一种dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法
阅读说明：本技术 一种dna亚硫酸氢盐转化及纯化的方法 (Method for converting and purifying DNA bisulfite ) 是由 易吉 解青青 李泽卿 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法,采用热变性法95℃处理DNA样本3-5分钟后,立即冰置以防止复性,再通过变温热循环进行转化,然后采用磁珠法对转化的DNA进行纯化。本发明方法操作简单方便,耗时短,并能够得到高转化率、高质量的DNA,提高了转化后的qPCR及其他分析技术的灵敏度,有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。(The invention discloses a method for converting and purifying DNA bisulfite, which comprises the steps of treating a DNA sample for 3-5 minutes at 95 ℃ by a thermal denaturation method, immediately freezing to prevent renaturation, converting by a temperature-variable thermal cycle, and purifying the converted DNA by a magnetic bead method. The method is simple and convenient to operate, consumes short time, can obtain DNA with high conversion rate and high quality, improves the sensitivity of qPCR and other analysis technologies after conversion, and is favorable for full-automatic and standardized operation of methylation research.)
技术领域
本发明涉及核酸转化纯化领域，尤其涉及一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法。
背景技术
DNA甲基化为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上。DNA甲基化一般发生在CpG位点。经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。人类基因中约80％-90％的CpG位点已被甲基化，但是在某些特定的区域，如富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG岛则未被甲基化。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。对DNA甲基化水平进行深入研究是必然趋势，它将有可能成为医学中治疗某些疾病的常规技术指标。
研究DNA甲基化的方法有很多种，在众多方法中，研究人员常常会使用到的一项技术，就是亚硫酸氢盐转化。DNA在亚硫酸氢盐处理过程中会使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。随后用测序、定量PCR或芯片等分析来比较处理和未处理DNA的序列，就能确定DNA序列中哪些位点发生甲基化。
目前的亚硫酸氢盐转化的基本步骤分为：DNA的高温裂解，亚硫酸氢盐变温转化及脱磺酸基，纯化回收。但是亚硫酸氢盐转化过程常常遇到很多问题：(1)需要长时间的转化和变温过程，且需要氢氧化钠溶液进行脱磺酸基；(2)转化效率低，有时未能彻底转化，有时则会转化过度；(3)回收率不高，会损失大量DNA，有时甚至达到50％；(4)由于亚硫酸氢盐处理条件剧烈，DNA可能会发生严重降解及片段化，从而降低了PCR及后续分析技术的灵敏度。因此，基于目前表观遗传学的快速发展，亚硫酸氢盐转化及纯化方法亟待改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法，对已有方法进行了优化改进，使DNA转化率达到100％，并采用磁珠法对转化的DNA进行纯化，能够得到高转化效率、较高质量及高纯化的DNA，并有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作，用于后续分子生物学研究，尤其临床分子诊断。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法，包括如下步骤：
S1、在离心管中加入20μL-25μL待处理DNA；
S2、95℃孵育3min-5min，取出离心管放置冰上，加入100μL-150μL转化液，颠倒或振荡混匀，短暂离心；
S3、将离心管置于可设置温度变化程序的仪器中，进行变温热循环反应：
S4、向反应产物中加入240μL-350μL(2×)磁珠溶液，室温孵育5min-10min；
S5、将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后，小心移除上清；
S6、将离心管保持在磁力架上，加入500μL-800μL新鲜配制的洗涤液，室温孵育30s-60s，小心移除上清；
S7、加入50μL-60μL TE缓冲液，用移液枪轻轻吹打混匀，再加入5μL-6μL3M氢氧化钠溶液，颠倒或振荡混匀，42℃孵育15min-20min；
S8、加入步骤S7离心管中溶液0.25倍体积的5M醋酸铵溶液，颠倒或振荡混匀，再加入步骤S7离心管中溶液2.5倍体积的磁珠溶液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育10min；
S9、将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后，小心移除上清；
