阅读说明：本技术 一种qpcr实时荧光数据定量分析的方法 (QPCR real-time fluorescence data quantitative analysis method ) 是由 王寄竹 石瑞 于 2020-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法,涉及PCR反应领域,包括S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据,得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A；S2、处理S1中的所有荧光数据,使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准；S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值；该方法从数据层面入手,通过一系列算法步骤,明显消除反应、加温、信号采集等对原始数据的影响,从而完成最终的分析,计算出待测样品的Ct值和浓度,定量分析的结果准确度。(The invention discloses a quantitative analysis method of QPCR real-time fluorescence data, which relates to the field of PCR reaction, and comprises S1, collecting fluorescence data of multiple cycles of each sample in the PCR reaction process to obtain a curve A of the cycle number-fluorescence brightness value of each sample; s2, processing all the fluorescence data in S1 to smooth the curve A of each sample to obtain a curve B; s3, acquiring a base line of the curve B of each sample and calibrating the base line; s4, obtaining the Ct value of each sample according to the calibrated baseline; the method starts from a data aspect, and obviously eliminates the influence of reaction, heating, signal acquisition and the like on original data through a series of algorithm steps, thereby completing final analysis, calculating the Ct value and concentration of a sample to be detected, and quantitatively analyzing the result accuracy.)

一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法

技术领域

本发明涉及PCR反应领域，尤其涉及一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法。

背景技术

QPCR实时荧光数据，通过各种类型传感器捕获后，需要对数据进行一系列分析以确定待测样本的浓度。实际中，由于PCR反应本身、温度控制、采集过程等各方面的误差，会导致最终采集结果出现不同程度偏移，使S曲线的形状变得不规则，定量分析的结果Ct值准确度受到影响。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题设计了一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，包括以下步骤：

S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A；

S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；

S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准；

S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值。

进一步地，在S2中包括：

S21、确定平滑窗口，平滑窗口为3或5；

S22、第一个循环开始取滑动窗口数量的点数，使用平均值代替对应的采集值，使得每个样品的曲线A变成平滑的曲线B。

进一步地，在S3中包括：

S31、对每个样品的曲线B中的数据连续两点做差分,标记差分值最大的点m；

S32、从m点往前计算该点和前一的差值；

S33、若差值大于0.1则m点往前移动，直到第一个点；

S34、停止后的点为m为基线终点，标识第一个循环到第m个循环为曲线B的基线期；

S35、取第1个点到第m个点为基线数据集做线性拟合,计算出基线解析式y＝ax+b

S36、曲线B上每一个点纵坐标减去对应校准后基线的纵坐标求得deltaRn。

进一步地，在S4中包括：

S41、取每条线校准荧光值deltaRn和对应循环数作为曲线新的坐标对,计算基线期所有点的10倍标准差作为阈值；

S42、取所有样品的阈值的最小值作为自动阈值；

S43、根据自动阈值与每个样品校准后的基线计算Ct值。

本发明的有益效果在于：本发明实现了一种QPCR数据处理方法，该方法从数据层面入手，通过一系列算法步骤，明显消除反应、加温、信号采集等对原始数据的影响，从而完成最终的分析，计算出待测样品的Ct值和浓度，定量分析的结果准确度。

附图说明

图1是本发明一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法中曲线A的曲线图；

图2是本发明一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法中基线校准后的曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“左”、“右”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，或者是本领域技术人员惯常理解的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，“设置”、“连接”等术语应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接连接，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细说明。

一种QPCR实时荧光数据定量分析的方法，包括以下步骤：

S1、采集每个样品在PCR反应过程中多个循环的荧光数据，得到每个样品的循环数—荧光亮度值的曲线A，人，如图1所示。

S2、处理S1中的所有荧光数据，使每个样品的曲线A变得平滑得到曲线B；

S21、确定平滑窗口，平滑窗口为3或5；

S22、第一个循环开始取滑动窗口数量的点数，使用平均值代替对应的采集值，使得每个样品的曲线A变成平滑的曲线B。

S3、获取每个样品的曲线B的基线并进行基线校准，极限校准后的曲线如图2所示；

S31、对每个样品的曲线B中的数据连续两点做差分,标记差分值最大的点m；

S32、从m点往前计算该点和前一的差值；

S33、若差值大于0.1则m点往前移动，直到第一个点；

S34、停止后的点为m为基线终点，标识第一个循环到第m个循环为曲线B的基线期；

S35、取第1个点到第m个点为基线数据集做线性拟合,计算出基线解析式y＝ax+b

S36、曲线B上每一个点纵坐标减去对应校准后基线的纵坐标求得deltaRn。

S4、根据校准后的基线得到每个样品的Ct值。

S41、取每条线校准荧光值deltaRn和对应循环数作为曲线新的坐标对,计算基线期所有点的10倍标准差作为阈值；

S42、取所有样品的阈值的最小值作为自动阈值；

S43、根据自动阈值与每个样品校准后的基线计算Ct值。

	样品一	样品二	样品三	样品四	样品五	样品六
							Ct值	17.54	21.20	25.36	28.73	32.26	36.94

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。