一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光pcr测试联合试剂盒
阅读说明：本技术 一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光pcr测试联合试剂盒 (One-stop full-automatic closed nucleic acid extraction and real-time fluorescence PCR test combined kit ) 是由 张辉 于 2020-03-30 设计创作，主要内容包括：本专利公开了一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒,为注塑成型的一体结构,包括加样口(A)、裂解室(C1)、吸附及洗脱室(C2)、废液室(C3)、洗脱剂室(C4)、荧光PCR室(C5)和切换阀(VT1)；切换阀(VT1)控制吸附及洗脱室(C2)与裂解室(C1)和废液室(C3)或者与洗脱剂室(C4)和荧光PCR室(C5)的连通。本专利的联合试剂盒,可以保证整个核酸提取过程和实时荧光PCR检测过程,全部在全封闭的试剂盒内完成,避免传了统自动核酸提取流程中和PCR测试加样过程中存在的气溶胶污染,导致的生物泄露和样品交叉污染风险。(The patent discloses a one-stop full-automatic closed nucleic acid extraction and real-time fluorescence PCR test combined kit, which is an injection molding integrated structure and comprises a sample adding port (A), a cracking chamber (C1), an adsorption and elution chamber (C2), a waste liquid chamber (C3), an eluent chamber (C4), a fluorescence PCR chamber (C5) and a switching valve (VT 1); the switching valve (VT1) controls the communication of the adsorption and elution chamber (C2) with the lysis chamber (C1) and the waste liquid chamber (C3) or with the eluent chamber (C4) and the fluorescent PCR chamber (C5). The combined kit can ensure the whole nucleic acid extraction process and the real-time fluorescence PCR detection process, and can be completely completed in a totally-enclosed kit, so that aerosol pollution in the traditional automatic nucleic acid extraction process and the PCR test sample adding process is avoided, and the biological leakage and sample cross contamination risks are avoided.)
技术领域
本专利涉及分子生物学中核酸提取及PCR扩增及实时荧光检测技术，具体地说，是一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒。
PCR核酸检测技术基于上个世纪80年代由美国的凯利·莫里斯发明的一种核酸扩增技术的一种分子生物检测技术，这种技术利用不同物种生物DNA/RNA不同的特 异序列，来鉴别生物细胞的种类，凯利.莫里斯本人，凭借这一技术发明，获得了1993 年诺贝尔奖。这种技术在现代医学上，被用广泛于微生物病原体的种类鉴别，具有精 度高，速度快，通量大的特点，越来越受到人们的重视。
现在的PCR医学检测技术，随着荧光实时检测技术和微流控芯片检测技术与PCR技术的结合，现在的PCR检测技术，已经从传统的阴/阳性定性检测，过渡到可以精确定量检测样品中核酸含量的水平，这种检测技术可以为医学诊断，治疗跟踪，病史发展，流行病追踪等分析，提供一手的量化分析数据，是目前疾病控制，医学治疗和诊断的得力助手。