S10、将离心管保持在磁力架上，加入500μL-800μL新鲜配制的洗涤液，室温孵育30s-60s，小心移除上清；
S11、重复步骤S10一次；
S12、将离心管保持在磁力架上，在室温下开盖干燥5min-10min；
S13、将离心管从磁力架上取出，加入52.5μL-62.5μL的ddH2O，用移液枪轻轻吹打混匀，将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后，小心吸取50μL-60μL上清至一个新的离心管中；
步骤S2中所述转化液为含4.32M-4.61M亚硫酸氢钠、0.18M-0.27M氢氧化钠、6.4mM-9.6mM对苯二酚、0.06M-0.17M水溶性维生素C、1.0mM-2.0mM四乙基氯化铵和0.21M-0.42M盐酸胍的水溶液。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述转化液为含4.61M亚硫酸氢钠、0.24M氢氧化钠、6.4mM对苯二酚、84.0mM水溶性维生素C、1.0mM四乙基氯化铵和0.30M盐酸胍的水溶液。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中，所述可设置温度变化程序的仪器为PCR仪。
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤S3中，所述变温热循环反应包括如下步骤：
S3-1、95℃孵育30s；
S3-2、58℃孵育20min；
S3-3、95℃孵育10s；
S3-4、58℃孵育20min；
S3-5、重复步骤S3-3和S3-4，4-6次；
S3-6、4℃保持。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的磁珠溶液为含1mM EDTA、10mMTris-HCl、2.5M氯化钠、19％(v/v)PEG-8000、0.6％(v/v)Tween20、2％(v/v)磁珠的水溶液。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述洗涤液为70％-80％(v/v)乙醇溶液。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述TE缓冲液含10mM Tri-HCl和1mMEDTA，pH7.5-8.5。
本发明的DNA亚硫酸氢盐转化及纯化的方法相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明方法转化过程中所采用的转化液能使DNA转化更有效、完全，转化液中对苯二酚和水溶性维生素C组成保护液，使DNA样本稳定存在于实验反应中；四乙基氯化铵作为催化剂，能够促进DNA变性及转化反应的进行；盐酸胍作为蛋白质变性剂，去除样本中的蛋白质，结合DNA，提高DNA转化后的产量；其中氢氧化钠起到调节溶液pH的作用，使DNA处于最佳的溶液酸碱度中，能够稳定存在；
(2)本发明通过变温作用进行转化使DNA转化更加充分，结合磁珠法提取及纯化DNA，根据检测结果数据得到，本发明方法的回收率、转化率和试剂盒的结果无统计学差异，回收率和转化效率高，转化后的样本可直接进行qPCR或一代测序检测，灵敏度更高；
(3)用试剂盒进行DNA转化及纯化，处理一个样本需要约3.5h，处理一批样本(16个样本)需要花费4.5h；而本发明调整了转化时间和转化后DNA的纯化方法，处理一个样本需要花费3h，处理一批样本(16个样本)仅需3.5h，相比较而言，本发明方法在处理大批量样本时更具有优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明方法和商品化试剂盒方法转化及纯化人基因组DNA后进行甲基化指标检测的实时荧光PCR扩增曲线。
图2为本发明方法和商品化试剂盒方法转化及纯化人基因组DNA后进行未甲基化指标检测的实时荧光PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1、利用不同转化液进行DNA亚硫酸氢盐转化及纯化
1、亚硫酸氢盐转化液的配制
(1)各试剂母液的配制
3M氢氧化钠溶液：3g氢氧化钠颗粒，加ddH2O定容至25mL。
320mM对苯二酚溶液：0.88g对苯二酚，加ddH2O定容至25mL。
100mM四乙基氯化铵溶液：0.42g四乙基氯化铵，加ddH2O定容至25mL。
5M醋酸铵溶液：19.25g醋酸铵，加ddH2O定容至50mL。
(2)转化液的配制(体系10mL)
转化液A：将4.8g亚硫酸氢钠、800μL 3M氢氧化钠溶液、200μL 320mM对苯二酚溶液、0.148g水溶性维生素C、100μL 100mM四乙基氯化铵溶液、0.288g盐酸胍混合，搅拌至完全溶解，加水补足至10mL。
转化液B：将4.5g亚硫酸氢钠、600μL 3M氢氧化钠溶液、300μL 320mM对苯二酚溶液、0.1g水溶性维生素C、150μL 100mM四乙基氯化铵溶液、0.2g盐酸胍混合，搅拌至完全溶解，加水补足至10mL。
转化液C：将4.6g亚硫酸氢钠、900μL 3M氢氧化钠溶液、250μL 320mM对苯二酚溶液、0.3g水溶性维生素C、200μL 100mM四乙基氯化铵溶液、0.4g盐酸胍混合，搅拌至完全溶解，加水补足至10mL。
2、DNA亚硫酸氢盐转化及纯化
本实施例采用的DNA样本为通过商品化人基因组提取试剂盒提取的人基因组DNA。
亚硫酸氢盐转化及纯化的方法具体实施步骤如下：
(1)取3支1.5mL离心管，分别加入25μL的待处理DNA；
(2)95℃孵育5min，立即取出各离心管放置冰上，分别加入150μL配制好的转化液A、B、C，颠倒或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
(3)将各离心管置于PCR仪中，按如下表格设置条件进行热循环反应：
(4)向各反应产物中分别加入350μL(2×)的磁珠溶液，室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
