.HRMS(ESI)calcd for C15H13BrN2NaO3[M+Na]+: 371.0007,Found:371.0000.
实施例2 4-((5-(2-羟基苯基)烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(4a)的合成
在50mL两口烧瓶中，加入化合物3(500.0mg,1.4mmol)，甲苯(5mL),乙醇(5mL)，H2O(1.3mL)，K2CO3(359.3mg,2.6mmol),Pd(PPh3)4(162.0mg,0.14 mmol)和2-羟基苯硼酸(235.0mg,1.7mmol),氮气保护,92℃搅拌加热反应3小时,反应完毕,冷却至室温,将反应体系用水和乙酸乙酯萃取,合并乙酸乙酯层,分别用水、饱和食盐水洗涤,无水硫酸钠干燥,干燥完毕,抽滤,滤液减压浓缩,浓缩物用硅胶柱柱层析分离纯化(石油醚:乙酸乙酯＝2:1),得化合物4a(279.0mg), 产率:55.0％,白色固体,Mp:205-206℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.89(s, 1H),9.39(t,1H,J＝6.0Hz),8.99(d,1H,J＝2.4Hz),8.91(d,1H,J＝2.0Hz),8.42(t,1H,J＝2.4Hz),7.95(d,2H,J＝8.0Hz),7.50(d,2H,J＝8.4Hz),7.40(dd,1H,J1＝1.6Hz,J2＝7.6Hz),7.26(td,1H,J1＝1.6Hz,J2＝7.6Hz),7.01(d,1H,J＝8.0 Hz),6.95(td,1H,J1＝0.8Hz,J2＝7.2Hz),4.61(d,2H,J＝6.0Hz),3.85(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.57,165.47,155.04,152.39,146.88,145.46, 135.48,134.26,130.89,130.24,129.78,129.49,128.67,127.92,124.05,120.19, 116.57,52.55,42.93.HRMS(ESI)calcdfor C21H17N2O4[M-H]-:361.1194,Found: 361.1194.
实施例3 4-((5-(4-氰基苯基烟酸酰胺))甲基)苯甲酸甲酯(4b)的合成
按照实施例2的方法,用化合物4-氰基苯硼酸(249.8mg,1.7mmol)替换2- 羟基苯硼酸,得目标化合物4b(295.3mg),白色固体,产率:56.8％,Mp:181- 182℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.46(t,1H,J＝6.0Hz),9.14(d,1H,J＝2.0Hz),9.11(d,1H,J＝2.0Hz),8.61(t,1H,J＝2.0Hz),8.06(d,2H,J＝8.4Hz), 8.02(d,2H,J＝8.4Hz),7.95(d,2H,J＝8.4Hz),7.52(d,2H,J＝8.0Hz),4.64(d, 2H,J＝6.0Hz),3.85(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.56,165.08, 150.72,149.06,145.27,141.42,133.89,133.71,133.52,130.09,129.79,128.72, 128.48,127.96,119.13,111.61,52.56,42.96.HRMS(ESI)calcdfor C22H17N3NaO3 [M+Na]+:394.1162,Found:394.1165.
实施例4 4-((5-(对苯甲基)烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(4c)的合成
按照实施例2的方法,用化合物4-甲基苯硼酸(231.1mg,1.7mmol)替换2-羟基苯硼酸,得目标化合物4c(323.9mg),黄色固体,产率:64.2％,Mp:189-190℃. 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.44(t,1H,J＝5.6Hz),9.04(d,1H,J＝2.4Hz), 9.03(d,1H,J＝2.0Hz),8.51(t,1H,J＝2.0Hz),7.95(d,2H,J＝8.4Hz),7.72(d,2H, J＝8.0Hz),7.51(d,2H,J＝8.4Hz),7.35(d,2H,J＝8.0Hz),4.63(d,2H,J＝5.6 Hz),3.85(s,3H),2.37(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ166.56,165.31, 150.13,147.64,145.39,138.55,135.51,133.84,132.87,130.27,130.00,129.79, 128.68,127.94,127.34,52.56,42.93,21.20.HRMS(ESI)calcdfor C22H21N2O3[M+ H]+:361.1547,Found:361.1546.