目前欧美发达国家和中国国内，都非常重视PCR检测仪器以及试剂盒的开发。主流的核酸检测技术，是实时荧光PCR检测技术。该技术的操作流程分为采样，核酸提取和实时荧光PCR检测三个步骤。PCR试验仪器的开发技术，也是主要面向这3个环节的应用仪器。
PCR技术，是通过试剂作用在样品上，通过PCR循环，达到样品内核酸自我复制的目的。每一个PCR循环，样品内的核酸，通过自我复制，浓度会翻一倍。这种生物放大技术，使得样品中的核酸在n个循环后，会复制出2^n倍。所以，原则上采用PCR技术，其检测精度，可以达到一个细胞的分辨率水平，这样的高精度，即是PCR检测技术的优势，也是这一技术的缺陷，因为，如果样品测试环境中，存在的气溶胶中，有一个细胞的污染样品，也会导致检测结果失效。
而在目前国际上流行的最先进的核酸自动提取设备的技术方案中，为了保证转移和搅拌磁珠的磁棒可以自由进出各个腔室，所有腔室的空间都是开放的，在提取流程中，高温加热和高频机械振动搅拌，都会成大量的气溶胶，对试验环境造成污染，甚至会导致生物泄露事故。
所以，标准的PCR实验室，对于实验环境控制要求非常高，需要特殊的设备，形成试验环境的层流和正压，通过实验室环境的严格控制，来保证试验免受气溶胶的污染影响。这就导致，PCR核酸测试，只有在环境控制严格的高成本实验室中才能稳定运行。
总结抗击新冠肺炎疫情以来的经验教训，可以得出以下结论:
1. 核酸检测方案，被确定为，病毒类感染疫情病源确诊检测的标准检测手段；
2. 面对人传人疫情突然急速爆发，大量疑似病人累积待检的情况，检测确诊手段，是控制控制疫情发展的重要环节，保证海量的疑似病人，可以得到快速，准确的检测确诊，是控制疫情进一步扩散的必要条件；
3. 虽然核酸检测技术，以其灵敏度高，检测速度快，检测通量大等特点，被确定为本次抗击疫情的核心检测手段，但是在抗击疫情过程中，也暴露出一些缺点：
（1）检测速度慢：
尽管核酸检测的速度，已经远远高于其他经典的病原体检测方法，但是，面对海量的疑似病例检测，仍然显得太慢，面对爆发的疫情，医生需要一个更加快速的核酸检测系统；
（2）检测实验室环境要求高
经典的核酸检测流程，在核酸提取阶段，都是开放式操作，由于核酸提取过程中，需要液体样品进行高频振动搅拌和加热，这些操作都会产生含有检测病原体的气溶胶，这些气溶胶如果弥散在试验环境里，会造成：a）生物泄露风险；b)检测样品之间的交叉污染，形成干扰检测结果风险；为了应对这些风险，核酸检测实验室，必须具备层流通风和生物安全设备，以及严格的生物安全控制流程，这就对了测试实验室，以及管理规范，操作人员提出了很高的要求，这就限制了具备检测能力的实验室数量，形成制约检测能力的瓶颈；
由于检测完成后的废弃物中，仍然会有病原体残留，这就就对检测过程中每一步操作产生的废弃物，依据严格的操作规范，进行防泄漏处理；
以上原因，要求核酸检测实验室除了要配备全流程的昂贵样品处理和测试设备外，还要具备非常高的防止生物泄露和交叉污染的环境条件，非常严格的操作和管理规范，非常专业的操作人员，这就使得具备以上条件的实验室很少，形成检测能力的瓶颈，在面对海量疑似检测病例的时候，就力不从心了；
（3）急需一种可以野外进行的现场核酸检测技术手段：
在疫情发展过程中，发现，在疑似病例得到确诊之前，居家隔离是比集中隔离有效的多的隔离手段，它可以有效降低疑似病例之间的交叉感染风险，同时可以保证被隔离的疑似病人有一个比较好的生活环境，有利于未感染的疑似病人的恢复；随着疫情的爆发，居家隔离的病例不断增加，为了有效管控隔离人群，并且对病人污染的生活区进行监测，亟需开发一种可进行现场快速检测的设备，对这种设备有以下要求：
（a）可电池供电/或车载运行，便携；
（b）一键运行，操作简便，对人员要求低；
（c）可以在现场/野外试验环境下，正常运行；
（d）测试全流程封闭自动化运行，不会发生气溶胶和废弃物导致的生物泄露和样品交叉污染风险；
（e）操作简单：样品加载后，从核酸提取，到PCR扩增，荧光实时检测，全流程在封闭的环境中自动化完成，一键操作，中间过程，不需要人为干预，不需要暴露样品；
（f）运行成本低，结构简单，一体化，全流程由一台设备完成，不需要辅助设备；
（g）不需要高要求的实验室环境，就能有效控制生物泄露/交叉污染风险，且无气溶胶污染和废弃物污染；
（h）不需要高技能的操作人员。
发明内容
本专利的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR联合试剂盒，可以保证整个核酸提取过程和实时荧光PCR检测过程，全部在全封闭的试剂盒内完成，在样品提取过程中和PCR测试过程中，没有任何被测样品，或者含有样品的气溶胶会溢出到试剂盒之外，避免传了统自动核酸提取流程中和PCR测试加样过程中，存在的气溶胶污染，导致的生物泄露和样品交叉污染风险。
