阅读说明：本技术 基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的计算方法 (Dialysis method based calculation method for substance adsorption amount and desorption amount of extracellular polymer ) 是由 乔椋 张雁秋 李燕 钱玉兰 于 2020-05-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的测定方法,基于物质守恒计算EPS对物质的吸附量和解吸量,具体是利用透析膜透析已经吸附物质的EPS混合液,测定外部透析液物质的浓度,确定EPS的吸附量；更换透析膜外部透析液,测定外部透析液物质的浓度,利用公式计算取值的解吸量；所检测物质包括但不限于氨氮溶液和亚硝态氮。本发明的方法原理简单,操作方便,可同时对吸附物与被吸附物不宜分离的吸附-解吸体系进行吸附量和解吸量的计算,检测方法成本低。(The invention discloses a method for measuring the adsorption quantity and desorption quantity of extracellular polymeric substances to substances based on a dialysis method, which is used for calculating the adsorption quantity and the desorption quantity of EPS to the substances based on substance conservation, and particularly comprises the steps of dialyzing EPS mixed solution which is adsorbed with the substances by using a dialysis membrane, measuring the concentration of external dialysate substances and determining the adsorption quantity of the EPS; replacing the dialysis membrane external dialysate, measuring the concentration of external dialysate substances, and calculating the desorption amount of the value by using a formula; the substances detected include, but are not limited to, ammoniacal nitrogen solution and nitrous nitrogen. The method has simple principle and convenient operation, can simultaneously calculate the adsorption quantity and the desorption quantity of an adsorption-desorption system which is not suitable for separating the adsorbate and the adsorbate, and has low cost.)

基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的计算 方法

技术领域

本发明涉及一种胞外聚合物吸附物质测定方法，特别是一种基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的计算方法。

背景技术

胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances，简写为EPS）作为微生物代谢生长过程中分泌或者捕获的蛋白质、多糖等混合聚合物，对细菌生长有重要作用，厌氧氨氧化菌尤为如此。因为厌氧氨氧化菌成粒作用与颗粒的稳定不仅依靠一定浓度物质保证细菌生长，而且依靠EPS维持细菌颗粒化。目前研究者已经认识到EPS是厌氧氨氧化菌分泌的，并且过量EPS对厌氧氨氧化菌的增长有不利影响。但是，EPS作为厌氧氨氧化菌生长所分泌到外部环境中的物质，对厌氧氨氧化菌的生长具体有什么样的影响，EPS与厌氧氨氧化菌生长所必须的物质：氨氮与亚硝态氮之间以什么样的方式结合，乃至传质尚不清楚。适合厌氧氨氧化菌EPS的提取方法有很多，但是如何检测EPS对物质的吸附，目前没有简单有效的方法。EPS对物质吸附的检测目前还没有统一的办法。傅里叶红外光谱（FTIR）等通过检测键能的改变只能检测数次EPS对物质的吸附实验。

发明内容

本发明的目的是要提供一种基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的计算方法，解决了利用化学方法即可检测EPS对物质的吸附量和解吸量的问题。

本发明的测定方法是利用透析膜透析已经吸附物质的EPS混合液，测定外部透析液物质的浓度，计算EPS对物质的吸附量；再通过更换外部透析液，当透析膜内部剩余物质总量为吸附量时，检测被吸附物质的解吸量。

具体步骤为：

步骤1，透析膜经过预处理后，向透析膜中加入物质溶液，将载有物质溶液的透析膜悬浮或完全浸没在与透析膜内部等体积的无氧无氨水溶液，置于5℃-35℃温度条件进行透析，隔1h测定透析膜外部溶液中物质溶液的含量，并用Origin8.0拟合透析曲线；

所述的物质溶液包括但不限于氨氮溶液或者亚硝态氮溶液，所述氨氮溶液的浓度为5-200mgN/L，所述亚硝态氮溶液的浓度为6-264mgN/L；

步骤2，以步骤1相同浓度的氨氮溶液或亚硝态氮溶液为物质溶液，加入已知浓度的EPS溶液使总体积与步骤1中透析的物质溶液浓度和体积相同，在步骤1相同的透析条件下，隔2h测定透析膜外部溶液中氨氮或者亚硝态氮含量，利用步骤1的拟合透析曲线，拟合最终外部透析液中氨氮溶液或亚硝态氮溶液物质的含量，则EPS对氨氮溶液或亚硝态氮溶液的吸附量为第一次拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度与加入EPS溶液后拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度之差；

