阅读说明：本技术 基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统 (Primer composition, reagent, detection method and system for realizing accurate typing of vitamin D receptor Fok1 locus based on probe method ) 是由 周梅华 龚强 余艳 李慧源 葛虎 陈鹏 代冰 于 2020-04-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物为根据维生素D受体基因Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针；基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂、检测方法和系统分别为采用了所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物的试剂、检测方法和系统。本发明提供的所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物解决了现有技术的Fok1位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题。(The invention provides a primer composition, a reagent, a detection method and a system for realizing accurate typing of a vitamin D receptor Fok1 locus based on a probe method. The primer composition for realizing accurate typing of the vitamin D receptor Fok1 site based on the probe method is a primer and a probe designed according to the vitamin D receptor gene Fok1(rs2228570) SNP site polymorphism; the reagent, the detection method and the system for realizing the accurate typing of the vitamin D receptor Fok1 locus based on the probe method are respectively the reagent, the detection method and the system which adopt the primer composition for realizing the accurate typing of the vitamin D receptor Fok1 locus based on the probe method. The primer composition for realizing accurate typing of the vitamin D receptor Fok1 locus based on the probe method solves the technical problems of expensive equipment, aerosol pollution, complicated steps and the like in Fok1 locus polymorphism detection in the prior art.)

基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试 剂、检测方法和系统

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统。

背景技术

维生素D受体基因(vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor,VDR),定位于12q13.11，全长63.5kb，有11个外显子，mRNA 长4,775nt，编码428个氨基酸残基组成的维生素D受体(VDR)蛋白，是维生素D3的核激素受体，该蛋白也是胆石酸的第二受体。VDR 属于转录调控因子，为类固醇激素/甲状腺类激素受体超家族的成员，作为配体诱导性复制因子发挥作用。该蛋白对基因表达的调节主要通过一系列代谢反应通路，包括免疫反应通路和肿瘤激活通路。

多项国内外研究证实，VDR基因与钙等金属离子在体内的吸收代谢，从而与骨折、骨质疏松、维生素D依赖性II型佝偻病等疾病有显著相关性。Fok1(rs2228570)，是维生素D受体唯一已知的可改变蛋白质结构单核苷酸多态性，具有种群差异性。该位点的基因型与人牙龈成纤维细胞和牙周韧带细胞转录激活、冠状动脉疾病、II型糖尿病、儿童牛奶蛋白过敏、结核易感性、云南白族人群特发性低枸橼酸尿症、中国汉族人群高脂血症等有关。Fok1(rs2228570)位于12 号染色体的47879112位置上，主要有TT、CT、CC三个基因型。

目前常用的针对Fok1(rs2228570)多态性检测方法有：

1、基于PCR扩增和单碱基延伸后，用MassARRAY或者一代测序仪进行SNP基因型的分型。存在设备昂贵；PCR扩增和单碱基延伸后，均需要一轮酶切消化，步骤繁琐、人力和试剂耗材的投入大；PCR扩增产物需要开盖处理，极易造成室内气溶胶污染，影响结果的准确性等问题。

2、利用两个正向引物及一个反向引物，PCR扩增后，经凝胶电泳在紫外光下见到根据片段大小区分开的产物条带，根据条带的有无判断目标SNP位点的基因型。存在相同的气溶胶污染的问题；并且在结果判断环节，需要凝胶电泳，而涉及到制胶、点样、跑胶、成像等诸多繁琐的环节，容易出错的同时，人力投入更大；以及结果以图片的形式呈现，判读过程依赖主观因素，容易出错的问题。

发明内容

为解决现有技术的Fok1位点多态性检测存在设备昂贵、气溶胶污染、步骤繁琐等技术问题，本发明提供一种解决上述问题的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物。

一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，包括根据维生素D受体基因Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计的引物和探针，序列如下：

VDR基因Fok1(rs2228570)正向扩增引物：

CTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT；

VDR基因Fok1(rs2228570)反向扩增引物：

GGTCAAAGTCTCCAGGGTCAGG；

VDR基因Fok1(rs2228570)基因型T探针：

5’-CTTACAGGGATGGAG-3’；

VDR基因Fok1(rs2228570)基因型C探针：

5’-CTTACAGGGACGGAG-3’。

所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为 Quencher和MGB。所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。

引物和探针以混合液的形式存在，其比例为：(所述正向扩增引物：所述反向扩增引物：所述基因型T探针：所述基因型C探针：水) ＝(10:10:4:4:192)。

一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂，包括所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，以及进行Q-PCR反应所需的试剂。

一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法，包括以下步骤：

步骤一：提取获得待测样本DNA；

步骤二：将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D受体Fok1 位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。

一种基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的系统，包括：

提取模块，用于提取获得待测样本DNA；

检测模块，用于将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D 受体Fok1位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应。

