阅读说明：本技术 一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法 (Method for passively monitoring antibiotic content in aquaculture water in situ ) 是由 李娟英 文聚 陈以芹 郑儒懿 盛博维 于 2019-10-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法,采用XDA-1树脂作为吸附膜材料、以琼脂糖凝胶作为扩散膜材料,将制得的吸附膜、扩散膜和聚醚砜圆状过滤膜组装成DGT装置,通过该装置实现对养殖水体中抗生素的吸附并监测其浓度。XDA-1树脂材料结构稳定、孔隙度高、比表面积大、吸附容量大,对养殖水体中抗生素吸附效果佳,所需时间短,监测结果准确,弥补了瞬时主动采样法浓度监测的不连续性以及误差较大的不足,适用于现场实际环境温度为15-25℃的养殖水体低浓度抗生素监测,且可大范围推广,解决了养殖水体中抗生素浓度传统监测方法中耗时长、流程复杂和成本高等难题。(The invention discloses a method for passively monitoring the content of antibiotics in a culture water body in situ, which adopts XDA-1 resin as an adsorption membrane material and agarose gel as a diffusion membrane material, assembles the prepared adsorption membrane, diffusion membrane and polyether sulfone circular filter membrane into a DGT device, and realizes the adsorption of the antibiotics in the culture water body and monitors the concentration of the antibiotics by the DGT device. The XDA-1 resin material has a stable structure, high porosity, a large specific surface area, a large adsorption capacity, a good antibiotic adsorption effect on the aquaculture water, short required time and accurate monitoring result, overcomes the defects of discontinuity and large error of concentration monitoring by an instantaneous active sampling method, is suitable for monitoring the low-concentration antibiotic of the aquaculture water with the field actual environment temperature of 15-25 ℃, can be popularized in a large range, and solves the problems of long time consumption, complex flow, high cost and the like in the traditional monitoring method for the concentration of the antibiotic in the aquaculture water.)

一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法

技术领域

本发明属于养殖水体监测技术领域，具体涉及一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法。

背景技术

抗生素用于养殖水体时，仅有小部分能被水生生物吸收利用，剩余的大量抗生素以原形或代谢物的形式残留在养殖环境中或随着养殖废水的排放进入自然水体环境中，长期存在的抗生素残留会诱导微生物和细菌产生耐药性，会给水生动植物甚至人体健康带来威胁。目前，传统的抗生素监测方式大多是主动采集瞬时水样经固相萃取后上机测定，该方法主动采样，样品浓度具有瞬时性，测定结果无法反应养殖水体中的抗生素实际浓度的变化，且测定过程费时费力，测定结果不连续，重复性较差。

薄膜扩散梯度技术(DGT)根据菲克第一扩散定律，将DGT装置置于养殖水体中，通过对抗生素在特定时间内穿过特定厚度扩散膜的某一离子进行定量化测量及其缓冲动力学过程的研究、计算而获得某一离子的浓度值。目前DGT应用于河流、海水和污水厂中抗生素的监测，DGT应用于实际环境的中扩散系数D表示单位时间内环境中抗生素通过DGT扩散膜的通量，而养殖水体中扩散系数D尚未被表征。

目前DGT监测抗生素的技术主要有两种：(1)一种是以XDA-18树脂作为吸附膜材料，但存在吸附容量小等缺陷；(2)另一种方法是利用PCM(从MOF多孔碳中提取出的材料)为材料制成的吸附膜。该吸附膜虽吸附容量大，但是吸附速率较慢，用于野外实际监测时间较长，需放置7天左右。

因而，提出新的可以克服上述缺点的养殖水体中抗生素的采样和监测技术极其重要，同时表征DGT应用于养殖水体中扩散系数也可用于实际养殖水体中抗生素浓度的计算，具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，本发明公开了一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法，采用XDA-1树脂作为吸附膜材料，以琼脂糖凝胶作为扩散膜材料，将制得的吸附膜、扩散膜和聚醚砜圆状过滤膜组装成DGT装置，通过其对养殖水体中抗生素的吸附实现监测抗生素浓度的功能。其中，XDA-1树脂材料结构稳定、孔隙度高、比表面积大、吸附容量大，对养殖水体中抗生素吸附效果佳，所需时间短，监测结果准确，弥补了瞬时主动采样法浓度监测的不连续性以及误差较大的不足，适用于现场实际环境温度为15-25℃的养殖水体中低浓度抗生素的检测，解决了养殖水体中抗生素浓度传统监测方法中耗时长、流程复杂和成本高等难题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