本专利所述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述联合试剂盒为一体结构，包括加样口A、裂解室C1、吸附及洗脱室C2、废液室C3、洗脱剂室C4、荧光PCR室C5和切换阀VT1，连通各个腔室的管道以及控制流体流向的单向阀，维持压力平衡的通气阀，驱动液体流动的活塞PT，磁珠，其中：
所述裂解室C1中预存裂解液；
所述吸附及洗脱室C2中预存有用于吸附核酸的磁珠，所述吸附及洗脱室内设置有活塞PT；活塞PT与吸附及洗脱室C2的内壁滑动密封接触；
所述洗脱剂室C4中预存有洗脱液；
所述荧光PCR室C5中预存有PCR试剂；
所述加样口A和裂解室C1之间设置有加样通道AH；
所述切换阀VT1的第一进液口、第二出液口、第三进液口、第四出液口分别通过第一通道CH1、第二通道CH2、第三通道CH3、第四通道CH4与裂解室C1、废液室C3、洗脱剂室C4、荧光PCR室C5连通；
所述切换阀VT1的第一工作口、第二工作口均与吸附及洗脱室C2相通；第二工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1；
当切换阀VT1的阀芯处于不同的工作位置时，第一进液口、第二出液口或者第三进液口、第四出液口与第一工作口、第二工作口相通；
所述加样通道AH、第一通道CH1、第二通道CH2、第三通道CH3、第四通道CH4上分别设置有阻止流体逆流的单向阀；
所述废液室C3和洗脱剂室C4的顶端分别设置有维持腔室压力平衡的通气阀；
所述洗脱剂室C4和荧光PCR室C5之间设置有连通管道，且该连通管道上设置有通气阀。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述切换阀VT1还包括第三工作口、第四工作口，第三工作口、第四工作口均与吸附及洗脱室C2相通；第四工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的第二过滤器F2；
当切换阀VT1的阀芯处于不同的工作位置时，第一进液口、第二出液口分别与第一工作口、第二工作口相通，或者第三进液口、第四出液口分别与第三工作口、第四工作口相通。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述活塞PT上连接有活塞杆BA，所述吸附及洗脱室的顶端开设有安装口，所述活塞杆上下移动地设置所述安装口内。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述切换阀VT1位于所述吸附及洗脱室C2的下方。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述联合试剂盒采用相连的多个，用以并行测试多个独立样品。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述荧光PCR室C5采用恒温热板PCR反应技术。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述荧光PCR室C5为扁平PCR反应试管。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述联合试剂盒开封使用时，初始状态下，试剂盒内部的切换阀VT1的阀芯位于初始的工作位置，此时所述第一通道CH1、第二通道CH2分别通过第一进液口和第一工作口、第二出液口和第二工作口与吸附及洗脱室C2相通，所述第三通道CH3和第四通道CH4均与吸附及洗脱室C2截止；
在核酸提取流程进展到洗脱阶段时，切换阀VT1的阀芯移动到另一个工作位置，此时所述第一通道CH1和第二通道CH2均与吸附及洗脱室C2截止，所述第三通道CH3和第四通道CH4分别通过第三进液口和第一工作口、第四出液口和第二工作口与吸附及洗脱室C2相通。
上述的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，所述联合试剂盒开封使用时，初始状态下，试剂盒内部的切换阀VT1的阀芯位于初始的工作位置，此时所述第一通道CH1、第二通道CH2分别通过第一进液口和第一工作口、第二出液口和第二工作口与吸附及洗脱室C2相通，所述第三通道CH3和第四通道CH4均与吸附及洗脱室C2截止；
在核酸提取流程进展到洗脱阶段时，切换阀VT1的阀芯移动到另一个工作位置，此时所述第一通道CH1和第二通道CH2均与吸附及洗脱室C2截止，所述第三通道CH3和第四通道CH4分别通过第三进液口和第三工作口、第四出液口和第四工作口与吸附及洗脱室C2相通。
