一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用
阅读说明：本技术 一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用 (Carbonyl reductase mutant and application thereof in preparation of steroid hormone testosterone ) 是由 林娟 苏冰梅 赵鸿儒 许鑫琦 许炼 于 2021-07-22 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物工程技术领域,具体涉及一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用。将羰基还原酶突变体PmCRm与甲酸脱氢酶BstFDH-m在大肠埃希氏菌中共表达,并以该共表达工程菌的静息细胞作为生物催化剂催化雄甾-4-烯-3,17-二酮合成睾酮。该生物催化剂具有较高的催化活性、区域选择性和立体选择性,可以在10 h以内完全转化28.8 g/L雄甾-4-烯-3,17-二酮生成目标产物睾酮,且无副产物产生,其底物投料量、转化率和时空转化率皆为国内生物法制备睾酮的最高水平,经过分离纯化,产物回收率高达95%以上,说明该生物催化剂是睾酮绿色合成的高效催化剂。(The invention belongs to the technical field of biological engineering, and particularly relates to a carbonyl reductase mutant and application thereof in preparation of steroid hormone testosterone. The carbonyl reductase mutant PmCRm and formate dehydrogenase BstFDH _ m are co-expressed in Escherichia coli, and resting cells of the co-expression engineering bacteria are used as a biocatalyst to catalyze androst-4-ene-3, 17-dione to synthesize testosterone. The biocatalyst has high catalytic activity, regioselectivity and stereoselectivity, can completely convert 28.8 g/L androstane-4-alkene-3, 17-diketone to generate a target product testosterone within 10 h, does not generate byproducts, has the highest level of testosterone preparation by domestic biological methods in substrate feeding amount, conversion rate and space-time conversion rate, and has the product recovery rate of over 95 percent after separation and purification, thereby indicating that the biocatalyst is a high-efficiency catalyst for green synthesis of testosterone.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用。
背景技术
睾酮（Testosterone，TS）为雄激素类固醇药物，又称睾丸素、睾丸酮或睾甾酮，化学名为17 β-羟基-雄甾-4-烯-3-酮，化学结构如图1所示。睾酮在医学上不仅可作为雄性激素药物用于治疗男性原发性或继发性性腺机能减退和维持第二性征和性功能，也可作为关键前体用于一系列高效的类固醇药物（如甲基睾酮、丙酸诺龙和庚酸睾酮等）的合成。
在传统方法中，睾酮的制备是通过多步化学反应，将各种原料（茚满酮、茚二酮、β-谷甾醇、植物甾醇、雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮等）转化为睾酮和反式睾酮的混合物，再通过酶法或者化学法进行拆分获得睾酮纯品。整个过程涉及3位羰基保护、17位羰基还原、3位去保护及拆分等，过程繁琐且条件剧烈，污染严重，是一种成本高、原子经济性差且回收率低的睾酮合成方法。为了谋求更为环保、成本更低且操作简便的睾酮合成方法，科学家们开始将目光转至生物转化上来并进行了诸多尝试，以雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮为前体，利用各种微生物（如Acremonium strictum、Beauveria bassiana和Cephalosporium aphidicola等）合成睾酮。但是这种微生物法的产量很低且还含有副产物，难以用于睾酮工业化生产，所以目前国内依然采用化学法生产睾酮。