实施例5 4-((5-(2-氟-4-甲基苯基)烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(4d)的合成
按照实施例2的方法,用化合物2-氟4-甲基苯硼酸(261.7mg,1.7mmol)替换2-羟基苯硼酸,得目标化合物4d(472.6mg),黄色固体,产率:89.2％,Mp:117- 118℃.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(d,1H,J＝2.0Hz),8.85(t,1H,J＝2.0 Hz),8.29(dd,1H,J1＝2.0Hz,J2＝3.6Hz),7.99(d,2H,J＝8.4Hz),7.40(d,2H,J＝ 8.4Hz),7.31(t,1H,J＝8.0Hz),7.07-6.98(m,3H),4.71(d,2H,J＝6.0Hz),3.89(s, 3H),2.39(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.79,165.63,159.61(d,JC-F＝ 249.6Hz),152.14(d,JC-F＝3.9Hz),146.48,143.00,141.44(d,JC-F＝8.2Hz),135.17 (d,JC-F＝3.0Hz),131.91(d,JC-F＝1.5Hz),130.10,130.04(d,JC-F＝3.5Hz),129.57 (d,JC-F＝12.1Hz),127.69,125.66(d,JC-F＝3.2Hz),121.40(d,JC-F＝13.5Hz), 116.90(d,JC-F＝22.1Hz),52.20,43.80,21.19(d,JC-F＝1.4Hz).HRMS(ESI)calcd for C22H20FN2O3[M+H]+:379.1452,Found:379.1453.
实施例6 4-((5-(4-甲氧基苯基)烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(4e)的合成
按照实施例2的方法,用化合物4-甲氧基苯硼酸(258.3mg,1.7mmol)替换 2-羟基苯硼酸,得目标化合物4e(227.1mg),白色固体,产率:43.1％,Mp:203- 204℃.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.43(t,1H,J＝6.0Hz),9.02(d,1H,J＝2.4 Hz),8.99(d,1H,J＝2.0Hz),8.48(t,1H,J＝2.4Hz),7.95(d,2H,J＝8.4Hz),7.77 (d,2H,J＝8.8Hz),7.51(d,2H,J＝8.4Hz),7.10(d,2H,J＝8.8Hz),6.99(d,2H,J＝ 8.4Hz),4.63(d,2H,J＝6.0Hz),3.85(s,3H),3.83(s,3H).13C NMR(101MHz, CDCl3)δ166.78,165.82,160.16,150.40,145.57,143.04,136.40,133.09,130.11, 129.83,129.51,128.88,128.31,127.70,114.70,55.41,52.21,43.80.HRMS(ESI) calcd for C22H21N2O4[M+H]+:377.1496,Found:377.1498.
实施例7 4-((5-(2,4-二甲基苯基)烟酸酰胺)甲基)苯甲酸甲酯(4f)的合成
按照实施例2的方法,用化合物2,4-二甲基苯硼酸(255.0mg,1.7mmol)替换2-羟基苯硼酸,得目标化合物4f(420.4mg),白色固体,产率:80.2％,Mp:113- 114℃.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.95(d,1H,J＝2.0Hz),8.67(d,1H,J＝2.0 Hz),8.10(t,1H,J＝2.0Hz),8.00(d,2H,J＝8.4Hz),7.41(d,2H,J＝8.4Hz),7.12 (s,1H),7.09(d,2H,J＝1.2Hz),6.83(t,1H,J＝5.2Hz),4.72(d,2H,J＝6.0Hz), 3.91(s,3H),2.37(s,3H),2.23(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.76,165.70, 152.73,145.93,142.97,138.46,137.64,135.62,135.30,134.04,132.08,131.51, 130.14,129.78,129.58,129.33,128.60,127.71,126.99,52.21,43.82,21.13,20.27. HRMS(ESI)calcd for C23H23N2O3[M+H]+:375.1703,Found:375.1704.