(5)将各离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(6)将各离心管保持在磁力架上，分别加入800μL新鲜配制的70％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育60s，小心移除上清；
(7)直接在漂洗过后的各离心管中分别加入60μL的TE缓冲液，用移液枪轻轻吹打混匀，再分别加入6μL 3M氢氧化钠溶液，颠倒或振荡混匀，42℃孵育15min；
(8)分别加入16.5μL的5M醋酸铵溶液(加入的5M醋酸铵溶液的量是整个溶液体积的0.25倍)，颠倒或振荡混匀，在上述得到的溶液中对应地加入165μL的磁珠溶液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；
(9)将各离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(10)将各离心管保持在磁力架上，分别加入800μL新鲜配制的70％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育60s，小心移除上清；
(11)重复步骤(10)一次；
(12)将各离心管保持在磁力架上，在室温下开盖干燥10min；
(13)将各离心管从磁力架上取出，分别加入62.5μL的ddH2O，用移液枪轻轻吹打混匀，将各离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心吸取60μL上清至一个新的离心管中。
所述的磁珠溶液为含1mM EDTA、10mM Tris-HCl、2.5M氯化钠、19％(v/v)PEG-8000、0.6％(v/v)Tween20、2％(v/v)磁珠的水溶液。
所述的TE缓冲液含10mM Tri-HCl和1mM EDTA，pH7.5-8.5。
将利用上述三种不同转化液(A、B、C)转化处理后的DNA，取1μL进行实时荧光PCR进行甲基化检测。
检测结果：利用上述转化液A、B、C进行人基因组DNA的亚硫酸氢盐转化，使用MSP引物进行实时荧光PCR检测甲基化情况，结果显示，各组Ct值基本相当。利用本实施例的DNA亚硫酸氢盐转化及纯化方法，转化效率和回收率高，且简便、易操作。
实施例2、本发明的方法与ZYMO RESEARCH商品化试剂盒方法的对比
本实施例采用的DNA样本为通过商品化人基因组提取试剂盒提取的人基因组DNA。
1、本发明的亚硫酸氢盐转化及纯化的方法具体实施步骤如下：
(1)在1.5mL离心管中加入20μL的待处理样本；
(2)95℃孵育3min，立即取出离心管放置冰上，加入100μL配制好的转化液A(同实施例1)，颠倒或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
(3)将离心管置于PCR仪中，按如下表格设置条件进行热循环反应：
(4)向反应产物中加入240μL(2×)的磁珠溶液，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；
(5)将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(6)将离心管保持在磁力架上，加入500μL新鲜配制的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；
(7)直接在漂洗过后的离心管中加入50μL的TE缓冲液，用移液枪轻轻吹打混匀，再加入5μL 3M氢氧化钠溶液，颠倒或振荡混匀，42℃孵育20min；
(8)加入13.75μL的5M醋酸铵溶液(加入的5M醋酸铵溶液的量是整个溶液体积的0.25倍)，颠倒或振荡混匀，在上述得到的溶液中对应地加入137.5μL的磁珠溶液，用移液枪轻轻吹打混匀，室温孵育10min，使DNA结合到磁珠上；
(9)将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
(10)将离心管保持在磁力架上，加入500μL新鲜配制的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；
(11)重复步骤(10)一次；
(12)将离心管保持在磁力架上，在室温下开盖干燥5min；
(13)将离心管从磁力架上取出，加入52.5μL的ddH2O，用移液枪轻轻吹打混匀，将离心管保持在磁力架上，待离心管中溶液澄清后(约5min)，小心吸取50μL上清至一个新的离心管中。
转化液A中含4.61M亚硫酸氢钠、0.24M氢氧化钠、6.4mM对苯二酚、84.0mM水溶性维生素C、1.0mM四乙基氯化铵和0.30M盐酸胍。
所述的磁珠溶液为含1mM EDTA、10mM Tris-HCl、2.5M氯化钠、19％(v/v)PEG-8000、0.6％(v/v)Tween20、2％(v/v)磁珠的水溶液。
所述的TE缓冲液含10mM Tri-HCl和1mM EDTA，pH7.5-8.5。
按照上述实验步骤做2组平行试验，将转化后得到的两组DNA分别命名为BS-1、BS-2，各取1μL进行甲基化实时荧光PCR检测(注：检测指标T16953是可与转化后的碱基T连接，检测指标C7302可与未转化的碱基C连接)。
2、ZYMO RESEARCH商品化试剂盒方法
按照ZYMO RESEARCH商品化试剂盒说明书操作步骤，对人基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化。取1μL转化后的DNA进行甲基化实时荧光PCR检测，做2组平行。
检测结果如下表所示：
上表中，甲基化检测指标和未甲基化检测指标是分别使用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物对不同处理DNA模板进行甲基化情况的检测，其中阴性对照的模板为水，阳性对照的模板为未经过转化处理的人基因组DNA。结合图1和图2显示，本发明转化及纯化方法与ZYMO RESEARCH试剂盒检测结果相当，但本发明方法操作更简便，耗时短，所用试剂成本低，处理后DNA转化效率和纯化率高，且检测灵敏度高，有利于甲基化研究的全自动化及标准化操作。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。