2017年，CN 2017-10617905公布了一种利用白色念珠菌Candida albicans 7103来源的17β-羟基甾体脱氢酶制备睾酮的酶法工艺，其底物载量达3-5 g/L, 时空转化率达0.397 g/L/h，是国内唯一的睾酮酶法制备工艺。羰基还原酶和17β-羟基甾体脱氢酶同属于短链脱氢还原酶家族，皆可催化羰基转化为羟基。且羰基还原酶具有广阔的底物谱，广泛应用于各种手性醇的工业化制备中，理论上也能将雄甾-4-烯-3，17-二酮还原为睾酮。但是目前国际上皆未见利用羰基还原酶不对称还原雄甾-4-烯-3，17-二酮合成睾酮的相关报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种羰基还原酶突变体PmCRm，所述突变体是将SEQ ID No .1所示氨基酸序列第136位的亮氨酸突变为丝氨酸获得的。
其中，上述羰基还原酶突变体PmCRm的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种编码羰基还原酶突变体PmCRm的基因pmcr_m，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
一种重组表达载体，其包含如上所述编码羰基还原酶突变体PmCRm的基因pmcr_m，且在其下游连有编码甲酸脱氢酶BstFDH_m的基因bstfdh_m。
其中，上述重组表达载体为以pET30a为骨架的重组表达载体pET30a-pmcr_m- bstfdh_m。
一种共表达工程菌株，其包含上述的重组表达载体pET30a-pmcr_m-bstfdh_m。
其中，上述共表达工程菌株为将重组表达载体pET30a-pmcr_m-bstfdh_m转化至宿主微生物中制得的共表达工程菌株，宿主微生物为大肠埃希氏菌（E.coli）BL21（DE3）。
上述一种羰基还原酶突变体PmCRm在甾体激素--睾酮制备中的应用，所述的应用为：将重组表达载体pET30a-pmcr_m-bstfdh_m转化至（E.coli）BL21（DE3）中制得共表达工程菌株，制备共表达工程菌株的静息细胞的湿菌体；取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液，调节湿菌体浓度为100-200 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7 mg，40℃、230 rpm反应10 h；离心收集反应液中的沉淀，经乙醇或乙酸乙酯萃取，减压浓缩后得睾酮粗品，用水清洗后得睾酮纯品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明简单方便、催化反应条件温和，效率高（活力高且选择性好），将羰基还原酶突变体PmCRm与甲酸脱氢酶BstFDH_m共表达在大肠埃希氏菌（E.coli）BL21（DE3）中，并以共表达工程菌的静息细胞为生物催化剂，以雄甾-4-烯-3，17-二酮为底物，在较高底物浓度下，短时间内即可将底物完全转化为目标产物睾酮，且无副产物产生，时空转化率远高于目前报道水平（2.88 vs. 0.397 g/L/h）。
（2）本发明回收率高（睾酮的回收率高达97%），涉及到的有机试剂（乙酸乙酯或乙醇）容易回收、成本低、无污染物排放、对环境友好，可以实现睾酮的绿色合成。
附图说明
图1是睾酮的化学结构。
图2是共表达菌株的构建示意图。
图3是核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker；泳道1为pmcr_m；泳道2为线性化pET30a；泳道3为双酶切的pET30a-pmcr_m；泳道4为pET30a-pmcr_m PCR验证；泳道5为rbs- bstfdh_m；泳道6为pET30a-pmcr_m-rbs骨架；泳道7为线性化的pET30a-pmcr_m-bstfdh_m；泳道8为pET30a-pmcr_m-bstfdh_m PCR验证。
图4是全细胞催化合成睾酮的时间曲线。
图5是睾酮纯品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。本领域技术人员应了解到，本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。
实施例1 羰基还原酶突变体（PmCRm）和甲酸脱氢酶（BstFDHm）共表达工程菌株的构建
（1）PCR扩增羰基还原酶突变体基因pmcr_m并纯化
整个构建流程如图2所示。
羰基还原酶突变体PmCRm是将SEQ ID No .1所示氨基酸序列（WP_060395036.1）第136位的亮氨酸突变为丝氨酸获得的。
根据羰基还原酶突变体PmCRm的氨基酸序列（SEQ ID No.2），以（E.coli）BL21（DE3）为目标宿主进行密码子优化获得pmcr_m基因（SEQ ID No.3），并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。根据SEQ ID No.3所示的序列设计两条引物：
F1（SEQ ID No.4）：
5‘-ATCGGATCCATGTCAGCATCTAAAAC-3’ （下划线处为BamH I酶切位点）；
R1（SEQ ID No.5）：
5‘-CAGCTCGAGTTACCACGGCAGGGTACG-3’ （下划线处为Xho I酶切位点）。
以合成的pmcr_m基因为模板，利用KOD one扩增目的基因片段。
PCR条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，55℃，10 s，68℃，10 s，循环30次；68℃，2min。
经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图2所示，在705 bp附近有目标条带。利用割胶回收试剂盒（OMEGA，美国）对PCR产物进行纯化，然后保存于-20℃冰箱中备用。