其中，N_物质代表透析膜内被吸附物物质溶液的含量，与N_EPS中该物质的含量相等，N_物质=N_EPS；k_物质、k_EPS为拟合透析曲线的k值；t₁为透析时间h；e为自然常数；

步骤3，将步骤2进行吸附检测完后的透析膜外部透析液更换为200 ml无氧无氨水进行物质透出，进行解吸实验前处理，间隔一段时间检测外部透析液物质含量，计算透析至透析膜外部的物质量，直至透析膜内部剩余物质含量等于EPS对物质的吸附量时，弃去外部透析液，进行解吸实验，更换透析膜外部透析液为40 ml无氧无氨水，检测透析液内部物质含量，每间隔1 h检测透析到外部透析液的物质含量，因此时透析膜内物质浓度低，取样检测后，需要更换40 ml无氧无氨水，继续透析，再进行后续检测，根据公式计算被EPS吸附的物质的解吸量；

N₀为透析膜内部物质初始浓度，t₁为透析时间h、t₂为解吸时间h，n’为透析次数，n’’为解吸液更换次数，k、k_de可以根据拟合曲线计算得到。

所述已知浓度的EPS溶液是利用超声法提取的EPS溶液，经过冷冻干燥器处理，将EPS粉末于-20℃保存，每次称取10mg，配置到100ml无氧无氨水中，冷藏保存待用。

进一步地，所述的拟合透析曲线：拟合透析曲线假设透析膜内氨氮溶液或者亚硝态氮溶液物质初始含量为N₀，并且溶质伴随水穿过透析膜；根据物质守恒定律，任意时间内，透析膜内与透析膜外氨氮或者亚硝态氮量之和等于最初加入透析膜内的氨氮或者亚硝态氮的量，即为N₀，透析无限长时间后，透析膜内外物质量均为1/2N₀，透析膜内外溶液体积为(透析膜内体积+透析膜外体积)/2。

进一步地，拟合透析曲线的必要条件如下：

（1）物质经过透析作用随水分子进入外部透析液后，则与外部溶液混合均匀；

（2）5℃-35℃温度条件下，透析速率只与透析膜内外待透析物浓度差有关，透析速率常数为k；

（3）水分子可以自由透过透析膜，5℃-35℃温度条件下，水分子透过透析膜的速率只与透析膜本身性质有关；任意时刻由透析膜内向外透析的水溶液体积与由透析膜外向内透析的水溶液体积相等。

进一步地，拟合透析曲线的数学计算方法如下：

（a）当透析膜内外水溶液体积不同时，膜内初始体积为V，初始物质量为N₀，外部初始体积nV，n为透析膜内外水溶液体积比值，初始物质量为0；

dN/dt是物质透过透析膜的速率，某时刻透析膜内浓度与膜外浓度差值与物质透过膜速率关系，将公式[1]中的N_内、N_外以物质浓度表示：

透析t₁时间后，透析膜内物质量为N_t，带入公式[2]，得到公式[3]：

积分后得到公式[4]：

整理：

公式[5]代表：当透析膜外部透析液与透析膜内部体积比为n时，透析t₁时间后，透析膜内剩余被透析物的含量，以N_t表示；

（b）当透析膜内外溶液体积相等时；根据拟合透析曲线的必要条件3：任意时刻由透析膜内向外透析的溶液体积与由透析膜外向内透析的溶液体积相等，此条件下，透析速率可以用膜内外物质的含量表示，所以该拟合透析曲线可以简化为公式[6]：

整理得到：

公式[7]表示：当透析膜内外体积相等时，透析t₁时间后透析膜内剩余物质的量；

根据透析时间t₁、透析膜内部物质初始浓度N₀、各单位时间透析膜外部物质浓度N_t，利用Origin 8.0拟合计算在5℃-35℃条件下的k值。

进一步地，在解吸过程中，根据物质守恒定律，任意时间内，透析膜内物质与透析膜外物质含量之和为q₀，

代表每次更换透析液所检测的物质含量的和，N_in表示保留在透析膜内的物质 剩余量。

进一步地，根据透析方程所提出的3个解吸曲线假设条件：

（1）所透析的温度范围内，解吸量只与物质与EPS有关；

（2）物质透过透析膜到达外部透析液中，即认为物质从EPS中通过解吸去除；

（3）透析膜内的物质量要大于透析膜外的物质量，少量的物质到达外部透析液中，透析膜内外浓度差大，外部透析液中的物质不会向透析膜内迁移；

EPS解吸模型的建立基于所提到的解吸是物质从EPS中脱离并被透析到透析膜外部的过程，任意时刻，解吸速率dq/dt与解吸量q的关系式为公式[10]：

计算整理后得到公式[12]：

解吸方程中，为物质在一定温度下的解吸常数，q₀是EPS对物质的吸附量，也是物质 进行解吸时的最大物质量，q是t₂时刻物质的解吸量，t₂为解吸时间，进行多次透析时，公式 [12]计算下次透析的初始物质含量为经过计算的剩余物质含量；