本发明的第一方面，用于原位被动监测养殖水体中抗生素含量的DGT装置，包括：位于两侧的DGT外壳和依次为吸附膜、扩散膜和过滤膜的复合模夹层，且所述吸附膜、扩散膜和过滤膜为圆片状且内径相同，其厚度比为0.28:1.6:1；其中：

所述过滤膜为聚醚砜圆状滤膜；

所述扩散膜通过以下制备方法得到：将琼脂糖和超纯水按比例混合后以40℃/min的速度加热升温至400℃，恒温保持至溶液透明，得到浓度为1.5％的热琼脂糖溶液，迅速将其灌注入玻璃模具中，冷却至室温后切成若干圆片，并存放于盛有超纯水的培养皿中于4℃保存；

所述吸附膜通过以下制备方法得到：XDA-1树脂依次经超纯水和甲醇洗涤、超纯水冲洗和无尘纸吸干水分，研磨过200目筛后与所得浓度为1.5％的热琼脂糖溶液按质量体积比为1:10混合均匀，迅速将其灌注入玻璃模具中，冷却至室温后切成若干圆片，并存放于盛有超纯水的培养皿中于4℃保存。

进一步，所述过滤膜是直径为25mm、厚度为0.14mm和孔径为0.45um的聚醚砜圆状滤膜。

进一步，所述扩散膜的内径为25mm，厚度为0.8mm，质量为0.377～0.383g。

进一步，所述吸附膜的内径为25mm，厚度为0.5mm，质量为0.249～0.251g。

进一步，所述DGT外壳经甲醇冲洗并浸泡在纯水中，使用时用无尘纸将纯水吸干得到。

本发明的第二方面，一种原位被动监测养殖水体中抗生素含量的方法，通过上述DGT装置进行原位被动监测养殖水体中抗生素含量，包括以下步骤：

(ⅰ)将若干个所述DGT装置置于若干个抗生素浓度保持在0.27ng/mL～0.33ng/mL、pH值在7.0～8.5的养殖水体容器中，用锡纸密封包装后放置在转速为120～140r/min的25℃恒温摇床中，分别于1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h和6h取出每个容器内的某个DGT装置，取出吸附膜；

(ⅱ)将取出的吸附膜置于装有甲醇溶液的洗脱试管中超声15～20min，去除吸附膜，将洗脱液氮吹浓缩至50ul(V_e)，测定洗脱液中抗生素的浓度值(C_e)；

(ⅲ)先通过式(1)计算吸附膜上的累积量M，根据抗生素在吸附膜上的累积量M随着时间变化得出一条线性关系，通过线性拟合得出斜率α，再根据式(2)计算DGT装置在养殖水体中的扩散系数(D)，表征单位时间内养殖水体中抗生素穿过扩散膜的通量；其中：

式(1)的洗脱效率

式中：

Ce为洗脱液浓缩后检测出的抗生素浓度；

Ve为50ul；

式(2)的扩散系数

式中：

α为抗生素的量(ng)在吸附膜中随时间(s)积累的线性回归斜率；

△g为扩散膜的厚度(cm)；

A为扩散膜的面积(cm²)；

C为抗生素水溶液的浓度(ng/mL)。

上述方法所得DGT在养殖水体中的扩散系数D，表征单位时间内养殖水体中抗生素穿过扩散膜的通量，将1L浓度为0.3ng/mL的抗生素水溶液过固相萃取柱测定结果为吸附前浓度(C_SOLN)。

所述抗生素为喹诺酮类抗生素和磺胺类抗生素，包括磺胺间甲氧嘧啶、氧氟沙星、磺胺甲恶唑、磺胺甲嘧啶、氟罗沙星、甲氧苄啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺多辛、磺胺吡啶、磺胺二甲氧嗪和磺胺氯哒嗪。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明以XDA-1树脂作为吸附膜材料、琼脂糖凝胶作为扩散膜材料，将制得的吸附膜、扩散膜和聚醚砜圆状过滤膜组装成DGT装置。其中XDA-1树脂具有结构稳定、孔隙度高、比表面积大、吸附容量大等显著特点，对养殖水体中抗生素进行吸附，吸附效果佳。