本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，采用可以注塑成型的一次性联合试剂盒，其中包埋了了连通各个腔室的管路，切换和防止逆流的单向阀，以及预存了裂解液，吸附磁珠和洗脱液，核酸提取操作和PCR测试完成后，所有中间过程的废弃物和最终反应产物，均封存在密封的联合试剂盒中，没有生物泄露的风险，废弃处理流程方便、简单、低成本。与现有技术相比，本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，具有以下优点：
（1）一站式操作，核酸检测群流程，一站式全自动完成；
（2）一键式测试操作，操作简单，对人员要求低；
（3）全封闭运行，测试过程全封闭，没有气溶胶导致的生物泄露和样品交叉污染的风险；试验中间规程的废弃物，也存储在用过的试剂盒中，没有环境污染和生物泄露的风险；
（4）快速，采用专利申请号为CN202010105445.1的恒温热板PCR反应技术，节省了变温平台升降温的时间，测试速度，比经典的PCR方法快一倍以上；
（5）高灵敏度，采用专利申请号为CN202010106989.X的扁平PCR反应试管，将荧光测试的通光孔径扩大一倍，反应面积扩大4倍，大大增加荧光检测的灵敏度；
（6）便携，可现场测试，可实现常规核酸检测无法实现的，检疫现场快速检测的需求；
（7）低运行成本，一台仪器，就是一个核酸检测实验室，不需要专用的高成本核酸检测实验室，也不需要专业培训的操作人员，大大降低测试运行成本，提高检测速度和效率。
所述活塞PT上连接有活塞杆BA，测试过程中活塞杆BA与测试设备的活塞驱动机构连接，该机构驱动活塞上下移动，提供测试过程中，样品液体在各个腔室之间移动的动力。
所述包埋在试剂盒中的切换阀VT1的阀芯拨杆与测试设备的驱动装置连接，在测试过程中，测试设备可以通过驱动切换阀的阀芯移动，来选择第一通道CH1和第二通道CH2与吸附及洗脱室C2的导通/第三通道CH3和第四通道CH4与吸附及洗脱室C2的截止，或者反过来。
采用这种联合试剂盒的核酸检测设备（PCR工作站），可以实现核酸提取和实时荧光PCR检测的全自动检测，整个测试操作流程全部在全封闭的一体化联合试剂盒内部进行，不存在传统检测过程中，产生的气溶胶污染设备和实验室，以及并行测试样品产生交叉污染的可能性。实现一台检测设备，就是一个核酸检测实验室的目标。
附图说明
图1为本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒的外部结构示意图；
图2为本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒的工作原理示意图。
图3为本专利的另一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒的工作原理示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本专利的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
请参阅图1和图2，本专利的最佳实施例，一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，为注塑成型的一体结构，联合试剂盒包括加样口A、裂解室C1、吸附及洗脱室C2、废液室C3、洗脱剂室C4、荧光PCR室C5和切换阀VT1。
加样口A、裂解室C1、吸附及洗脱室C2、废液室C3、洗脱剂室C4和荧光PCR室C5从左至右依次设置；裂解室C1中预存裂解液；吸附及洗脱室C2中预存有用于吸附核酸的磁珠，吸附及洗脱室C2内设置有活塞PT，活塞PT上连接有活塞杆BA，测试过程中，活塞杆BA与测试设备（如快速PCR工作站等测试设备）的活塞驱动机构连接，该驱动机构可以通过活塞杆BA驱动活塞PT在吸附及洗脱室C2内上下运动，为测试过程中相应步骤的液体在对应的腔室之间转移提供动力。
洗脱剂室C4中预存有洗脱液；荧光PCR室C5中预存有PCR试剂；荧光PCR室C5采用专利申请号为CN202010105445.1的恒温热板PCR反应技术，节省了变温平台升降温的时间，测试速度，比经典的PCR方法快一倍以上；荧光PCR室C5可以是专利申请号为CN202010106989.X的扁平PCR反应试管，将荧光测试的通光孔径扩大一倍，反应面积扩大4倍，大大增加荧光检测的灵敏度。
加样口A和裂解室C1之间设置有加样通道AH，加样通道AH上设置有只允许液体向裂解室C1内流动的单向阀V6。
切换阀VT1包埋在试剂盒中，用以在相应的实验步骤时，控制连接相应腔室的第一通道CH1、第二通道CH2、第三通道CH3、第四通道CH4的切换。