透析t₁时间后，透析膜内部剩余物质总量，计为N₁，N₁为待降低内部物质含量的初始含量，更换与透析膜内等体积的透析液，等时间更换外部透析液，透析n’次，则内部剩余物质含量N’以公式[13]表示，计为：

计算当透析膜内部剩余总物质量为吸附量N吸附时，N吸附为待解吸的量，透析膜外部的解吸液更换n’’次，则N解吸可表示为公式：

。

进一步地，所述的透析膜预处理过程如下：将透析膜剪成20-25cm长，用大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和pH=8的1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液将透析膜煮沸10min，用无氧无氨水彻底洗净透析膜，后用上述乙二胺四乙酸二钠溶液再将透析膜煮沸10min，此时不可用手触碰透析膜；冷却后，将透析膜完全浸入无氧无氨水中，密封4℃保存；使用之前将透析膜用无氧无氨水洗干净，将内部装满水后排出，使用时留下1/3至1/2的空间，袋内加入预处理过的玻璃珠，使之悬浮于透析液内，所述的透析液为无氧无氨水。

EPS溶液的提取方法，具体步骤如下：

步骤1、取得污泥后，将污泥置于离心管内，于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤2、加入没过污泥体积的磷酸缓冲溶液，置于30度2h，然后于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤3、此时认为物质基质已经去除；

步骤4、然后取25-50ml体积的污泥，加入与污泥体积一样的无氧无氨水，密封置于超声发生器里；超声条件为频率为40KHz，温度为30℃，时间为30min；EPS经过超声提取后，9000rpm/min离心10min，用针管抽出上清液，并0.45um滤膜过滤；

步骤5、将过滤好的EPS置于透析膜中，封口置于无氧无氨水中透析，3h后更换一次无氧无氨水，隔夜前再更换一次无氧无氨水；

步骤6、测透析膜内物质的蛋白、多糖浓度；

步骤7、将其他EPS置于冰箱里冷冻，后用冷冻干燥器冷冻干燥，获得EPS粉末，于-20℃温度条件保存；

步骤8、每次称取10mg，配置到100ml无氧无氨水中，冷藏保存，以此溶液进行EPS吸附。

有益效果：本发明原理简单，操作方便，可同时对吸附物与被吸附物不宜分离的吸附-解吸体系进行吸附量和解吸量的计算，检测方法成本低。

附图说明

图1为本发明方法的示意图。图中，1、烧杯，2、无氧无氨水，3、夹子，4、透析袋，5、玻璃珠，6、转子，7、磁力搅拌器。

图2为实施例1中氨氮浓度为55.00±0.65 mgN/L的固定k值透析拟合线。

图3为实施例1中氨氮浓度为27.667±1.24和114.67±1.37 mgN/L的固定k值透析拟合线。

图4为实施例1中亚硝态氮浓度为52.91±0.72 mgN/L的固定k值透析拟合线。

图5为实施例1中亚硝态氮浓度为26.45±0.62和108.45±0.85 mgN/L的固定k值透析拟合线。

图6为实施例1中不同含量EPS对氨氮的吸附量。

图7为实施例1中不同含量EPS对亚硝态氮的吸附量。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

基于透析法的胞外聚合物对物质的吸附量和解吸量的计算方法，测定方法是利用透析膜透析已经吸附物质的EPS混合液，测定外部透析液物质的浓度，确定EPS的吸附量；更换透析膜外部透析液，测定外部透析液物质的浓度，利用公式计算取值的解吸量；所检测物质包括但不限于氨氮溶液和亚硝态氮；基于物质守恒计算EPS对物质的吸附量和解吸量。