(2)本发明中，原位吸附效果的高稳定性且同时受环境pH和离子强度等条件影响较小，不仅保障监测结果准确，还可以通过吸附膜的高容量实现对低浓度抗生素的检测，XDA-1树脂作为吸附材料对环境没有危害，原料易得，制作简单，适合推广应用。

(3)本发明不仅填补用于原位被动监测养殖水体中低浓度抗生素含量的空白，而且可以在短时间内达到监测效果，所测得的扩散系数可通过使用公式校准，适用于15-40℃的实际养殖水体中。

附图说明

图1是DGT装置中检测浓度(C_DGT)与传统方法检测浓度(C_SOLN)的比值(水溶液起始浓0.3ng/mL，t＝6h)。

图2是DGT装置的结构示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

用于原位被动监测养殖水体中抗生素含量的DGT装置，包括：位于两侧的DGT外壳和依次为吸附膜、扩散膜和聚醚砜圆状过滤膜的复合模夹层，且吸附膜、扩散膜和过滤膜为圆片状且内径相同，其厚度比为0.28:1.6:1。过滤膜(聚醚砜圆状滤膜，直径25mm，厚度0.14mm，孔径0.45um)和DGT外壳。聚醚砜圆状滤膜与DGT外壳均是商品，XDA-1树脂和琼脂糖均是常见商品。

上述扩散膜通过以下制备方法得到：称取0.60g琼脂糖置于100mL的烧杯中，并加入40mL的超纯水，然后将其以40℃/min的速度加热升温至400℃，直至整个溶液透明，制备成1.5％热琼脂糖溶液，然后趁热立即将其注入间隔0.8mm的玻璃模具中。该模具选用规格为长15cm、宽8cm的两片白玻璃片，中间用预先裁剪成凹字型的聚四氟乙烯薄板隔开以控制膜的厚度为0.8mm，模具三面用夹子夹紧，留一面用于灌注。热琼脂糖溶液灌注后冷却至室温，去掉玻璃，再选用内径25mm的不锈钢圆形刀将冷却后扩散膜切成圆状形，并将膜存放在盛有超纯水的培养皿中，置于4℃冰箱中保存，每片扩散膜的质量控制在0.38±0.003g。

上述吸附膜通过以下制备方法得到：吸附膜材料XDA-1树脂使用前先用超纯水充分洗涤，然后使用少量甲醇浸泡10～20分钟，重复1～2次后用超纯水冲洗并用无尘纸吸干水分，然后将其研磨并过200目筛，存放在100mL的烧杯中。取质量为1g的XDA-1树脂，与S1中所制得的10mL热琼脂糖溶液(1.5％)混合均匀，趁热立即注入玻璃模具中，制备吸附膜(除了膜的厚度为0.5mm，其他模具、方法一致)。选用内径25mm的不锈钢圆形刀将吸附膜切成圆状形，并将膜存放在装有超纯水的培养皿中，置于4℃冰箱中保存，每片吸附膜的质量控制在0.25±0.01g。

组装前，DGT外壳需用甲醇冲洗，之后浸泡在纯水中。使用时，用无尘纸将DGT外壳的水吸干。将DGT底座置于台面上，用塑料镊子按顺序依次将吸附膜、扩散膜和过滤膜叠放在底座上，然后将外壳盖盖上。用掌心力量，均匀施力按压或者是用双手大拇指按住两侧同时按压，即可制得DGT装置。制备完成后，放入装有超纯水的烧杯中，置于4℃冰箱中保存。

实施例

配制浓度0.3ng/mL的抗生素溶液1L，用盐酸或氢氧化钠(1mol/L)调节pH值在7.0～8.5之间。将11个DGT同时分别部署在11个装有1L浓度为0.3ng/mL抗生素水溶液的烧杯中，每个烧杯用锡箔纸包好(防止抗生素的光降解)，同时放置在转速为120～140r/min的25℃恒温摇床中，分别于1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h取出一个DGT装置。用锥子对准DGT的开口轻轻撬开，取出吸附膜。随后将吸附膜置于装有10mL甲醇溶液的洗脱试管中，超声15～20min后，去除吸附膜，将洗脱液氮吹浓缩至50ul(V_e)，测定洗脱液中抗生素的浓度值(C_e)，再根据公式(2)计算出DGT在养殖水体中的扩散系数D，表征出单位时间内养殖水体中抗生素的穿过扩散膜的通量。同时用传统方法测定烧杯中抗生素的浓度。