切换阀VT1上部从左到右分别有与吸附及洗脱室C2相通的第一工作口、第二工作口、第四工作口、第三工作口，第二工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1，第四工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的第二过滤器F2。
切换阀VT1下部从左到右分别有第一进液口、第二出液口、第四出液口、第三进液口，第一进液口、第二出液口、第四出液口、第三进液口分别通过第一通道CH1、第二通道CH2、第四通道CH4、第三通道CH3与裂解室C1、废液室C3、荧光PCR室C5、洗脱剂室C4连通。
当切换阀VT1的阀芯处于初审的左侧工作位置P1时，第一进液口、第二出液口分别与第一工作口、第二工作口相通；当切换阀VT1的阀芯移动到的右侧工作位置P2时，第三进液口、第四出液口与第三工作口、第四工作口相通。
第一通道CH1上设置有防止液体从吸附及洗脱室C2向裂解室C1逆流的单向阀V1；第二通道CH2上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1和防止流体从废液室C3向吸附及洗脱室C2逆流的单向阀V2，且过滤器F1位于第二通道CH2与吸附及洗脱室C2的连接端；第三通道CH3上设置有防止液体从吸附及洗脱室C2向洗脱剂室C4逆流的单向阀V3；第四通道CH4上设置有阻止磁珠通过的过滤器F2和防止液体从荧光PCR室C5向吸附及洗脱室C2逆流的单向阀V4，且第二过滤器F2位于第四通道CH4与吸附及洗脱室C2的连接端。
废液室C3的顶端设置有维持腔体内压力平衡的单向通气阀V7，洗脱剂室C4的顶端设置有维持腔体内压力平衡的单向通气阀V8；洗脱剂室C4和荧光PCR室C5之间设置有连通管道，且该连通管道上设置有单向通气阀V5，用于维持荧光PCR室内部压力平衡。
本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，开封时（初始状态），切换阀VT1的阀芯位于左侧的起始位置 P1，此时，第一通道CH1和第二通道CH2均与吸附及洗脱室C2相通，第三通道CH3和第四通道CH4均与吸附及洗脱室C2截止；在进入洗脱步骤之前，设备拨动切换阀VT1的阀芯到右侧的另一个工作位置P2，此时，第一通道CH1和第二通道CH2均与吸附及洗脱室C2截止，第三通道CH3和第四通道CH4均与吸附及洗脱室C2相通。
本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，工作原理如下：
（1）联合试剂盒开封时，初始状态：包埋在联合试剂盒中的切换阀VT1的阀芯位于位置P1，此时包埋在联合试剂盒中的第一通道CH1和第二通道CH2开通（与吸附及洗脱室C2相通），第三通道CH3及第四通道CH4通道截止（与吸附及洗脱室C2不通）。吸附及洗脱室C2内的活塞PT，位于低位。裂解室C1中预存裂解液。吸附及洗脱室C2中预存有吸附核酸的磁珠。废液室C3是空的。洗脱剂室C4中预存洗脱液。荧光PCR室C5中预存PCR试剂。
（2）样品加入：从加样口A经包埋在联合试剂盒内的加样通道AH加入裂解室C1，加样通道AH上的单向阀V6，可以阻止样品逆流；
（3）完成样品加样后，即可把加样后的联合试剂盒插入快速PCR工作站等测试设备中，进行一站式的核酸提取及实时荧光PCR测试。联合试剂盒插入工作站的时候，工作站中的定位装置，对联合试剂盒进行自动定位夹紧，保证各个工作位定位精确。工作站的活塞驱动杆下压，连接吸附及洗脱室C2中的活塞杆BA。工作站中的切换阀换向拨杆，卡住联合试剂盒中的切换阀VT1的换向开关；
（4）样品进入裂解室C1后，与裂解室C1内的裂解液发生生化反应，工作站的超声波模组对裂解室C1中的液体进行搅拌，同时加热模组加热裂解室C1，以加快反应速度和保证反应的均匀性，裂解反应促使样品中生物细胞中的细胞核裂解，将包封在细胞核内的核酸物质释放到裂解液中；
（5）裂解步骤完成后，开始核酸吸附步骤，工作站中的活塞驱动杆通过活塞杆BA驱动吸附及洗脱室C2内的活塞PT提升，将裂解室C1中溶有样品细胞中的核酸的裂解液，经过第一通道CH1吸入预存了吸附磁珠的吸附及洗脱室C2中，这个过程中，预埋在试剂盒第二通道CH2中的单向阀V2，会阻止从废液室C3吸入液体/气体。裂解液进入吸附及洗脱室C2内后，在工作站中磁力搅拌模块和加热模块的辅助下，吸附及洗脱室C2中的磁珠与裂解液中的核酸充分结合，将核酸充分吸附在磁珠表面；
（6）在核酸充分吸附后，工作站通过活塞驱动杆驱动吸附及洗脱室C2中的活塞PT下压，将吸附及洗脱室C2中的残液经第二通道CH2排出到废液室C3中，此时，预埋在第一通道CH1中的单向阀V1，会阻止液体反流回裂解室C1，同时过滤器F1会拦住吸附了核酸的磁珠，将其滞留在吸附及洗脱室C2中，等待洗脱；