实施例8N-(4-(羟基氨基甲酰基)苄基)-5-(2-羟基苯基)烟酸酰胺(I-1)的合成
冰浴、搅拌下,将氢氧化钾的无水甲醇溶液(7.0g,45mL甲醇)慢慢滴加入盐酸羟胺的无水甲醇溶液中(5.84g,20mL甲醇),加毕搅拌5min,过滤得 NH2OK-NH2OH溶液,密封保存备用。在50mL两口圆底烧瓶中,加入化合物4a (362.4mg,1.0mmol),用无水二氯甲烷(5mL)溶解,氮气保护,冰浴搅拌下,慢慢滴加上步制备的NH2OK-NH2OH溶液(16.5mL),加毕,室温搅拌1.0小时。将反应体系真空浓缩,浓缩物用蒸馏水(20mL)溶解,用稀HCl调pH 5-6,有固体析出,过滤,收集固体,用甲醇重结晶得化合物I-1(156.9mg),白色固体,产率:43.2％,Mp:211-212℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.23(s,1H),9.97(s,1H),9.42(t,1H, J＝5.6Hz),9.01(s,1H),8.94(s,1H),8.91(d,1H,J＝2.0Hz),8.46(s,1H),7.74(d, 2H,J＝8.0Hz),7.42(m,3H),7.26(t,1H,J＝8.0Hz),7.03(d,1H,J＝8.0Hz),6.95 (t,1H,J＝7.2Hz),4.56(d,2H,J＝5.6Hz).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ 165.27,164.54,155.08,151.88,146.48,143.02,135.88,131.83,130.90,130.31, 127.66,127.45,123.88,120.19,116.61,42.93.HRMS(ESI)calcd for C20H18N3O4[M +H]+:364.1292,Found:364.1291.
实施例9 5-(4-氰基苯基)-N-(4-(羟基氨基甲酰胺)苄基)烟酸酰胺(I-2)的合成
按照实施例8的方法,用4b(371.4mg,1.0mmol)替换4a,得化合物I-2(276.6 mg),白色固体,产率:74.3％,Mp:168-169℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 11.20(s,1H),9.56(t,1H,J＝6.0Hz),9.20(d,1H,J＝2.4Hz),9.14(d,1H,J＝2.0 Hz),8.75(t,1H,J＝2.0Hz),8.09(d,2H,J＝8.4Hz),8.04(d,2H,J＝8.0Hz),7.73 (d,2H,J＝8.4Hz),7.44(d,2H,J＝8.0Hz),4.59(d,2H,J＝6.0Hz).13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ164.43,163.73,147.20,145.77,142.65,140.06,137.45,135.33, 133.57,131.90,131.51,128.80,127.78,127.45,119.02,112.21,43.03.HRMS(ESI) calcd for C21H15N4O3[M-H]-:371.1150,Found:371.1152.
实施例10N-(4-(羟基氨基甲酰胺)苄基)-5-(对苯甲基)烟酸酰胺(I-3)的合成
按照实施例8的方法,用4c(360.4mg,1.0mmol)替换4a,得化合物I-3 (144.5mg),白色固体,产率:40.0％,Mp:214-215℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.25(s,1H),9.42(t,1H,J＝5.6Hz),9.04-9.01(m,3H),8.51(t,1H,J＝2.4Hz), 7.74(d,2H,J＝8.4Hz),7.74(d,2H,J＝8.4Hz),7.44(d,2H,J＝8.0H),7.35(d,2H, J＝7.6Hz),4.58(d,2H,J＝5.6Hz),2.37(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ 165.28,150.15,147.69,142.95,138.53,135.48,133.88,132.80,131.87,130.27, 130.04,127.67,127.45,127.34,42.93,21.21.HRMS(ESI)calcd for C21H20N3O3[M +H]+:362.1499,Found:362.1496.