相较于现有技术，本发明通过采用所述基于探针法实现维D受体 Fok1位点准确分型的引物组合物，根据维生素D受体基因 Fok1(rs2228570)SNP位点多态性设计，上述序列的引物探针组合在有非特异性扩增的情况下，根据AT互换、GC互换的规则，调整引物 GC含量为60±2％，且调整后的引物Tm峰值单一，对引物序列进行改造而成的引物和探针。使检测通过一步Q-PCR即可完成，优点在于：

1.简单高效：一次Q-PCR反应，操作简单，时长2～3小时；2. 可推广性强，所涉及的主设备是实时荧光定量PCR仪，价格相对便宜，大部分机构均可配备；3.结果准确，结果的呈现以数字形式，不受主观判断的影响，客观真实；4.兼容性好，结果可以直接入相应的表格中，进行快速判读，样本处理能力强；5.污染风险小，PCR结束后无需开盖处理，不会产生气溶胶，不会造成假阳性。

由于Quencher是淬灭基团，它和荧光基团同时存在于一条DNA 链上时，荧光基团不能发出荧光。因此正常情况下，设备不能检测到荧光信号。而在进行Q-PCR反应时，探针特异性地结合到SNP位点，反应液中所包含的DNA聚合酶把探针从目的片段上剪切至反应液中，相应探针上的荧光基因也随之与淬灭基团Quencher分离，被设备所捕获，从而检测出目的SNP的具体基因型。

附图说明

图1是采用本发明提供的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测得到的Melt Curve显示图；

图2是采用本发明提供的基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测得到的位点多态性分型效果图；

图3是图2的表格形式图；

图4是采用现有技术进行检测得到的Melt Curve显示图；

图5是采用现有技术进行检测得到的位点多态性分型效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物包括：

VDR基因Fok1(rs2228570)正向扩增引物：

CTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT(对应为序列表中的SEQ No.1)；

VDR基因Fok1(rs2228570)反向扩增引物：

GGTCAAAGTCTCCAGGGTCAGG(对应为序列表中的SEQ No.2)；

VDR基因Fok1(rs2228570)基因型T探针：

5’-CTTACAGGGATGGAG-3’(对应为序列表中的SEQ No.3)；

VDR基因Fok1(rs2228570)基因型C探针：

5’-CTTACAGGGACGGAG-3’(对应为序列表中的SEQ No.4)。

其中，所述基因型T探针5’端的荧光基团为VIC，3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。所述基因型C探针5’端的荧光基团为FAM， 3’端的淬灭基团为Quencher和MGB。

基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的试剂，包括所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物，以及 Q-PCR所需试剂，二者的具体组分在下文检测方法中详述。

基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法，包括以下步骤：

1、DNA提取。采用Crude DNA Extraction Kit(for Blood) (Vazyme)，根据说明书的步骤提取94份DNA(S1～S94)，保存于-20℃备用。

2、准备Q-PCR扩增体系。采用SNP分型反应在试剂ChamQ Geno-SNP Probe MasterMix(Vazyme)，具体如下：

试剂	体积(μL)
		TaqProbe 2X Q-PCR Mastermix	10.0
Primer&Probe Mix	2.0
		nuclease free water	3.0
Template	5.0
		总体积	20

其中，Primer&Probe Mix为所述基于探针法实现维D受体Fok1 位点准确分型的引物组合物。各组分以100pmol/ul的浓度，按 10:10:4:4:192(水)的比例与双蒸水混合而成(如下)。

引物探针	浓度	体积(μL)
			Fok1(rs2228570)正向引物	100pmol/ul	5.0ul
Fok1(rs2228570)反向引物	100pmol/ul	5.0ul
			Fok1(rs2228570)基因型T探针	100pmol/ul	2.0ul
Fok1(rs2228570)基因型C探针	100pmol/ul	2.0ul
			ddH2O		96.0ul

3、Q-PCR扩增。采用Applied Biosystems QuantStudio 5设备按下列程序进行:

4、输出结果。如图1～图3所示，分别是结果的Melt Curve显示图，位点多态性分型效果图及其表格形式。

在图2中，左上部分(蓝色)代表纯合的TT型、中部(绿色) 代表杂合的CT型，右下部分(红色)代表纯合的CC型。

请同时参阅图4、图5，分别是采用现有技术进行检测得到的Melt Curve显示图和位点多态性分型效果图。与现有技术相比，采用本发明提供的所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物进行检测，获得的峰图单一，特异性好。成功分型的成功率也由 89％左右上升至接近100％。

基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的系统，包括：

提取模块，用于提取获得待测样本DNA；

检测模块，用于将所述待测样本DNA、所述基于探针法实现维D 受体Fok1位点准确分型的试剂，按Q-PCR反应的步骤操作进行反应，输出反应结果；

以及可自动进行Q-PCR操作的设备。所述检测模块依托所述设备按所述基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的检测方法对所述待测样本DNA进行检测；并将结果以可视化数据显示。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 长沙金域医学检验实验室有限公司

<120> 基于探针法实现维D受体Fok1位点准确分型的引物组合物、试剂、检测方法和系统

<130> 0000

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ctggccctgg cactgactct ggctct 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

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