（2）双酶切反应，纯化及连接
将步骤（1）获得的pmcr_m基因片段和载体pET30a分别进行BamH I-Xho I双酶切，利用DNA纯化试剂盒（OMEGA，美国）纯化各酶切产物，经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图3所示，酶切的载体与理论分子量相符（5399 bp）。将上述纯化后的基因片段和线性载体用T4连接酶进行连接。
（3）连接产物的转化
采用氯化钙法制备感受态（E.coli）BL21（DE3）细胞，并用热激法将连接产物转入感受态的（E.coli）BL21（DE3）中，具体步骤如下：
从-80℃中取出感受态的（E.coli）BL21（DE3）细胞100 μL，于冰水浴上解冻5 min，然后将步骤（2）得到的连接产物转入其中，冰水浴2 min，再在42℃下热激90 s后冰水浴2min，然后向其中添加900 μL LB培养基，于37℃、200 rpm下培养45-60 min，最后涂布于含50 mg/mL卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜。
（4）阳性克隆验证
挑取单克隆，在含50 mg/mL卡那霉素的LB培养基中培养8 h，用质粒提取试剂盒（OMEGA，美国）提取质粒，并用T7通用引物进行PCR验证，同时用BamH I-Xho I对质粒进行双酶切，经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图3所示，酶切的产物（分别为705 bp和5399 bp）和PCR产物（1020 bp）与理论分子量相符，说明重组质粒pET30a-pmcr_m被成功构建。T7通用引物序列如下：
T7-F（SEQ ID No.6）：
5‘-TAATACGACTCACTATAGGG--3’；
T7-R（SEQ ID No.7）：
5‘-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。
（5）Mega rimer PCR构建共表达质粒pET30a-pmcr_m-bstfdh_m
①扩增rbs-bstfdh_m片段
依照文献报道（H. W. Jiang, Q. Chen, J. Pan, G. W. Zheng and J. H. Xu,Appl Biochem Biotechnol, 2020, 192, 530-543.）的NADP(H)依赖型的甲酸脱氢酶BstFDHm的氨基酸序列（如SEQ ID No.8所述），以（E.coli）BL21（DE3）为目标宿主进行密码子优化，确定其基因bstfdh_m的序列（如SEQ ID No.9所述），并委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。为了将rbs序列添加到BstFDHm的编码基因上游，依照SEQ ID No.9所示的序列设计了两条引物：
F2（SEQ ID No.10）：
5‘-GCACCACAAGAAGGAGATATACCTATGGCAACCGTGCTG TGTGT-3’ （下划线处为同源臂序列，粗体为rbs序列）；
R2（SEQ ID No.11）：
5‘-CGGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGTGTTAGGTCAGGCGATAAGACTG-3’ （下划线处为同源臂序列）。
以合成的bstfdh_m基因为模板，利用KOD one进行PCR扩增。
PCR 条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，55℃，10 s，68℃，10 s，循环30次；68℃，2min。
经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图3所示，PCR产物与理论分子量相符（1214 bp），为rbs-bstfdh_m片段。
②扩增pET30a-pmcr_m-rbs骨架
利用PCR扩增技术获得线性骨架片段pET30a-pmcr_m-rbs。
F3（SEQ ID No.12）：
5‘-CACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCG-3’ （下划线处为同源臂序列）；
R3（SEQ ID No.13）：
5‘-AGGTATATCTCCTTCTTGTGGTGCCTCGAGTTACCACGGCAGGGTACGAC-3’ （下划线处为同源臂序列，粗体为rbs互补序列）。
以pET30a-pmcr_m为模板，利用KOD one进行PCR扩增。
PCR 条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，55℃，10 s，68℃，40 s，循环30次；68℃，2min。
经1 wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图2所示，PCR产物与理论分子量相符（6084 bp），为pET30a-pmcr_m-rbs骨架片段。
③PCR扩增共表达质粒pET30a-pmcr_m-bstfdh_m
分别以rbs-bstfdh_m片段和pET30a-pmcr_m-rbs为引物和模板，利用KOD one进行Mega rimer PCR。
PCR 条件为：98℃，2 min；98℃，10 s，55℃，10 s，68℃，50 s，循环30次；68℃，2min。