具体步骤为：

步骤1、透析膜经过预处理后，用无氧无氨水清洗两次，用夹子将透析膜一侧夹住防止漏水，向透析膜中加入物质溶液和加重物，上端用同样的夹子夹住防止漏水，透析膜外部环境为与透析膜内部等体积的无氧无氨水溶液，所述的物质溶液包括但不限于氨氮溶液或者亚硝态氮溶液，以下以氨氮和亚硝态氮溶液为例，所述氨氮溶液的浓度为5-200mgN/L，所述亚硝态氮溶液的浓度为6-264mgN/L；所加入的加重物为透析膜的配重，载有物质溶液和加重物的透析膜悬浮或完全浸没在外部无氧无氨水的环境中，置于5℃-35℃温度条件进行透析，隔1h测定透析膜外部溶液中氨氮溶液或者亚硝态氮溶液的含量，并用Origin8.0拟合透析曲线；

步骤2、用相同浓度的氨氮溶液或亚硝态氮溶液为物质溶液，加入已知浓度的EPS溶液使总体积与第一步骤透析的物质溶液浓度和体积相同，夹子、加重物、外部环境与透析条件均与步骤1相同，隔2h测定透析膜外部溶液中的氨氮或者亚硝态氮含量，利用步骤1的拟合透析曲线，拟合最终外部透析液的氨氮溶液或亚硝态氮溶液物质的含量；则EPS对氨氮溶液或亚硝态氮溶液的吸附量为第一次拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度与加入EPS溶液后拟合透析曲线的拟合最终外部透析浓度之差；

步骤3、解吸实验前处理：将进行吸附检测完后的透析膜外部透析液更换为200 ml无氧无氨水，进行物质透出，间隔一段时间检测外部透析液物质含量，计算透析至透析膜外部的物质量。根据物质守恒定律，计算直至透析膜内部剩余物质含量等于EPS对物质的吸附量时，弃去外部透析液，更换40 ml无氧无氨水，进行解吸实验。此前处理步骤透析时间长，透析液体积大，可能重复多次。解吸实验：更换外部透析液为40 ml无氧无氨水，检测透析液内部物质含量，每间隔1 h检测透析到外部透析液的物质含量，因此时透析膜内物质浓度低，取样检测后，需要更换40 ml无氧无氨水，继续透析，再进行后续检测。根据公式计算被EPS吸附的物质的解吸量。

所述的已知浓度的EPS溶液是利用超声法提取的EPS溶液，经过冷冻干燥器处理，将EPS粉末于-20℃保存，每次称取10mg，配置到100ml无氧无氨水中，冷藏保存待用。

所述的拟合透析曲线：拟合透析曲线假设透析膜内物质溶液，如氨氮溶液或者亚硝态氮溶液物质初始含量为N₀，并且溶质伴随水穿过透析膜；根据物质守恒定律，任意时间内，透析膜内与透析膜外氨氮或者亚硝态氮量之和等于最初加入透析膜内的氨氮或者亚硝态氮的量，即为N₀。理论而言，透析无限长时间后，透析膜内外物质量均为1/2N₀，透析膜内外溶液体积为(透析膜内体积+透析膜外体积)/2。

拟合透析曲线的必要条件如下：

（1）：物质经过透析作用随水分子进入外部透析液后，则与外部溶液混合均匀；

（2）：5℃-35℃温度条件下，透析速率只与透析膜内外待透析物浓度差有关，透析速率常数为k；

（3）：水分子可以自由透过透析膜，5℃-35℃温度条件下，水分子透过透析膜的速率只与透析膜本身性质有关；任意时刻由透析膜内向外透析的水溶液体积与由透析膜外向内透析的水溶液体积相等。

拟合透析曲线的数学计算公式如下：

（a）当透析膜内外水溶液体积不同时，膜内初始体积为V，初始物质量为N₀，外部初始体积nV，n为透析膜内外水溶液体积比值，初始物质量为0；

dN/dt是物质透过透析膜的速率，某时刻透析膜内浓度与膜外浓度差值与物质透过膜速率关系，将公式[1]中的N_内、N_外以物质浓度表示：

透析t₁时间后，透析膜内物质量为N_t，带入公式[2]，得到公式[3]：

积分后得到公式[4]：

整理：

公式[5]代表：当透析膜外部透析液与透析膜内部体积比为n时，透析t₁时间后，透析膜内剩余被透析物的含量，以N_t表示。

（b）当透析膜内外溶液体积相等时；根据拟合透析曲线的必要条件3：任意时刻由透析膜内向外透析的溶液体积与由透析膜外向内透析的溶液体积相等，此条件下，透析速率可以用膜内外物质的含量表示，所以该拟合透析曲线可以简化为公式[6]：