（7）工作站通过自动拨动预埋在试剂盒中的切换阀VT1的换向开关，将切换阀VT1的阀芯从左侧起始位置P1拨到右侧的另一个工作位置P2，将吸附及洗脱室C2与裂解室C1之间的连通通道以及吸附及洗脱室C2与废液室C3之间的连通通道切断（即第一通道CH1、第二通道CH2与吸附及洗脱室C2之间截止），同时将吸附及洗脱室C2与洗脱剂室C4之间的连通通道以及吸附及洗脱室C2与荧光PCR室C5之间的连通通道连通（即第三通道CH3、第四通道CH4与吸附及洗脱室C2相通）；
（8）工作站再次驱动吸附及洗脱室C2中的活塞PT提升，将预存在洗脱剂室C4中的洗脱液，经第三通道CH3吸入到吸附及洗脱室C2中，洗脱液与滞留在吸附及洗脱室C2中吸附了核酸的磁珠混合，此时预埋在第四通道CH4中的单向阀V4，会阻止从荧光PCR室C5吸取液体。洗脱液进入吸附及洗脱室C2中后，在工作站的磁力搅拌模块和加热模块作用下，洗脱液与磁珠充分混合，洗脱液将吸附在磁珠上的核酸洗脱下来，溶解在洗脱液中；
（9）工作站驱动吸附及洗脱室C2中的活塞PT下压，将吸附及洗脱室C2中溶解了核酸的洗脱液压入荧光PCR室C5，此时预埋在第三通道CH3中的单向阀V3，会阻止液体反流到洗脱剂室C4中，同时，被压入荧光PCR室C5（热板式PCR反应管）的核酸溶液，与预存在荧光PCR室C5中的PCR试剂混合，等待进行PCR反应及实时荧光检测。这一过程中，第二过滤器F2会阻止磁珠进入荧光PCR室C5，磁珠会滞留在封闭的吸附及洗脱室C2中，随试剂盒一起废弃；
（10）工作站中的恒温热板式快速实时荧光PCR模块开始工作，使荧光PCR室C5中的样品核酸与PCR试剂混合，进行PCR反应，同时荧光检测系统，对PCR反应过程的荧光变化，进行实时监测；
（11）实时荧光PCR检测完成之后，工作站的活塞驱动杆脱离与穿过吸附及洗脱室C2的活塞杆连接，工作站的换向拨杆脱离联合试剂盒，定位夹紧装置释放联合试剂盒，联合试剂盒可以被抽出PCR工作站等测试设备，所有的反应过程产物和最终产物都被封闭在用过的联合试剂盒中，随联合试剂盒一起废弃。
参见图3所示的另一种一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒。图3中，切换阀VT1上部从左到右分别有第一工作口、第二工作口，第一工作口、第二工作口均与吸附及洗脱室C2相通；第二工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1。当切换阀VT1的阀芯处于初审的左侧工作位置P1时，第一进液口、第二出液口分别与第一工作口、第二工作口相通；当切换阀VT1的阀芯移动到的右侧工作位置P2时，第三进液口、第四出液口与第一工作口、第二工作口相通。
图3与图2的主要区别在于：图3中的切换阀VT1只有第一工作口、第二工作口共两个工作口，而图2中的切换阀VT1有第一工作口、第二工作口、第三工作口、第四工作口共四个工作口；图3中，只有第二工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1，图2中，第二工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的过滤器F1，第四工作口与吸附及洗脱室C2相通的管路上设置有阻止磁珠通过的第二过滤器F2。
再请参阅图1，本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，可以采用四联试剂盒结构，一次性可以分析四组样品，大大提高工作效率。
本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR联合试剂盒，有广阔的应用市场，比如：
（1）危机疫情的检疫；
（2）常规病原体检测；
（3）兽医检疫；
（4）海关现场检疫；
（5）用于濒危动植物保护的物种检测；
（6）野外科考；
（7）环境保护检测；
（8）法医鉴定应用。
综上所述，本专利的一站式全自动封闭式核酸提取与实时荧光PCR测试联合试剂盒，可以保证整个核酸提取过程和实时荧光PCR检测过程，全部在全封闭的联合试剂盒内完成，在样品提取过程中和PCR测试过程中，没有任何被测样品，或者含有样品的气溶胶会溢出到联合试剂盒之外，避免传了统自动核酸提取流程中和PCR测试加样过程中，存在的气溶胶污染，导致的生物泄露和样品交叉污染风险。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本专利，而并非用作为对本专利的限定，只要在本专利的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本专利的权利要求书范围内。