阅读说明：本技术 一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤dna的提取方法 (Nucleic acid precipitation promoter and improved method for extracting circulating tumor DNA ) 是由 蒋国平 麻锦程 曾丽 贾俊玲 于 2020-05-18 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法,属于生物技术领域。本发明公开的核酸助沉剂,由Carrier RNA、Acryl Carrier、PolyA、糖原中的至少一种与醋酸钠组合而成。本发明公开的改良的循环肿瘤DNA的提取方法,通过在血浆样本中添加助沉剂,以提高样本中游离DNA的检测得率。本发明在提高样本中游离DNA提取得率的同时,提高了对肿瘤突变基因的检出率,有助于临床对肿瘤诊断的辅助作用。(The invention discloses a nucleic acid precipitation aid and an improved method for extracting circulating tumor DNA, and belongs to the technical field of biology. The invention discloses a nucleic acid precipitation aid, which is prepared by combining at least one of Carrier RNA, Acryl Carrier, polyA and glycogen with sodium acetate. The improved method for extracting the circulating tumor DNA disclosed by the invention has the advantage that the detection yield of free DNA in a sample is improved by adding the settling agent into a plasma sample. The invention improves the extraction yield of free DNA in a sample, improves the detection rate of tumor mutant genes and is beneficial to the clinical auxiliary effect on tumor diagnosis.)

一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法。

背景技术

循环肿瘤基因(ctDNA)，是一种无细胞状态的胞外DNA，来源于死亡肿瘤细胞的体细胞突变DNA片段，存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中，为游离DNA。它是一种具备广泛应用前景、高敏感性、高特异性的肿瘤标志物，在肿瘤的诊断、治疗及预后检测等方面发挥重要作用，可应用于肿瘤的液态活检，进行肿瘤的早期筛查诊断。而ctDNA的含量非常低，因此ctDNA的高效提取成为肿瘤液态活检技术的关键之一，提高ctDNA的提取率可以提高ctDNA突变的检出率，从而提高肿瘤早期筛查的准确率。

核酸分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。核酸的分离和纯化是关键步骤，核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。不同方法得到的核酸提取效果不一样。

对于游离DNA(cfDNA)的分离纯化方法主要为酚-氯仿法、硅胶膜吸附柱法和磁珠法。传统的酚-氯仿法提取效率低、重复性差，且有毒溶剂用量多，操作复杂，容易发生污染。硅胶膜吸附柱法是结合特定的缓冲溶液、精确的pH和盐浓度实现对核酸的吸附。该方法快速、核酸纯度高、重现性好，其主要缺点是对小片段核酸的提取效率较磁珠法低，且常用离液盐条件，对后续的盐分洗涤比较繁琐、冗长。柱提法还存在的一个严重的问题是高速离心造成的剪切力，容易降解DNA，影响DNA的完整性。目前市场上主要的硅胶膜吸附柱法提取游离核酸的产品是Qiagen公司的试剂盒，不但价格较昂贵，而且回收率仅约40％。磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。磁珠提取技术可用于多种样本的批量处理，是自动化、高通量的最佳选择之一，且操作简便，耗时短，但是市售的多数提取试剂盒对游离DNA的提取率不够高，不适合肿瘤循环DNA这样含量极低的游离DNA的提取，因此不能很好的在肿瘤液体活检技术中得到应用。

因此，提供一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法，对现有磁珠法提取游离DNA的方法进行改进，通过在样本中添加核酸助沉剂，以提高游离DNA的提取得率，对肿瘤循环DNA的提取具有很好的效果，可应用于肿瘤液体活检。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种核酸助沉剂，用于循环肿瘤DNA提取，由0.5-1.5μg/μlCarrierRNA、l-3μg/μlAcrylCarrier、1-5μg/μlPolyA、2-6μg/μl糖原中的至少一种与0.1-0.6mol/μl醋酸钠组合而成。