整理得到：

公式[7]表示：当透析膜内外体积相等时，透析t₁时间后透析膜内剩余物质的量。根据透析时间t₁、透析膜内部物质初始浓度N₀、各单位时间透析膜外部物质浓度N_t，利用Origin8.0拟合计算在5℃-35℃条件下的k值。

N_吸附可表示为公式：

其中，N_物质代表透析膜内被吸附物，如物质溶液的含量，与N_EPS中该物质的含量相等，N_物质=N_EPS；k_物质、k_EPS为拟合透析曲线的k值；t₁为透析时间h；e为自然常数；

解吸检测法与吸附透析检测法一样，均为间接检测法。即对已经吸附物质的EPS进行解吸实验：更换外部透析液，透析至外部透析液的物质的量，就是能够解吸的量。根据物质守恒定律，解吸实验开始后，无论是否更换外部透析液，任意时间内，透析膜内物质与透析膜外物质含量之和为q₀。

代表每次更换透析液所检测的物质含量的和，N_in表示保留在透析膜内的物质剩 余量。

解吸实验所用的材料与吸附实验材料相同，步骤分为两步：第一步为初步透析：在进行吸附实验后，计算该条件下的吸附量，后将外部透析液更换成无氧无氨水进行物质初步透析，通过连续更换透析液的方法，将透析膜内物质透析出来。透析时长根据物质含量和待透析液的体积定，为4h-9h不等。检测更换的透析液内的物质量，当透析膜内部的总物质含量等于吸附的含量时，进行第二步解吸实验：将透析膜外部的透析液更换为40 ml无氧无氨水(与透析膜内加入的溶液而体积相等)，每隔一段时间取样后，更换透析膜外部透析液40 ml，检测每时间段透析出来的物质量，计算并拟合公式。

解吸曲线：根据透析方程所提出的3个假设条件：所透析的温度范围内，解吸量只与物质与EPS有关。物质透过透析膜到达外部透析液中，即认为物质从EPS中通过解吸去除。因为对此系统来说，透析膜内的物质量要大于透析膜外的物质量，少量的物质到达外部透析液中，透析膜内外浓度差大，外部透析液中的物质不会向透析膜内迁移。EPS解吸模型的建立基于所提到的解吸是物质从EPS中脱离并被透析到透析膜外部的过程，任意时刻，解吸速率dq/dt与解吸量q的关系式为公式[10]：

计算整理后得到公式[12]：

解吸方程中，为物质在一定温度下的解吸常数，q₀是EPS对物质的吸附量，也是物质 进行解吸时的最大物质量，q是t₂时刻物质的解吸量，t₂为解吸时间。进行多次透析时，公式 [12]计算下次透析的初始物质含量为经过计算的剩余物质含量。

可以利用公式对吸附量和解吸量进行计算：计算透析t₁时间后，透析膜内部剩余物质总量，计为N₁，N₁为待降低内部物质含量的初始含量，更换与透析膜内等体积的透析液，等时间更换外部透析液，透析n’次。则内部剩余物质含量N’以公式[13]表示，计为：

计算当透析膜内部剩余总物质量为吸附量N_吸附时，N_吸附为待解吸的量。透析膜外部的解吸液更换n’’次，则N解吸可表示为公式：

经过吸附-解吸双过程，最后N_解吸含量可以表示为公式：

其中N₀、t₁、t₂、n’、n’’已知，k、k_de可以根据拟合曲线计算得到。

根据公式[8]、公式[15]和已知变量，即可计算EPS对物质的吸附量和解吸量。

所述的加重物预处理：选取光滑玻璃珠，用没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去浸泡过玻璃珠的无水乙醇废液，再加入没过玻璃珠的无水乙醇浸泡10min，弃去废液，用去离子水冲洗干净，并用去离子水再浸泡10min，操作两次；后将玻璃珠置于105℃烘箱烘干，密封保存，备用；玻璃珠没有粒径要求。

所述的透析膜预处理：将透析膜剪成20-25cm长，用大体积的2%(W/V)碳酸氢钠和pH=8的1mmol/L 乙二胺四乙酸二钠溶液将透析膜煮沸10min，用无氧无氨水彻底洗净透析膜，后用上述乙二胺四乙酸二钠溶液再将透析膜煮沸10min，此时不可用手触碰透析膜；冷却后，将透析膜完全浸入无氧无氨水中，密封4℃保存；使用之前将透析膜用无氧无氨水洗干净，将内部装满水后排出，使用时留下1/3至1/2的空间，袋内加入预处理过的玻璃珠，使之悬浮于透析液内，所述的透析液为无氧无氨水。