利用DMT对PCR产物进行消化（37 ℃，1 h）后采用热激法（42 ℃，90 s，方法同步骤（3）所述）将PCR产物转入感受态的（E.coli）BL21（DE3）中。挑取单克隆培养，提取质粒后进行T7通用引物（序列同上所述）的PCR验证，并用BamH I对提取的质粒进行线性化，经1wt%琼脂糖凝胶电泳验证，如图3所示，线性化产物和PCR产物与理论分子量相符（分别为7245 bp和2190 bp），说明共表达工程菌株（E.coli）BL21 (DE3)-pET30a-pmcr_m-bstfdh_m被成功构建。
实施例2 共表达工程菌株静息细胞的制备
挑取（E.coli）BL21 (DE3)-pET30a-pmcr_m-bstfdh_m工程菌株单菌落至20 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm条件下培养8-12 h，作为种子液。按照2vol%的接种量转接至装有300 mL加有50 mg/L卡那霉素的LB培养基的1 L摇瓶中，继续培养直至OD600为0.6-0.7，然后添加终浓度8%（m/v）的乳糖，置于25℃下继续震荡12 h以诱导目的基因的表达。然后将上述培养物于7000 rpm，16℃条件下离心3 min，弃上清，收集湿菌体，称重后于-20℃下保存备用。
实施例3 共表达工程菌静息细胞转化雄甾-4-烯-3，17-二酮为睾酮的方法
按照实施例2的方法制备共表达工程菌株静息细胞，并将其作为生物催化剂。
利用高效液相色谱仪对产物进行测定：依利特高效液相色谱仪，色谱柱：Chiralpak AD-H Column（4.6 mm × 250 mm, 5 µm）, 流动相：正己烷-异丙醇（v/v = 90/10），检测波长：254 nm，柱温：30℃，流速：1.4 mL/min。在该检测条件下，雄甾-4-烯-3，17-二酮和睾酮的出峰时间分别为：10.39 min和11.47 min。
（1）取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.5），使湿菌体浓度为200 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7mg，40 ℃、230 rpm反应4 h后，取200 µL反应液，用1 mL乙酸乙酯萃取，减压除去溶剂后，用异丙醇溶解并适当稀释，经无水硫酸钠干燥进行HPLC检测，转化率为82.07%，时空产率为5.745 g/L/h。
（2）取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.5），使湿菌体浓度为100 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7mg，40 ℃、230 rpm反应10 h，取200 µL反应液，用1 mL乙酸乙酯萃取，减压除去溶剂后，用异丙醇溶解并适当稀释，经无水硫酸钠干燥后进行HPLC检测，转化率为96.85%，时空产率为2.712 g/L/h。
（3）取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.5），使湿菌体浓度为150 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7mg，40 ℃、230 rpm反应10 h，取200 µL反应液，用1 mL乙酸乙酯萃取，减压除去溶剂后，用异丙醇溶解并适当稀释，经无水硫酸钠干燥后进行HPLC检测，转化率为97.95%，时空产率为2.743 g/L/h。
（4）取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.5），使湿菌体浓度为200 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7mg，40 ℃、230 rpm反应10 h，取200 µL反应液，用1 mL乙酸乙酯萃取，减压除去溶剂后，用异丙醇溶解并适当稀释，经无水硫酸钠干燥后进行HPLC检测，转化率为100%，时空产率为2.88 g/L/h。
实施例4 共表达工程菌静息细胞转化雄甾-4-烯-3，17-二酮为睾酮的时间曲线
取湿菌体重悬于100 mL磷酸缓冲液（100 mM，pH=7.5），使湿菌体浓度为200 g/L，加入底物雄甾-4-烯-3，17-二酮2.88 g，吐温80 4 mL，辅底物甲酸钠1.02 g，NADP+ 15.7mg，40 ℃、230 rpm条件下反应。在不同的时间，取200 µL反应液，用1 mL乙酸乙酯萃取，减压除去溶剂后，用异丙醇溶解并适当稀释，经无水硫酸钠干燥后进行HPLC检测，根据各时间的转化率绘制反应的时间曲线，如图4所示，转化率在4小时内迅速提高至91.8%，继续反应，转化率缓慢上升，最终在10 h将底物全部转化为睾酮。
实施例5 睾酮的提纯方法
（1）将100 mL反应液离心（理论上含睾酮2.90 g），收集沉淀。用20倍睾酮质量的乙酸乙酯（58 mL），多次萃取沉淀，收集有机溶液，进行减压浓缩，使其结晶。再用20倍睾酮质量的水（58 mL）对晶体进行冲洗，收集晶体并烘干，获得2.76 g晶体，收率为95.1%。
（2）将100 mL反应液离心（理论上含睾酮2.90 g），收集沉淀。用20倍睾酮质量的乙醇（58 mL），多次萃取沉淀，收集有机溶液，进行减压浓缩，使其结晶。再用20倍睾酮质量的水（58 mL）对晶体进行冲洗，收集晶体并烘干，获得2.82 g晶体，收率为97.2%。
实施例6 睾酮成品的质量检测
对获得的晶体进行质量检测，利用WRS-1C熔点仪进行熔点测定；利用全自动旋光仪P850进行比旋光度的测定，样品浓度为1%（m/m，溶于乙醇）；利用红外线水分测定天平MA35进行含水率的测定。结果如下：
熔点为151-156 ℃，纯度达99.9%（HPLC法，如图5所示），25℃时在钠光的D线下所测得的比旋光度为107°，含水率<0.1 %。