过程中定期补充水溶液中的目标化合物，使其浓度稳定保持在0.27～0.33ng/mL之间，装有1L浓度为0.3ng/mL的抗生素水溶液过固相萃取柱(即SPE柱)，测定结果为吸附前浓度(C_SOLN)。

效果例

取出DGT装置后，吸附膜置于装有10mL甲醇溶液的洗脱试管中，超声15～20min后，去除吸附膜，氮吹浓缩，测试洗脱液浓度值，计算洗脱效率如表1所示。

表1：吸附膜上抗生素的洗脱效率(％)

抗生素	洗脱效率
		磺胺间甲氧嘧啶	83.7±7.1
氧氟沙星	88.5±5.4
		磺胺甲恶唑	83.0±5.4
磺胺甲嘧啶	84.1±1.2
		氟罗沙星	72.2±5.3
甲氧苄啶	85.5±3.9
		磺胺甲基嘧啶	83.2±6.7
磺胺多辛	84.7±4.6
		磺胺吡啶	86.1±3.3
磺胺二甲氧嗪	84.8±5.8
		磺胺氯哒嗪	85.1±6.2

式(1)：洗脱效率其中：

Ce为洗脱液浓缩后检测出的抗生素浓度；

Ve为再溶解(复溶)的体积50ul。

利用公式(1)计算出吸附膜上的累积量M，根据抗生素在吸附膜上累积量M随着时间的变化可以得出一条线性关系，通过线性拟合得出斜率α，如表2所示。

表2：25℃下吸附膜对抗生素的累积量随时间的线性拟合斜率

式(2)：扩散系数其中：

α为抗生素的量(ng)在吸附膜中随时间(s)积累的线性回归的斜率；

△g为扩散膜的厚度(cm)；

A为扩散膜的面积(cm²)；

C为抗生素水溶液的浓度(ng/mL)。

利用(2)计算出水溶液中抗生素的扩散系数(D)，如表3所示。

表3：25℃下水溶液中抗生素的扩散系数(单位：cm²/s)

抗生素	扩散通量
		磺胺间甲氧嘧啶	1.86521×10<sup>-5</sup>
氧氟沙星	5.80×10<sup>-6</sup>
		磺胺甲恶唑	1.1516×10<sup>-5</sup>
磺胺甲嘧啶	1.0565×10<sup>-5</sup>
		氟罗沙星	1.02801×10<sup>-5</sup>
甲氧苄啶	1.9102×10<sup>-4</sup>
		磺胺甲基嘧啶	8.9618×10<sup>-6</sup>
磺胺多辛	9.7819×10<sup>-6</sup>
		磺胺吡啶	1.13478×10<sup>-5</sup>
磺胺二甲氧嗪	8.42×10<sup>-6</sup>
		磺胺氯哒嗪	1.17851×10<sup>-5</sup>

在单位时间内通过垂直于扩散方向的单位截面积的扩散物质流量，称为扩散系数D。得出扩散系数D后，根据已知的参数(式3)，便可计算出C_DGT。

式(3)：

其中：

M为吸附膜上累积抗生素的质量(ng)；

△g为扩散膜的厚度(cm)；

δ为扩散边界层的厚度(cm)；

D为扩散系数(cm²/s)；

A为扩散膜面积(cm²)；

t为DGT放置的时间(s)。

同时，为适用于实际的现场应用，可通过温度对扩散系数进行校正：

式(4)：

其中：

t为实际养殖水体中的温度(℃)；

D₂₅为25℃条件下测得的扩散系数；

D_t为实际养殖水体中的扩散系数。

表征的扩散系数D可应用于实际养殖水体中2～6小时时间段的计算(图2)。以6小时为例，根据之前表征出DGT在养殖水体中扩散系数，带入公式(3)计算可得出，在0.8＜C_DGT/C_SOLN＜1.2之间，即说明DGT监测养殖水体中抗生素浓度的准确性，相比较传统主动采样法监测得出的数据更具有代表性。