实施例11 5-(2-氟-4-甲基苯基)-N-(4-(羟基氨基甲酰胺)苄基)烟酸酰胺(I-4)的合成
按照实施例8的方法,用4d(378.4mg,1.0mmol)替换4a,得化合物I-4 (137.3mg),白色固体,产率:36.2％,Mp:212-213℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.21(s,1H),9.39(t,1H,J＝5.6Hz),9.06(d,1H,J＝2.0Hz),9.03(s,1H),8.90(t, 1H,J＝2.0Hz),8.40(t,1H,J＝2.4Hz),7.73(d,2H,J＝8.0Hz),7.58(t,1H,J＝8.4 Hz),7.42(d,2H,J＝8.4Hz),7.24(d,1H,J＝12.0Hz),7.20(d,1H,J＝8.0Hz),4.57 (d,2H,J＝5.6Hz),2.39(s,3H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.04,164.52, 159.49(d,J＝247.5Hz),151.81(d,JC-F＝4.0Hz),147.92,142.91,141.71(d,JC-F＝ 8.4Hz),135.14(d,JC-F＝2.5Hz),131.88,131.07(d,JC-F＝1.3Hz),131.03(d,JC-F＝ 3.4Hz),129.96,127.66,127.46,126.38(d,JC-F＝2.9Hz),121.75(d,JC-F＝13.4Hz), 117.05(d,JC-F＝22.0Hz),42.95,21.08.HRMS(ESI)calcd forC21H19FN3O3[M+ H]+:380.1405,Found:380.1406.
实施例12N-(4-(羟基氨基甲酰胺)苄基)-5-(4-甲氧基苯基)烟酸酰胺(I-5)的合成
按照实施例8的方法,用4e(376.4mg,1.0mmol)替换4a,得化合物I-5 (264.1mg),白色固体,产率:70.0％,Mp:216-217℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ9.79(s,1H),9.43(s,1H),9.01-8.99(m,2H),8.49(s,1H),7.77(d,2H,J＝8.4Hz), 7.72(d,2H,J＝8.0Hz),7.32(d,2H,J＝8.0Hz),7.09(d,2H,J＝8.4Hz),4.54(d,2H, J＝4.4Hz),3.82(s,3H),1.22(s,1H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ165.25, 160.14,149.84,147.28,140.52,135.23,132.48,130.11,129.03,128.73,127.20, 126.73,115.11,55.73,43.02.HRMS(ESI)calcd forC21H18N3O4[M-H]-:376.1303, Found:376.1306.
实施例13 5-(2,4-二甲基苯基)-N-(4-(羟基氨基甲酰胺)苄基)烟酸酰胺(I-6)的合成
按照实施例8的方法,用4f(374.4mg,1.0mmol)替换4a,得化合物I-6 (146.8mg),白色固体,产率:39.1％,Mp:167-168℃.1H NMR(400MHz,DMSO-d6) δ11.21(s,1H),9.36(t,1H,J＝6.0Hz),9.04-9.02(m,2H),8.70(d,1H,J＝2.0Hz), 8.20(t,1H,J＝2.0Hz),7.72(d,2H,J＝8.0Hz),7.41(d,2H,J＝8.0Hz),7.21-7.12 (m,3H),4.55(d,2H,J＝6.0Hz),2.33(s,3H),2.23(s,3H).13C NMR(101MHz, DMSO-d6)δ165.19,164.54,152.21,147.40,142.97,138.12,136.80,135.43,135.40, 134.62,131.86,131.66,130.30,129.59,127.66,127.45,127.34,42.93,21.15,20.42. HRMS(ESI)calcd for C22H22N3O3[M+H]+:376.1658,Found:376.1656.