经检测，产品是睾酮。无副产物生成，睾酮回收率达到了95%以上。
根据本领域公共知识，任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列，产生各种不同的突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。因此，凡是经等位基因突变或者具有一个或多个氨基酸插入、缺失或取代且具有催化雄甾-4-烯-3，17-二酮生成睾酮功能的酶均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种羰基还原酶突变体及其在制备甾体激素--睾酮中的应用
<130>
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ser Ala Ser Lys Thr Ala Leu Val Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu His Glu Gln Gly Trp Asn Val Ile
20 25 30
Ala Thr Val Arg Asp Pro Ala Lys Ala Thr Ala Leu His Ala Leu Ala
35 40 45
Gly Val Arg Val Glu Ala Leu Glu Met Asn Asp Ala Ser Gln Leu Asp
50 55 60
Ala Leu Gly Gln Arg Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Leu Leu Phe Val
65 70 75 80
Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Ser Ala Asp Thr Ile His
85 90 95
Leu Glu Gln Val Gly Glu Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile
100 105 110
Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Asp Gln Val Arg Pro Gly Thr Gly Val
115 120 125
Val Ala Phe Met Ser Ser Gly Leu Gly Ser Val Ala Ser Pro Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met
145 150 155 160
Ile Asn Ser Phe Val Val Ala Leu Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu
165 170 175
Ala Met His Pro Gly Trp Val Arg Thr Glu Met Gly Gly Glu Asn Ala
180 185 190
Glu Ile Asp Val Leu Thr Ser Thr Gln Gly Ile Leu Ala Gln Val Glu
195 200 205
Ala Gln Ala Gly His Gly Gly Leu Arg Phe Leu Asp Tyr Ala Gly Arg
210 215 220
Thr Leu Pro Trp
225
<210> 2
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Ser Ala Ser Lys Thr Ala Leu Val Ile Gly Ala Ser Arg Gly Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Leu Val Gln Arg Leu His Glu Gln Gly Trp Asn Val Ile
20 25 30
Ala Thr Val Arg Asp Pro Ala Lys Ala Thr Ala Leu His Ala Leu Ala
35 40 45
Gly Val Arg Val Glu Ala Leu Glu Met Asn Asp Ala Ser Gln Leu Asp
50 55 60
Ala Leu Gly Gln Arg Leu Glu Gly Glu Val Leu Asp Leu Leu Phe Val
65 70 75 80
Asn Ala Gly Val Met Gly Pro Leu Pro Gln Ser Ala Asp Thr Ile His
85 90 95
Leu Glu Gln Val Gly Glu Leu Phe Met Thr Asn Ala Val Ser Pro Ile
100 105 110
Arg Val Ala Arg Arg Leu Val Asp Gln Val Arg Pro Gly Thr Gly Val
115 120 125
Val Ala Phe Met Ser Ser Gly Ser Gly Ser Val Ala Ser Pro Asp Ala
130 135 140
Gly Glu Ile Cys Leu Tyr Lys Ala Ser Lys Ala Ala Leu Asn Ser Met
145 150 155 160
Ile Asn Ser Phe Val Val Ala Leu Gln Arg Pro Asp Leu Cys Val Leu
165 170 175
Ala Met His Pro Gly Trp Val Arg Thr Glu Met Gly Gly Glu Asn Ala