所述的无氧无氨水：取大体积去离子水，用高纯氮气曝气15min，后密封保存，备用，现用现配。

EPS溶液的提取方法，具体步骤如下：

步骤1、取得污泥后，将污泥置于离心管内，于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤2、加入没过污泥体积的磷酸缓冲溶液，置于30度2h，然后于3000rpm/min离心10min，弃去上清液；

步骤3、此时认为物质基质已经去除；

步骤4、然后取25-50ml体积的污泥，加入与污泥体积一样的无氧无氨水，密封置于超声发生器里；超声条件为频率为40KHz，温度为30℃，时间为30min；EPS经过超声提取后，9000rpm/min离心10min，用针管抽出上清液，并0.45um滤膜过滤；

步骤5、将过滤好的EPS置于透析膜中，封口置于无氧无氨水中透析，3h后更换一次无氧无氨水，隔夜前再更换一次无氧无氨水；

步骤6、测透析膜内物质的蛋白、多糖浓度；

步骤7、将其他EPS置于冰箱里冷冻，后用冷冻干燥器冷冻干燥，获得EPS粉末，于-20℃温度条件保存；

步骤8、每次称取10mg，配置到100ml无氧无氨水中，冷藏保存，以此溶液进行EPS吸附。

实施例1

利用上述透析法对胞外聚合对氨氮和亚硝态氮的透析常数k值进行计算，所得结果见表1，图2-5。

表1 氨氮与亚硝态氮透析常数

其中实际底物平均浓度单位为mgN/L。

结合实际实验结果，当透析膜内氨氮底物浓度为55.00±0.65 mgN/L时，检测24 h透析出来的底物量，比底物浓度为27.667±1.24 mgN/L、114.67±1.37 mgN/L时，实际底物检测值更符合拟合得到的曲线与理论值，而且实验所测终点值更接近并略大于初始底物浓度的一半。氨氮为27.667±1.24 mgN/L进行透析，一部分第12 h和第24 h的检测数值，出现比理论值低的情况。氨氮底物浓度为114.67±1.37 mgN/L时，也存在第24 h数据比理论数据终点低的情况。底物浓度为55.00±0.65 mgN/L所进行的透析实验更为稳定。与其他底物浓度相比，氨氮55.00±0.65 mgN/L时，透析9 h的所得测透析膜内部底物量与24 h基本接近，故拟合透析曲线时，以第9 h的剩余底物量代替时间无穷大时的底物量进行计算，k=0.16157。

检测亚硝态氮k值，底物浓度为52.91±0.72 mgN/L所拟合得到的曲线，虽然实验所测终点值与拟合曲线终点值有一定差别，但实验所测终点值更贴近底物浓度的一半。亚硝态氮浓度为26.45±0.62 mgN/L的时候，1-6 h透析膜内剩余浓度偏直线，并且24 h终点处的检测结果偏差较大。亚硝态氮浓度108.45±0.85 mgN/L进行透析，因为透析膜内外底物浓度差距大，透析速度快，4-6 h所透析到外部的底物浓度较高，而实际透析并没有在此短时间能够达到平衡。底物浓度为52.91±0.72 mgN/L的亚硝态氮透析12 h所得测透析膜内部底物量与24 h基本接近，故拟合透析曲线时，以第12 h的剩余底物量代替时间无穷大时的底物量进行计算，k=0.08154。

对氨氮和亚硝态氮进行吸附量计算。改变EPS溶液体积，配置100 mgN/L底物溶液，按照需要配置透析液，透析膜内底物量：1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mL，以浓度计为2.5，5.0，12.5，25.0，50.0 mgN/L，pH为7。所添加的EPS溶液体积需经计算，使添加的蛋白质的质量为4.359±0.003 mg、6.538±0.003 mg、8.717±0.003 mg。每个EPS溶液进行不同底物量的吸附平行实验，添加无氧无氨水使透析膜内底物溶液的总体积为40 ml，进行透析吸附检测。实验条件设置为模拟自然环境与污水处理厂所处的适宜厌氧氨氧化菌生长的环境条件，实验设计最高氨氮或亚硝态氮底物浓度均为50.0 mgN/L，最低底物浓度为2.5 mgN/L。吸附量计算见图6-7。