本发明所合成化合物的LSD1、HDAC1和THP-1抑制活性评价 (一)LSD1、HDAC1抑制活性和体外抗肿瘤活性评价：
1、LSD1抑制活性评价实验方法
样品为实施例所合成的上述化合物、纯化而得；样品储备液：称取3-5mg 样品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度是20mM的溶液，-20℃避光保存，实验时根据所需浓度用DMSO稀释。将待测样品与LSD1蛋白于室温孵育后，加入LSD1反应底物H3K4me2并孵育反应，最后加入荧光染料 Amplex和辣根过氧化酶HRP室温孵育，在酶标仪上激发光530nm，发射光 590nm检测荧光数值。
试验结果采用SPSS软件计算IC50值。
2、HDAC1抑制活性评价实验方法
称取3-5mg样品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度是20mM 的溶液，-20℃避光保存，实验时根据所需浓度用DMSO稀释。制备1X缓冲液(改良Tris缓冲液)。HDAC酶用1X缓冲液稀释至1.67X终浓度。将胰蛋白酶和乙酰肽底物混合制成底物溶液，用1X缓冲液稀释至2.5X终浓度。用Echo550 将250nL待测化合物转移到384孔板上。然后，将15μL的酶液加入384孔板中，与待测化合物在室温下预孵育15min。用15μL 1X缓冲液作为阴性对照。然后将10μL底物溶液加入384孔中以启动反应。用EnVision在激发波长355 nm和发射波长460nm处检测荧光强度。
3、体外抗肿瘤活性测定
样品为实施例所合成的化合物；样品储备液：称取3-5mg样品置于1.5mL EP管中，然后用DMSO配制成浓度为10mmol/L溶液，-20℃避光保存放置，实验时根据所需浓度利用培养基稀释。
取对数生长期的细胞，消化计数后，用培养基调整细胞密度，以4000-5000 个细胞/孔接种至96孔板中，每孔100μL，培养24h后，加入用培养基稀释好的不同浓度的药物(10μM、2.5μM、0.625μM、0.1563μM、0.0391μM、0.0098 μM、0.0024μM、0.006μM)，每个浓度设3个复孔，另设空白对照组及阳性对照组。药物作用72h后，每孔加入40μL CellTiter-GloReagent，振荡混匀2min，室温继续孵育10min后，酶标仪检测荧光强度，计算抑制率，计算公式如下:
抑制率(％)＝(最大荧光强度-给药组荧光强度)/(最大荧光强度-最小荧光强度)×100％。
4、实验结果
表1LSD1、HDAC1和THP-1抑制活性评价结果
aN.D.:未测定。
b30nM浓度时的抑制率为83％。
从上表实验结果可以看出，本发明化合物对LSD1均具有较好的抑制活性， IC50值在微摩尔水平。所合成的目标化合物对HDAC1具有很好的抑制活性，大多数化合物的IC50均小于10nM，优于阳性对照SAHA。体外抗肿瘤活性评价显示多个化合物对THP-1急性白血病细胞具有很好的抑制活性，其中化合物I-4，I- 5和I-6对THP-1的IC50小于2μM，明显优于SAHA，特别是化合物I-4对THP-1的活性是SAHA的6倍。
由于化合物I-4和I-5对THP-1的抑制活性显著优于阳性对照SAHA，我们进一步在两种白血病细胞株(MOLT-4、MV4:11)和两种实体瘤细胞株(人结肠癌 HCT-116、人胃癌MGC-803)上评价了化合物I-4和I-5的体外抗肿瘤活性。
表2化合物I-4和I-5体外抗肿瘤活性评价结果
实验结果表明:化合物I-4对所测试的四种细胞株均具有很好的抑制活性，其中对MOLT-4、MV4:11和MGC-803的IC50值小于1μM，化合物I-5对所测试的四种细胞株的IC50值均小于1μM。本发明的化合物代表着一类结构全新的 LSD1/HDAC双靶点抑制剂，多个化合物具有很好的体外抗肿瘤活性，可作为进一步开发的候选或者先导化合物，应用于制备抗癌药物。为LSD1/HDAC双靶点抑制剂类药物的研发提供了基础，为LSD1和HDAC的生物学功能研究提供了有效工具。