进一步，一种核酸助沉剂，由1.0μg/μlCarrierRNA、3μg/μl糖原和0.2mol/μl醋酸钠组合而成。

进一步，一种核酸助沉剂，由1.5μg/μlAcrylCarrier、4.0μg/μlPolyA和0.3mol/μl醋酸钠组合而成。

进一步，一种改良的循环肿瘤DNA的提取方法，具体步骤如下：

(1)分离血浆样本；

(2)向步骤(1)分离的血浆样本中加入所述的核酸助沉剂，再加入200μLProteinaseK，按照磁珠法游离DNA试剂盒进行游离DNA的提取；

(3)将步骤(2)提取到的游离DNA进行PCR检测。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种核酸助沉剂及改良的循环肿瘤DNA的提取方法，针对目前多数提取试剂盒对游离DNA的提取率不够高，不适合肿瘤循环DNA这样含量极低的游离DNA提取的情况，通过在血浆样本中添加助沉剂，以提高样本中游离DNA的检测得率，本发明方法对肿瘤循环DNA具有很好的提取效果。本发明在提高样本中游离DNA提取得率的同时，提高了对肿瘤突变基因的检出率，有助于临床对肿瘤诊断的辅助作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明荧光定量PCR验证结果；

其中，A：未添加核酸助沉剂；B：添加核酸助沉剂；

图2附图为本发明RNF43基因突变阳性的检出率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

磁珠法游离DNA试剂盒购自江苏默乐生物科技股份有限公司；糖原购自合肥四峰生物科技有限公司；polyA购自上海意杰生物科技有限公司。

实施例1血浆中cfDNA的提取

(1)分别取10例正常人群血液分离后的血浆样本2ml，分别分成两份，每份1ml，加入2mL离心管中；

(2)分别向每例的其中一份血浆样本中按配比(CarrierRNA1.0μg/μl，糖原3μg/μl，醋酸钠0.2mol/μl)加入核酸助沉剂，再加入200μLProteinaseK，每例血浆样本的两份血浆同时按照磁珠法游离DNA试剂盒进行游离DNA的提取。

(3)将提取到的游离DNA利用管家基因GAPDH进行荧光定量PCR验证，根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测结果(Ct值越小相当于起始模板量越高)，详细Ct值见图1。

由图1结果可见：在同等提取条件下，未添加助沉剂的血浆样本扩增的Ct值较大，说明样本中管家基因GAPDH的DNA片段较少，游离DNA的提取率较低；而添加了助沉剂的相同血浆样本qPCR扩增的Ct值较小，说明样本中管家基因的DNA片段数量明显增加，游离DNA的提取得率更高。通过管家基因的qPCR验证，可以判断添加了本发明的核酸助沉剂可明显提高血浆中游离DNA的提取得率。

实施例2RNF43基因突变的检测

RNF43基因编码的蛋白酶可参与致癌物如亚硝胺和苯比芘的代谢解毒作用，当基因发生突变后，编码的蛋白酶解毒能力下降，从而导致肝癌的发生率增加。同时，也有研究显示，RNF43基因第462位点突变可以明显增加吸烟人群患肝癌的风险。本发明通过检测RNF43基因的突变来验证添加助沉剂后的血浆样本对RNF43基因的突变检测的影响，具体步骤如下：

(1)用cfDNA采血管，分别采集20例肝癌患者抗凝血2-3mL，4小时内4℃离心10min，取上清至2mL离心管中，-20℃保存待用；

(2)分别取20例肝癌患者血液分离后的血浆样本2ml，并分成两份，每份1ml，加入2mL离心管中；

(3)分别向每例的一份血浆样本中按配比(AcrylCarrier1.5μg/μl，PolyA4.0μg/μl，醋酸钠0.3mol/μl)加入核酸助沉剂，再加入200μLProteinaseK，每例血浆样本的两份血浆同时按照磁珠法游离DNA试剂盒进行游离DNA的提取。

(4)将提取得到的游离DNA进行数字PCR，检测其中RNF43基因突变情况，并计算RNF43基因突变阳性的检出率，详细检测结果见图2。

由图2可见：在同等提取条件下，未添加助沉剂的血浆样本中，RNF43基因突变的检出率为60％，而添加本发明核酸助沉剂的相同血浆样本中，RNF43基因突变的检出率为80％。通过RNF43基因突变检出率的验证，可以判断本本发明核酸助沉剂的添加可以明显提高血浆ctDNA的提取效率，因而可明显提高肿瘤游离DNA中基因突变的检出率。

除了本发明中提到的肝癌突变基因RNF43的突变检测，还可以用于其他肿瘤基因的突变检测。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。