180 185 190
Glu Ile Asp Val Leu Thr Ser Thr Gln Gly Ile Leu Ala Gln Val Glu
195 200 205
Ala Gln Ala Gly His Gly Gly Leu Arg Phe Leu Asp Tyr Ala Gly Arg
210 215 220
Thr Leu Pro Trp
225
<210> 3
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgtcagcat ctaaaaccgc attagttatt ggcgcaagtc gcggtctggg tttaggctta 60
gttcagcgct tacatgaaca gggttggaat gtgattgcaa ccgtgcgcga tccggccaaa 120
gccaccgcct tacatgcatt agccggcgtt cgcgtggaag cattagaaat gaatgatgca 180
agtcagttag atgccctggg ccagcgcctg gaaggcgaag tgctggattt actgtttgtt 240
aatgccggtg tgatgggccc gttaccgcag agtgccgata ccattcatct ggaacaggtt 300
ggtgaactgt ttatgaccaa tgcagtgtct ccgattcgcg tggcacgtcg cttagtggat 360
caggttcgtc cgggtactgg cgttgttgcc tttatgtcgt caggcagcgg tagcgtggca 420
agtccggatg caggcgaaat ttgtctgtat aaagcctcta aagcagcact gaatagtatg 480
attaatagct ttgttgttgc cttacagcgt ccggatctgt gtgtgctggc catgcatccg 540
ggctgggttc gtaccgaaat gggcggtgaa aatgcagaaa ttgatgtgct gacctcaacc 600
cagggtattc tggcacaggt tgaagcccag gcaggtcatg gtggtctgcg ctttttagat 660
tatgccggtc gtaccctgcc gtggtaa 687
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atcggatcca tgtcagcatc taaaac 26
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagctcgagt taccacggca gggtacg 27
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
taatacgact cactataggg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 8
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Met Ala Thr Val Leu Cys Val Leu Tyr Pro Asp Pro Val Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Pro Pro His Tyr Val Arg Asp Thr Ile Pro Val Ile Thr Arg Tyr Ala
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Ala Pro Thr Pro Ala Gly Pro Pro Gly Phe Arg Pro
35 40 45
Gly Glu Leu Val Gly Ser Val Ser Gly Ala Leu Gly Leu Arg Gly Tyr
50 55 60
Leu Glu Ala His Gly His Thr Leu Ile Val Thr Ser Asp Lys Asp Gly
65 70 75 80
Pro Asp Ser Glu Phe Glu Arg Arg Leu Pro Asp Ala Asp Val Val Ile
85 90 95
Ser Gln Pro Phe Trp Pro Ala Tyr Leu Thr Ala Glu Arg Ile Ala Arg
100 105 110
Ala Pro Lys Leu Arg Leu Ala Leu Thr Ala Gly Ile Gly Ser Asp His
115 120 125
Val Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala His Ile Thr Val Ala Glu Val
130 135 140
Thr Met Ser Asn Ser Ile Ser Val Ala Glu His Val Val Met Thr Thr
145 150 155 160
Leu Ala Leu Val Arg Asn Tyr Leu Pro Ser His Ala Ile Ala Gln Gln
165 170 175
Gly Gly Trp Asn Ile Ala Asp Cys Val Ser Arg Ser Tyr Asp Val Glu
180 185 190
Gly Met His Phe Gly Thr Val Gly Ala Gly Arg Ile Gly Leu Ala Val
195 200 205
Leu Arg Arg Leu Lys Pro Phe Gly Leu His Leu His Tyr Thr Gln Arg
210 215 220
His Arg Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Glu Leu Gly Leu Thr Tyr His
225 230 235 240
Ala Asp Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ala Val Asp Ile Val Asn Leu Gln
245 250 255
Ile Pro Leu Tyr Pro Ser Thr Glu His Leu Phe Asp Ala Ala Met Ile
260 265 270
Ala Arg Met Lys Arg Gly Ala Tyr Leu Ile Asn Thr Ala Arg Gly Lys
275 280 285
Leu Val Asp Arg Asp Ala Val Val Arg Ala Val Thr Ser Gly His Leu
290 295 300
Ala Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro Ala Pro Ala Asp
305 310 315 320
His Pro Trp Arg Ala Met Pro Phe Asn Gly Met Thr Pro His Ile Ser
325 330 335
Gly Thr Ser Leu Ser Ala Gln Ala Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Leu Glu
340 345 350
Ile Leu Gln Cys Trp Phe Asp Gly Arg Pro Ile Arg Asn Glu Tyr Leu
355 360 365
Ile Val Asp Gly Gly Thr Leu Ala Gly Thr Gly Ala Gln Ser Tyr Arg
370 375 380
Leu Thr
385
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atggcaaccg tgctgtgtgt gctgtatcca gacccggtgg atggctatcc gccgcattat 60
gttcgcgata ccattccggt tattacccgc tatgcagatg gccagaccgc accgaccccg 120
gcaggcccgc cgggctttcg ccctggtgaa ctggtgggtt cagtgagcgg cgcactgggc 180
ctgcgcggct atctggaagc acatggtcat accctgattg ttaccagtga taaagatggt 240
ccggatagcg aatttgaacg tcgtctgccg gatgcagatg ttgtgatttc tcagccgttt 300
tggccggcat atctgaccgc agaacgtatt gcacgcgcac cgaaactgcg tctggcactg 360
accgcaggca ttggtagcga tcatgtggat ctggatgcag cagcacgtgc acatattacc 420
gttgcagaag ttaccatgag taatagtatt agcgttgcag aacatgttgt tatgaccacc 480
ctggcactgg tgcgtaatta tctgccgagc catgcaattg cacagcaggg cggttggaat 540
attgcagatt gtgtgtctcg tagctatgat gtggaaggta tgcattttgg tactgtgggc 600
gcaggtcgta ttggtctggc agtgctgcgt cgcctgaaac cgtttggcct gcatctgcat 660
tatacccagc gtcatcgcct ggatgcagca attgaacagg aactgggtct gacctatcat 720
gcagatccgg caagcctggc agcagcagtt gatattgtta atcttcaaat tccgctgtat 780
ccgtcaaccg aacatctgtt tgatgcagca atgattgcac gtatgaaacg cggcgcatat 840
ctgattaata ccgcacgcgg taaactggtt gatcgcgatg cagttgttcg cgcagtgacc 900
tcaggccatc tggcaggcta tggcggcgat gtttggtttc cgcagccggc accggcagat 960
catccgtggc gcgcaatgcc gtttaatggt atgaccccgc atatttcagg gacatcactg 1020
tcagcacagg cacgctatgc agcagggacg ctggaaattc tacagtgttg gtttgatggt 1080
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cagtcttatc gcctgaccta a 1161
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aggtatatct ccttcttgtg gtgcctcgag ttaccacggc agggtacgac 50